Visualización de la replicación del ADN en el DT40 modelo de sistema de vertebrados que utilizan la técnica de fibra de ADN

El objetivo general de este procedimiento es visualizar la replicación del ADN a nivel de una sola molécula. Comience incorporando análogos de nucleótidos halogenados en el ADN recién sintetizado. En las células vivas, detecte las células con ADN marcado en un microscopio.

A continuación, se colocan las células y se estira el ADN en el portaobjetos del microscopio. La inmunotinción posterior de las fibras de ADN y el análisis de las imágenes de microscopía fluorescente pueden iluminar la dinámica de la horquilla de replicación global para permitir el análisis cuantitativo de los parámetros que influyen en el programa de replicación general. En los últimos años, se desarrollaron diferentes versiones de las técnicas de fluor de fibra de ADN para visualizar el movimiento de la horquilla de replicación individual dentro de las células vivas.

Este experimento in vivo en células DT 40 que está a punto de presenciar se puede completar en un día y solo requiere equipo de laboratorio general y un microscopio fluorescente que demuestre el procedimiento. Para etiquetar las células DT 40 in vivo, comience con un cultivo que crezca exponencialmente. Añadir la etiqueta IDU hasta una concentración final de 25 micromolares y mezclar la suspensión celular.

Incubar bien las células durante 20 minutos a 38 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. A continuación, añada la etiqueta CLDU hasta una concentración final de 250 micromolares. Mezclar e incubar la suspensión celular.

Ahora lave las celdas DT 40 con PBS reus helado. Suspenda los gránulos de celdas en PBS frío y mantenga las celdas marcadas en hielo. Coloque dos microlitros de la suspensión de celdas en un extremo del portaobjetos de vidrio y séquelos al aire hasta que el volumen de la gota se reduzca considerablemente, pero no esté completamente seco.

Ahora, agregue siete microlitros de solución de lisis de fibra encima de la suspensión celular y mezcle suavemente las soluciones agitando con la punta de una pipeta e incube durante dos minutos. A continuación, incline los portaobjetos a 15 grados para permitir que las fibras se extiendan a lo largo del portaobjetos. Una vez que la solución de fibra haya llegado al fondo del portaobjetos, colóquelo horizontalmente para que se seque al aire.

En este punto, una línea delgada y opaca debe ser visible a lo largo de la diapositiva. Marca el comienzo de las fibras estiradas con un lápiz. Primero sumerja los portaobjetos en metanol de tres a uno a ácido acético durante 10 minutos.

Lave los portaobjetos en agua destilada, luego sumérjalos en ácido clorhídrico 2.5 molar durante 80 minutos. Lave los portaobjetos tres veces en PBS durante cinco minutos. Recoja el exceso de PBS en una toalla de papel.

A continuación, oriente las diapositivas horizontalmente. Ahora pipetee 5%BSA en PBS en la parte superior de cada portaobjetos y coloque un cubreobjetos e incube durante 20 minutos. Mueva suavemente el portaobjetos de la cubierta por el portaobjetos de vidrio.

Retire el exceso de BSA con una toalla de papel. A continuación, pipetee 50 microlitros de la solución de anticuerpos primarios anti BRDU. En cada diapositiva.

Cubra un juego con un cubreobjetos e incube en una cámara humidificada durante dos horas. Después de quitar los cubreobjetos, lave los portaobjetos tres veces en PBS durante cinco minutos. Aplique 50 microlitros de los portaobjetos de la solución de anticuerpos secundarios y proteja también los portaobjetos de la luz.

A continuación, incubar durante una hora. Retire los portaobjetos y lave los portaobjetos tres veces en PBS durante cinco minutos. Finalmente, agregue una gota de medio de montaje de escudo vectorial en cada diapositiva.

Presione suavemente un cubreobjetos y elimine el exceso de líquido a su alrededor. Con una toalla de papel, selle los cubreobjetos con esmalte de uñas transparente y séquelos al aire. Guarde los portaobjetos a menos 20 grados centígrados.

Coloque una gota de aceite de inmersión en un portaobjetos cerca de la marca del lápiz y comience a ubicar las fibras. Aléjese del haz principal para encontrar áreas donde las fibras estén claramente separadas entre sí. En un experimento típico, seleccione imágenes usando solo un canal de color para evitar sesgos.

A continuación, tome aproximadamente 10 fotografías de cada muestra. Desplácese a lo largo del portaobjetos para tomar las diferentes imágenes, ya que es posible que un área de un portaobjetos no proporcione longitudes de fibra representativas o estructuras de replicación. Importar imágenes a un programa de análisis de imágenes.

Mida las longitudes de los 100 tractos de fibra y/o cuente de 150 a 200 estructuras de replicación diferentes. La técnica de fibra de doble etiquetado permite distinguir entre diferentes estructuras de replicación. El ADN recién replicado se puede visualizar como líneas de análogos de nucleótidos marcados con anticuerpos.

Aquí, una bifurcación alargada en curso se representa como señales rojas y verdes adyacentes. Los nuevos eventos de iniciación se pueden dividir en orígenes que se han disparado mientras las células se incubaban con la primera etiqueta y orígenes que se han disparado durante la incubación con la segunda etiqueta. El primero consta de señales verdes vecinas, señales verdes rojas y el segundo de una línea verde. Solamente.

Los eventos de terminación se manifiestan como adyacentes de color rojo verde. Señales rojas intercaladas. Los orígenes consisten en orígenes consecutivos y señales de terminación.

Dependiendo del diseño experimental, las bifurcaciones estancadas o colapsadas pueden definirse como una señal roja o una línea roja, seguida de un corto tramo verde. En este experimento, las celdas DT 40 de tipo salvaje tienen una velocidad media de horquilla de 0,4 micras por minuto. Con un 63% de horquillas en curso, un 10% de orígenes, un 16% de horquillas estancadas, un 8% de terminaciones y un 3% de fibras intercaladas.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo visualizar y analizar la dinámica de la bifurcación de replicación en celdas DT 40. Esto le proporcionará una herramienta esencial para investigar defectos en la replicación del ADN.