Name: Visualización de la replicación del ADN en el DT40 modelo de sistema de vertebrados que utilizan la técnica de fibra de ADN (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-27T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Aprende a visualizar la replicación del ADN a nivel de molécula única en células DT40 mediante técnicas de fibra de ADN con análogos halogenados. Este método permite analizar dinámicas de horquillas de replicación y detectar defectos en la síntesis del ADN.

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Se agradece al Dr. T. Helleday y el Dr. E. Petermann para ayudar con la técnica de fibra, así como los miembros del laboratorio útil para el debate. WN con el apoyo de una Beca de Investigación Internacional Senior de la Asociación para la Investigación Internacional del Cáncer y por el Comité de Estado polaco de Investigación Científica de subvención (165.935 N301).

El método descrito aquí se utilizó en la siguiente publicación: Schwab et al, EMBO J., 29 (4) :806-18 5.. 1. DT40 de cultivo celular Materiales: suero fetal bovino (FBS), suero de pollo, la penicilina / estreptomicina, 2-mercaptoetanol, RPMI <ol><li> Preparar el medio de cultivo celular: añadir el 7% de SFB, el 3% suero de pollo, la penicilina 1x / estreptomicina y 10 mM 2-mercaptoetanol al medio RPMI. </li><li> DT40 células se cultivan en frascos de cultivo celular estéril a 38 ° C y 5% de CO 2 en un incubador humidificado. Dividir celdas cada día a una densidad de 5 x 10 5 células / ml 6. </li></ol> 2. En vivo etiquetado Materiales: UDI, CldU <ol><li> Preparar soluciones madre de los análogos de nucleótidos: disolver UDI a 5 mm y CldU a 2,5 mm de media. Calentar las soluciones brevemente a 60 ° C y agitar hasta que el análogo de los nucleótidosUES se disuelven por completo. </li><li> Añadir UDI a una concentración final de 25 mM de crecimiento exponencial de las células DT40 y mezclar la suspensión celular también. Se incuban las células durante 20 minutos a 38 ° C y 5% CO 2. </li><li> Después de la incubación con la primera etiqueta, añada CldU a una concentración final de 250 M y el tratamiento de las células como se describe en el paso anterior. </li><li> Lavar las células con PBS enfriado con hielo y resuspender ellos en una concentración de 7,5 x 10 5 células / ml en PBS frío. Mantener las células marcadas en el hielo. </li></ol> El procedimiento de etiquetado descrito es sólo una sugerencia y puede ser modificado para responder a preguntas específicas. Por favor refiérase a la sección de discusión para obtener más información sobre el diseño experimental. 3. Lisis celular y el ADN difusión Materiales: láminas de vidrio, fibra de solución de lisis <ol><li> Prepare la solución de lisis de fibra: 50 mM EDTA y SDS al 0,5% en 200 mM Tris-HCl, pH 7,5 </li><lipunto l de la suspensi celular a un extremo vidrio. deje secar al aire durante minutos o hasta que el volumen ca se reduce considerablemente pero no secas.><li> Pipeta de solución de lisis 7 l en la parte superior de la suspensión celular y revuelva suavemente con la punta de la pipeta para mezclar las soluciones. Incubar durante 2 minutos para la lisis celular para continuar. </li><li> Inclinación de diapositivas a 15 ° para permitir que las fibras se extienden a lo largo de la diapositiva. </li><li> Una vez que la solución de fibra ha alcanzado la parte inferior de la diapositiva, coloque horizontalmente para secar al aire. Después del secado, una delgada línea, opaco debe ser visible a lo largo de la diapositiva. En este punto, el inicio de las fibras estiradas se debe marcar con un lápiz como después de la tinción de la línea no será visible por más tiempo. Esta marca posterior le ayudará a localizar las fibras en el microscopio. </li></lipunto></ol> 4. La tinción de inmunofluorescencia Materiales: metanol, ácido acético, ácido clorhídrico, 5% de BSA en PBS, jar manchas, anti-BrdU (ratón) de anticuerpos,anti-BrdU (ratón) de anticuerpos de oveja anti-ratón Cy3 anticuerpo de cabra anti-rat Alexa Fluor 488 anticuerpos, Vectashield medio de montaje, cubreobjetos, esmalte de uñas <ol><li> Sumerja los portaobjetos en metanol / ácido acético (3:1) en una cubeta y se incuba durante 10 minutos. </li><li> Lavar los portaobjetos en agua destilada H 2 O, y luego sumergirse en 2,5 M de HCl durante 80 minutos. </li><li> Lavar los portaobjetos tres veces en PBS durante 5 minutos. </li><li> Retirar los portaobjetos de la cubeta y recoger el exceso de PBS con una toalla de papel. Colocar los portaobjetos en sentido horizontal y BSA pipeta de 5% en la parte superior de cada diapositiva. Cubrir los portaobjetos suavemente con un cubreobjetos para difundir la BSA de manera uniforme sobre la diapositiva y se incuba durante 20 minutos. </li><li> Diluir los anticuerpos primarios en el 5% de BSA en las siguientes concentraciones: 1:25 anti-BrdU (ratón) y 1:400 anti-BrdU (rata). </li><li> Mover el cubre suavemente el portaobjetos de vidrio para eliminarlo. No aplicar la fuerza si la hoja de la cubierta se adhiere a la diapositiva. La diapositiva puede ser rehidratada en PBS hasta que el cubreobjetos se suelta unad se puede quitar con facilidad. Recoger BSA exceso con una toalla de papel y la desliza horizontalmente. Pipeta de 50 l de la solución de anticuerpo primario en cada diapositiva. Cubrir de nuevo con un cubreobjetos para difundir la solución de anticuerpos de manera uniforme sobre la diapositiva y se incuban en una cámara húmeda durante 2 horas. </li><li> Después de retirar el cubreobjetos, este lavado tres veces en PBS durante 5 minutos </li><li> Diluir los anticuerpos secundarios