Visualización de la replicación del ADN mitocondrial en las células individuales de amplificación de la señal Edu

El objetivo general de este procedimiento es etiquetar y visualizar la replicación de M-T-D-N-A en neuronas cultivadas. Esto se logra incubando primero las neuronas con el análogo de timidina EDU durante dos a 24 horas. El segundo paso del procedimiento es etiquetar la EDU que contiene una alkin con la azida verde orgón fluorescente 4 88 a través de una reacción covalente catalizada por cobre.

El paso final del procedimiento es amplificar la señal verde orgón con el paso de amplificación de la señal de aramida para visualizar la EDU que se incorporó en el ADN MT recién sintetizado. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran la replicación del ADN MT en compartimentos subcelulares específicos de las neuronas a través de la combinación de la química clicka EDU y la posterior amplificación de la señal de la mente lagrimal. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como el marcaje BRDU, es que el marcaje de EDU es más fácil y suave, lo que permite una tinción inmunofluorescente adicional de los marcadores neuronales.

Este método puede responder a preguntas clave en la regulación del número de mitocondrias, como la forma en que las neuronas satisfacen las cargas de energía cambiantes en sus compartimentos subcelulares, incluidos los cuerpos celulares, los axones, las dendritas y el terminal sináptico. Por lo tanto, este método puede proporcionar información sobre los mecanismos subyacentes a la patogénesis de múltiples enfermedades neurológicas basadas en mitocondrias, incluidas la neuropatía y la neurodegeneración. Pero lo que es más importante, también se puede aplicar a otros sistemas en los que los cambios en la copia del ADN mitocondrial probablemente subyacen a la patogénesis del estado de la enfermedad, incluida la toxicidad de los medicamentos, el cáncer y el envejecimiento.

Este video demostrará cómo etiquetar el ADN mitocondrial recién sintetizado abreviado M-T-D-N-A en neuronas ganglionares de la raíz dorsal que se han cultivado en cubreobjetos de vidrio estériles de 12 milímetros. En una placa de cultivo de 24 pocillos, diluya el stock de 10 milimolares de cinco etanol dos doxy uridina, abreviado EDU del kit de ensayo de microplaca Clicka EDO de uno a 100 en medio de cultivo para un stock de 10 XEDU. A continuación, el caldo 10 XEDU se añade directamente al medio de cada pocillo, se incuban las neuronas tratadas durante dos a 24 horas a 37 grados centígrados y al 5% de dióxido de carbono en una campana extractora.

Fije las neuronas en aldehído de paraforma al 2% durante 10 a 15 minutos a temperatura ambiente. Lave dos veces en un XPBS durante dos a cinco minutos cada lavado. Las neuronas fijas pueden almacenarse en un XPBS fresco a cuatro grados centígrados durante un máximo de un mes.

Prepare una cámara húmeda como se describe en el texto adjunto. Utilice pinzas de punta fina para transferir 28 cubreobjetos fijos, incluidos los controles de EDU positivos y negativos, a láminas de paraforma M hidrófoba dentro de la cámara húmeda. Vuelva a aplicar de 200 a 300 microlitros de un XPBS para cubrir la superficie de cada cubreobjetos.

Prepare el kit de ensayo de clic como se describe en el texto y en las instrucciones del fabricante para etiquetar el ADN mitocondrial a 75 a 80 microlitros de una solución permeable que contenga 0,1% de tritton X en un XPBS para cada tapa, deslize, cubra e incube a temperatura ambiente durante 10 minutos. Utilice una pipeta de transferencia de bulbo con una punta de 200 microlitros fijada en el extremo. Para eliminar suavemente el líquido sin perder células.

Utilice una pipeta de bulbo para inundar suavemente la cubierta. Deslice con 200 a 300 microlitros de un XPBS para lavar a fondo la solución anterior. Lave cada cubreobjetos dos veces.

Pipetee de 75 a 80 microlitros de peróxido de hidrógeno fresco al 1% en un XPBS en cada cubreobjetos. Incubar tapado durante 30 minutos a temperatura ambiente para apagar la actividad de la peroxidasa endógena. Enjuague dos veces con un XPBS como antes, recién prepare el cóctel de clic en reacción como se detalla en el texto adjunto.