en el 5% de BSA en las siguientes concentraciones: 1:500 de oveja anti-ratón Cy3 y 1:400 de cabra anti-rat Alexa Fluor 488. </li><li> Aplique 50 l de la solución de anticuerpo secundario como se describe para los anticuerpos primarios. Proteger a las diapositivas de la luz y se incuba durante 1 hora. </li><li> Después de retirar el cubreobjetos, este lavado tres veces en PBS durante 5 minutos. </li><li> Agregar una gota de medio Vectashield montaje en cada diapositiva y colocar un cubreobjetos. Presione suavemente el cubreobjetos y eliminar el exceso de líquido alrededor de ella con una toalla de papel. Sello cubreobjetos con uñas transparente polish y déjelos secar. Tienda de las diapositivas a -20 ° C. </li></ol> 5. De adquisición de imágenes Materiales: cámara microscopio de fluorescencia, Ponga una gota de aceite de inmersión en un portaobjetos cerca de la marca del lápiz y empezar a localizar las fibras. Por lo general, hay un haz de fibras principales, pero estas fibras son demasiado enredado y no puede ser analizado más adelante. Aléjese del paquete principal para encontrar áreas en las que las fibras están claramente separados el uno del otro (Fig. 2). Queremos seleccionar las imágenes que sólo utiliza un canal de color con el fin de evitar el sesgo. Luego, tomaría aproximadamente 10 imágenes de cada línea de tiempo del punto, la concentración o celular. Sin embargo, el número de imágenes depende de muchas fibras se pueden contar en cada imagen. Se mueven a lo largo de la diapositiva para tomar las fotos diferentes, como un área de la diapositiva no puede proporcionar la longitud de fibra o de las estructuras representativas de replicación. 6. Análisis de datos Materiales: Imagen del programa de análisis, por ejemplo, ImageJ ( <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> ) Importar imágenes en un programa de análisis de imagen. Medir las longitudes de los tramos de fibra y / o el recuento de las estructuras de reproducción diferentes (Fig. 3). Sólo cuentan las fibras que son claramente visibles y que no se extienden sobre el borde de la imagen. Por lo general medir la longitud de alrededor de 100 fibras y el recuento de 150 a 200 estructuras de reproducción y que se repiten los experimentos individuales por lo menos tres veces. 7. Los resultados representativos: ADN recién replicado se puede visualizar como líneas de anticuerpos marcados con análogos de nucleótidos. En nuestros experimentos un tenedor en curso se representa como adyacentes señales rojas y verdes (Fig. 3). El protocolo de doble etiquetado también nos permite definir cuatro tipos principales de estructuras de repetición: 1) nuevos eventos de iniciación se puede divi ed los orígenes que han disparado mientras que las células se incubaron con la primera etiqueta y origen que se han disparado durante la incubación con la segunda etiqueta. Los primeros constan de vecinos verde-rojo-verde de señales y el último de una línea verde solamente. 2) eventos de terminación se manifiestan como al lado de color rojo-verde-rojo señales. 3) origen entremezclados son los sitios en el genoma de origen muy próximas entre sí. Tales sitios constan de orígenes consecutivos y señales de terminación. 4) en función del diseño experimental, se estancó / horquillas colapsado se puede definir como una señal en rojo sólo el 7 o una línea roja seguida de una zona verde de 8,9 a corto. Usando las condiciones descritas aquí, las células de tipo salvaje DT40 tienen una velocidad promedio de tenedor de 0,4 m / min. Podemos detectar aproximadamente el 63% se bifurca en curso, el origen del 10%, 16% de las horquillas se estancó (rojo vías únicamente), terminaciones 8% y 3% de fibras entremezcladas. La figura 1 "/&gt; . Figura 1 (A) El lado izquierdo de la caricatura representa el primer paso del procedimiento de marcaje de ADN: la adición de UDI de crecimiento exponencial de las células DT40 conduce el análogo de nucleótido que se incorpora fácilmente a la líder de nueva síntesis, y quedando las hebras de ADN. Esto puede ser visualizado mediante el uso de un anticuerpo específico, y aparecerá como una línea roja cuando se observa bajo el microscopio. Posteriormente, el mismo procedimiento se repite con CldU como se muestra en la parte derecha de la figura. Después de la incubación con el análogo de los nucleótidos en segundo lugar, un tenedor de activos será visible como un adjunto rojo-verde las vías. La longitud de fibra media es proporcional a la duración de la incubación de los análogos de nucleótidos. (B) de ADN de las células lisadas DT40 se estira por la gravedad sobre un portaobjetos de microscopio y los análogos de nucleótidos incorporados son visualizados por el uso de anticuerpos específicos y microscopía de fluorescencia. igura 2 "/&gt; Figura 2. Una imagen de fluorescencia muestra representativa de las fibras de tipo salvaje células DT40 posteriormente etiquetados con UDI y CldU durante 20 minutos cada uno. La mayoría de las fibras están bien separadas unas de otras y por lo tanto se puede analizar con facilidad. La barra blanca representa el 10 micras. <img src="/files/ftp_upload/3255/3255fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> . Figura 3 La técnica de fibra de doble etiquetado permite distinguir entre las estructuras de reproducción diferentes, 1 - horquillas de replicación activa, 2 - los nuevos sitios de replicación del ADN (lanzamiento de nuevos orígenes), 3 - terminaciones tenedor (dos tenedores de convergencia), 4 - fibras entremezcladas (lugares de orígenes muy próximas entre sí) y 5 - las horquillas se estancó (sólo señal de color rojo).