Cántalo hacia arriba y hacia abajo para mezclar. No posfije las neuronas con 75 a 80 microlitros de clic en el fijador EDU por cubreobjetos incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos. Durante la incubación postfija, diluir el cóctel de reacción con un volumen igual de fijador clicka EDU.

Agregue el cóctel de reacción a cada cubierta deslizante para protegerla de la luz e incubarla a temperatura ambiente durante 25 minutos. Retire suavemente el cóctel de reacción y lave dos veces con un tampón de bloqueo diluido bajo un microscopio epifluorescente. Compruebe si hay tinción de verde orgónico en los núcleos cuando se haya completado la tinción de EDU.

Comience la amplificación de la señal de termitas o TSA, agregue una solución de bloqueo de TSA al 1% a cada cubreobjetos e incube a temperatura ambiente durante 30 minutos. Centrifugar brevemente el stock de anticuerpos conjugados con peroxidasa de rábano verde antiuno, preparado de dos a 24 horas antes de la TSA, diluir el anticuerpo primario de uno a 300 en la solución de bloqueo de TSA e invertir o pipetear para mezclar el vórtice del nudo de sintonía. Agregue 75 microlitros a cada tapa, deslícela e incube a cuatro grados centígrados durante la noche.

Al día siguiente, enjuague tres veces con un XPBS a temperatura ambiente. Incube los cubreobjetos en el lavado final durante 30 a 60 minutos adicionales para asegurarse de que se elimine el anticuerpo primario no unido. Prepare la reacción IDE de acuerdo con la parte de texto de este protocolo inmediatamente antes de usar.

Incube los cubreobjetos con la reacción IDE durante 15 minutos a temperatura ambiente. Lavar tres veces con un XPBS incubando en el lavado final durante 30 a 60 minutos como antes bajo el microscopio. Compruebe si el marcaje del ADN MT monta neuronas teñidas con éxito en portaobjetos de vidrio con un medio de montaje ANTIFA que contiene DPI, aquí se muestran imágenes representativas de contraste de interferencia diferencial de neuronas ganglionares embrionarias y adultas de la raíz dorsal que se utilizan normalmente para el análisis.

Estos diagramas esquemáticos representan el procedimiento para etiquetar EDU en MTD NA con una señal fluorescente verde. Las células de neuroblastoma F 11 mitóticamente activas sirven como control positivo e ilustran el patrón de marcaje de EDU que se incorporó en el ADN nuclear y mitocondrial en estas imágenes de fluorescencia representativas superpuestas sobre campo claro. Las señales punteadas verdes muestran la señal EDU amplificada incorporada en M-D-D-N-A recién sintetizada de neuronas ganglionares de raíz dorsal embrionarias y adultas.

El procedimiento de marcaje EDU permite la posterior tinción inmunofluorescente de marcadores neuronales como el neurofilamento en rojo. Estos diagramas esquemáticos representan el procedimiento para etiquetar EDU y MTD NA con una señal fluorescente roja. Las células de neuroblastoma F 11 mitóticamente activas sirven como control positivo e ilustran el patrón de marcaje de EDU que se incorporó en el ADN nuclear y mitocondrial.

Este diagrama esquemático representa el procedimiento para etiquetar BRDU en M-T-D-N-A recién sintetizado con una señal fluorescente verde o roja. Al intentar este procedimiento, es importante recordar ejecutar controles con células mitóticamente activas para verificar el éxito del etiquetado de EDU y los núcleos celulares antes de continuar con los pasos de amplificación para visualizar el etiquetado de ADN MT Después de este procedimiento. Se pueden realizar otros métodos, como la inmunofluorescencia estándar, para responder a preguntas adicionales, como cómo se regula la síntesis de ADN mitocondrial en subpoblaciones específicas de neuronas o compartimentos neuronales. Debido a su desarrollo, esta técnica allanará el camino para que los investigadores en el campo de la neurobiología exploren la regulación del número mitocondrial en modelos de cultivo tanto de fisiología normal como en modelos de cultivo que simulan enfermedades deterioradas.

Estados neurológicos.