<ol><li>Caldwell, R. B., Fiedler, P., Schoetz, U., Buerstedde, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+function+analysis+using+the+chicken+B-cell+line+DT40%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Gene function analysis using the chicken B-cell line DT40.</a> Methods. Mol. Biol. 408, 193-210 (2007).</li>
<li>Petes, T. D., Williamson, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiber+autoradiography+of+replicating+yeast+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell.+Res%22%5BJournal%5D)">Fiber autoradiography of replicating yeast DNA.</a> Exp. Cell. Res. 95, 103-110 (1975).</li>
<li>Takeuchi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+frequency+of+initiation+sites+of+DNA+replication+in+Werner%27s+syndrome+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Genet%22%5BJournal%5D)">Altered frequency of initiation sites of DNA replication in Werner's syndrome cells.</a> Hum. Genet. 60, 365-368 (1982).</li>
<li>Jackson, D. A., Pombo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replicon+clusters+are+stable+units+of+chromosome+structure%3A+evidence+that+nuclear+organization+contributes+to+the+efficient+activation+and+propagation+of+S+phase+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Replicon clusters are stable units of chromosome structure: evidence that nuclear organization contributes to the efficient activation and propagation of S phase in human cells.</a> J. Cell. Biol. 140, 1285-1295 (1998).</li>
<li>Schwab, R. A., Blackford, A. N., Niedzwiedz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATR+activation+and+replication+fork+restart+are+defective+in+FANCM-deficient+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO.+J%22%5BJournal%5D)">ATR activation and replication fork restart are defective in FANCM-deficient cells.</a> EMBO. J. 29, 806-818 (2010).</li>
<li>Saribasak, H., Arakawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+cell+culture+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Subcell.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Basic cell culture conditions.</a> Subcell. Biochem. 40, 345-346 (2006).</li>
<li>Conti, C., Seiler, J. A., Pommier, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mammalian+DNA+replication+elongation+checkpoint%3A+implication+of+Chk1+and+relationship+with+origin+firing+as+determined+by+single+DNA+molecule+and+single+cell+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Cycle%22%5BJournal%5D)">The mammalian DNA replication elongation checkpoint: implication of Chk1 and relationship with origin firing as determined by single DNA molecule and single cell analyses.</a> Cell. Cycle. 6, 2760-2767 (2007).</li>
<li>Petermann, E., Orta, M. L., Issaeva, N., Schultz, N., Helleday, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroxyurea-stalled+replication+forks+become+progressively+inactivated+and+require+two+different+RAD51-mediated+pathways+for+restart+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Hydroxyurea-stalled replication forks become progressively inactivated and require two different RAD51-mediated pathways for restart and repair.</a> Mol. Cell. 37, 492-502 (2010).</li>
<li>Edmunds, C. E., Simpson, L. J., Sale, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCNA+ubiquitination+and+REV1+define+temporally+distinct+mechanisms+for+controlling+translesion+synthesis+in+the+avian+cell+line+DT40%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">PCNA ubiquitination and REV1 define temporally distinct mechanisms for controlling translesion synthesis in the avian cell line DT40.</a> Mol. Cell. 30, 519-529 (2008).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Se describe un método que permite el análisis cuantitativo de los parámetros que influyen en la síntesis de ADN durante la fase S en un nivel sola molécula. En los últimos diez años, las diferentes versiones de la técnica del ADN fluorografía fibra se han desarrollado para visualizar el movimiento de las horquillas de replicación individuales dentro de las células vivas. El parámetro crítico en todas estas técnicas es el procedimiento utilizado para obtener el mejor estiramiento de ADN en superficies de vidrio proporciona bien separadas las fibras de ADN. Un paso crucial para lograr esto es el tiempo de incubación de la suspensión de células en el portaobjetos de un microscopio, así como el tiempo de lisis. Estos parámetros dependen de la temperatura y el flujo de aire en un laboratorio particular y debe ser determinada empíricamente. La parte práctica de un experimento de fibra de ADN se realiza generalmente en un día. Sin embargo, la adquisición de imágenes y análisis posteriores es más tiempo y requiere práctica. El protocolo de etiquetado puede ser adApted para responder a diversos problemas científicos: el uso de un agente que interfiere con la replicación en el etiquetado segundo pulso monitores elongación tenedor / estancamiento en respuesta al estrés replicativo. En este escenario, la primera etiqueta no necesita ser lavado como el segundo de nucleótidos, se añade en exceso. Por otra parte, los fármacos que impiden la replicación se puede utilizar en combinación o sólo después de la adición de la primera etiqueta. Esto requiere de la primera etiqueta y la droga que se elimina antes de que el análogo de los nucleótidos segundo se aplica. Este procedimiento permite determinar la importancia de algunos factores de reparación del ADN en la estabilidad replicativa tenedor / recuperación en condiciones de estrés replicativo (tenedor es decir, estancamiento y / o colapso). Digno de mención, un análisis más detallado de los pormenores del programa de la replicación del ADN se podría realizar con el uso de una combinación de enfoques alternativos de ADN peinado y la fluorescencia de hibridación in situ. Esto, sin embargo, es técnicamente más difícil y requiere gastosequipos intensiva. La capacidad de analizar cualitativa y cuantitativamente los detalles de la replicación del ADN proporciona una herramienta esencial para la investigación de los defectos en la replicación del ADN en sí, así como las vías que suprimir la inestabilidad genómica asociada con las horquillas de replicación. Sin lugar a dudas, esta prueba también ayudará a arrojar luz sobre los mecanismos de replicación mediada por la reparación del ADN que permiten a las células normales de respuesta / adaptación a los cambios ambientales, así como la forma en las células cancerígenas utilizan estos mecanismos para resistir la toxicidad de los fármacos que se dirigen las horquillas de replicación.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios (opcional) </th></tr><tr><td> Fetal de oro de suero bovino (FBS) </td><td> PAA </td><td> A15-151 </td><td></td></tr><tr><td> Suero de pollo </td><td> Sigma </td><td> C5405 </td><td></td></tr><tr><td> Penicilina / estreptomicina </td><td> PAA </td><td> P11-010 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Gibco </td><td> 21875 </td><td></td></tr><tr><td> 5-yodo-2&#39;-desoxiuridina (UDI) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I7125 </td><td></td></tr><tr><td> 5-cloro-2&#39;-desoxi-uridina (CldU) </td><td> Sigma </td><td> C6891 </td><td></td></tr><tr><td> Portaobjetos SuperFrost </td><td> VWR </td><td> 631-0910 </td><td></td></tr><tr><td> Cubreobjetos No1 </td><td> Científicos del laboratorio suppplies </td><td> MIC3234 </td><td></td></tr><tr><td> Vectashield medio de montaje </td><td> H-1000 Vector Lab. </td><td> H-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Anticuerpo anti-BrdU (ratón) </td><td> BD Biosciences </td><td> 347580 </td><td></td></tr><tr><td> Anticuerpo anti-BrdU (rata) </td><td> Abcam </td><td> ab6326 </td><td></td></tr><tr><td> de oveja anti-ratón Cy3 </td><td> Sigma </td><td> C2181 </td><td></td></tr><tr><td> de cabra anti-rat Alexa Fluor 488 anticuerpos </td><td> Invitrogen </td><td> A110060 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

visualización de la replicación del adn en el dt40 modelo de sistema de vertebrados que utilizan la técnica de fibra de adn

Visualization of DNA Replication in the Vertebrate Model System DT40 using the DNA Fiber Technique

Mantenimiento de la estabilidad de replicación tenedor es de suma importancia para la división de las células para preservar la viabilidad y prevenir enfermedades. Los procesos involucrados no sólo garantizar la duplicación del genoma fieles en la cara del daño del ADN endógeno y exógeno, sino también prevenir la inestabilidad genómica, un factor causal reconocido en el desarrollo tumoral. A continuación, describimos un microscopio de fluorescencia basada en simple y rentable método para visualizar la replicación del ADN en las células B aviares línea DT40. Esta línea celular es una herramienta poderosa para investigar la función de proteínas in vivo mediante genética inversa en las células de vertebrados 1. Fluorografía ADN fibra en DT40 células que carecen de un gen específico permite dilucidar la función de este producto de genes en la replicación del ADN y la estabilidad del genoma. Los métodos tradicionales para analizar la dinámica de replicación tenedor en las células de vertebrados se basan en la medición de la tasa global de la síntesis de ADN en una población de células marcadas con pulso. Este es un enfoque cuantitativo y no permite un análisis cualitativo de los parámetros que influyen en la síntesis de ADN. En contraste, la tasa de movimiento de la horquilla activa se puede seguir directamente cuando se utiliza la técnica de fibra de ADN 4.2. En este enfoque, el ADN naciente está etiquetado en vivo por la incorporación de nucleótidos halogenados (Fig. 1A). Posteriormente, las fibras individuales se extienden en un portaobjetos de microscopio, y las vías de replicación de ADN marcado se tiñen con anticuerpos específicos y se visualizan por microscopía de fluorescencia (Fig. 1B). Iniciación de la replicación, así como la direccionalidad tenedor se determina por el uso consecutivo de dos análogos de diferente modificado. Además, el enfoque de doble etiquetado permite el análisis cuantitativo de los parámetros que influyen en la síntesis de ADN durante la fase S, es decir, la replicación de estructuras tales como tenedores en curso y se estancó, la densidad del origen de replicación, así como terminaciones tenedor. Por último, el procedimiento experimental se puede lograred en un día, y sólo requiere de equipos de laboratorio general y un microscopio de fluorescencia.

DT40, un sistema vertebrado modelo genético, proporciona una poderosa herramienta para analizar la función de proteínas. Aquí se describe un método sencillo que permite el análisis cualitativo de los parámetros que influyen en la síntesis de ADN durante la fase S en células DT40 en el nivel de moléculas individuales.

Visualización de la replicación del ADN en el DT40 modelo de sistema de vertebrados que utilizan la técnica de fibra de ADN

El mantenimiento de la estabilidad de la horquilla de replicación es de suma importancia para que las células en división preserven su viabilidad y prevengan enfermedades. Los procesos implicados no...

El objetivo general de este procedimiento es visualizar la replicación del ADN a nivel de molécula individual. Comience incorporando análogos de nucleótidos halogenados en el ADN recién sintetizado. En células vivas, localice las células con ADN marcado sobre un microscopio.Deslice entonces las células y extienda el ADN sobre la portaobjetos de microscopio. La posterior inmunotinción de fibras de ADN y el análisis de las imágenes de microscopía fluorescente pueden iluminar la dinámica global de las horquillas de replicación, permitiendo el análisis cuantitativo de los parámetros que influyen en el programa general de replicación. Durante los últimos años, se han desarrollado diferentes versiones de las técnicas de fibra de ADN Fluor para visualizar el movimiento de horquillas de replicación individuales dentro de células vivas.Este experimento in vivo en células DT 40 que está a punto de observar puede realizarse en un día y requiere únicamente equipo de laboratorio general y un microscopio fluorescente. La doctora Rebecca Schwab, posdoctoranda de mi laboratorio, demostrará el procedimiento. Para etiquetar células DT 40 in vivo, comience con un cultivo en crecimiento exponencial. Añada la etiqueta IDU hasta una concentración final de 25 micromolar y mezcle la suspensión celular.Incube bien las células durante 20 minutos a 38 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono. A continuación, agregue la etiqueta CLDU hasta una concentración final de 250 micromolar. Mezcle e incube la suspensión celular.Ahora lave las células DT 40 con PBS frío. Suspender los pellets celulares en PBS frío y mantener las células etiquetadas en hielo. Coloque dos microlitros de la suspensión celular en un extremo de la portaobjetos y deje secar al aire hasta que el volumen de la gota se reduzca considerablemente, pero sin que quede completamente seco.A continuación, agregue siete microlitros de solución de lisis de fibras sobre la suspensión celular y mezcle suavemente las soluciones agitando con la punta de una pipeta; incube durante dos minutos. A continuación, incline las laminillas a 15 grados para permitir que las fibras se extiendan a lo largo de la laminilla. Una vez que la solución de fibras haya alcanzado la parte inferior de la laminilla, colóquela en posición horizontal para que se seque al aire.En este momento, debería observarse una línea delgada opaca a lo largo del portaobjetos. Marque el inicio de las fibras estiradas con un lápiz. Primero sumerja los portaobjetos en una mezcla de metanol y ácido acético en una proporción de tres a uno durante 10 minutos.Lave las laminillas con agua destilada, luego sumérjalas en ácido clorhídrico 2,5 M durante 80 minutos. Lave las laminillas tres veces con PBS durante cinco minutos cada lavado. Retire el exceso de PBS con una toalla de papel.Luego, coloque las laminillas en posición horizontal. A continuación, agregue con pipeta PBS con BSA al 5% encima de cada laminilla y coloque un cubreobjetos; incube durante 20 minutos. Deslice suavemente el cubreobjetos a lo largo de la laminilla de vidrio.Elimine el exceso de BSA con una toalla de papel. Luego, pipete 50 microlitros de la solución del anticuerpo primario anti-BRDU sobre cada portaobjetos.Cubra un portaobjetos con una laminilla y incube en una cámara humidificada durante dos horas. Después de retirar las laminillas, lave los portaobjetos tres veces en PBS durante cinco minutos. Aplique 50 microlitros de la solución de anticuerpo secundario, coloque las laminillas y proteja también los portaobjetos de la luz.Luego, incubar durante una hora. Retire los cubreobjetos y lave las laminillas tres veces en PBS durante cinco minutos. Finalmente, agregue una gota de medio de montaje vector shield sobre cada laminilla.Presione suavemente sobre un cubreobjetos y retire el exceso de líquido alrededor. Con una toalla de papel, selle los cubreobjetos con esmalte transparente para uñas y deje secar al aire. Almacene los portaobjetos a menos 20 grados Celsius.Coloque una gota de aceite de inmersión sobre un portaobjetos cerca de la marca de lápiz e inicie la localización de las fibras. Aléjese del haz principal para encontrar áreas donde las fibras estén claramente separadas entre sí. En un experimento típico, seleccione imágenes utilizando únicamente un canal de color para evitar sesgos.Luego, tome aproximadamente 10 imágenes de cada muestra. Desplácese a lo largo del portaobjetos para tomar las diferentes imágenes, ya que un área del portaobjetos puede no proporcionar longitudes de fibra representativas ni estructuras de replicación. Importe las imágenes a un programa de análisis de imágenes.Mida las longitudes de los 100 tractos de fibras o cuente entre 150 y 200 estructuras de replicación diferentes. La técnica de marcado doble de fibras permite distinguir entre diferentes estructuras de replicación. El ADN recién replicado puede visualizarse como líneas de análogos de nucleótidos marcados con anticuerpos.Aquí, una horquilla en alargamiento continuo se representa como señales adyacentes roja y verde. Los nuevos eventos de iniciación pueden dividirse en orígenes que se han activado mientras las células fueron incubadas con la primera marca y orígenes que se activaron durante la incubación con la segunda marca. El primero consiste en señales verdes, rojas y verdes adyacentes, y el último en una línea verde únicamente.Los eventos de terminación se manifiestan como rojo adyacente a verde. Se observan señales rojas dispersas. Los orígenes consisten en señales consecutivas de origen y de terminación.Según el diseño experimental, las horquillas estancadas o colapsadas pueden definirse ya sea como una señal únicamente roja o como una línea roja seguida de un tramo verde corto. En este experimento, las células silvestres DT 40 tienen una velocidad media de horquilla de 0,4 micrones por minuto. Con 63 % de horquillas en curso, 10 % de orígenes, 16 % de horquillas estancadas, 8 % de terminaciones y 3 % de fibras intercaladas.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo visualizar y analizar la dinámica de las horquillas de replicación en células DT 40. Esto le proporcionará una herramienta esencial para investigar defectos en la replicación del ADN.

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Investigación

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Biología

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Describimos aquí un sistema que utiliza un bloque de proteínas in vivo reversible y específico del sitio para detener y colapsar las horquillas de replicación en Escherichia coli. El establecimiento del bloque de replicación se evalúa mediante microscopía de fluorescencia y se utiliza electroforesis en gel de agarosa en 2 dimensiones neutro-neutro para visualizar los intermedios de replicación.

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Este protocolo presenta una técnica para el mapeo de alta resolución de sitios de replicación en cromatina estructuralmente preservada in situ que emplea una combinación de etiquetado EdU-streptavidin-Nanogold preincrustante y ChromEMT.

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La metodología ayuda en el análisis de la variación en la dinámica de replicación del ADN en presencia de nanopartículas. Se pueden adoptar diferentes metodologías basadas en el nivel de citotoxicidad del material de interés. Además, se proporciona una descripción del análisis de imágenes para ayudar en el análisis de fibras de ADN.

Demostración del ensayo de fibra de ADN para investigar el daño del ADN y la dinámica de reparación inducida por nanopartículas

Este protocolo demuestra la realización de un ensayo de una sola molécula para la visualización en vivo del desenrollado del ADN por helicasa CMG. Describe (1) la preparación de un sustrato de ADN, (2) la purificación de la helicasa CMG de Drosophila melanogaster marcada con fluorescencia, (3) la preparación de una celda de flujo microfluídica para la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) y (4) el ensayo de desenrollado de ADN de una sola molécula.

Visualización en tiempo real de una sola molécula del desenrollado del ADN mediante CMG Helicase

Aquí, describimos el procedimiento para analizar la progresión de la replicación a través de repeticiones patógenas propensas a la estructura utilizando electroforesis en gel bidimensional.

Análisis electroforético de la replicación a través de repeticiones de ADN propensas a la estructura dentro del episoma humano basado en SV40

Este protocolo describe un ensayo de replicación de ADN de una sola molécula basado en microscopía de fluorescencia, que permite la visualización en tiempo real de las interacciones entre las ADN polimerasas y obstáculos como las estructuras G-cuádruples.

Visualización de fluorescencia de una sola molécula de la dinámica de la ADN polimerasa en G-Quadruplex

Aprende a visualizar la replicación del ADN a nivel de molécula única en células DT40 mediante técnicas de fibra de ADN con análogos halogenados. Este método permite analizar dinámicas de horquillas de replicación y detectar defectos en la síntesis del ADN.

Visualización de la replicación del ADN en el DT40 modelo de sistema de vertebrados que utilizan la técnica de fibra de ADN

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