Visualización de la replicación del ADN en el DT40 modelo de sistema de vertebrados que utilizan la técnica de fibra de ADN

El objetivo general de este procedimiento es visualizar la replicación del ADN a nivel de molécula individual. Comience incorporando análogos de nucleótidos halogenados en el ADN recién sintetizado. En células vivas, localice las células con ADN marcado sobre un microscopio.

Deslice entonces las células y extienda el ADN sobre la portaobjetos de microscopio. La posterior inmunotinción de fibras de ADN y el análisis de las imágenes de microscopía fluorescente pueden iluminar la dinámica global de las horquillas de replicación, permitiendo el análisis cuantitativo de los parámetros que influyen en el programa general de replicación. Durante los últimos años, se han desarrollado diferentes versiones de las técnicas de fibra de ADN Fluor para visualizar el movimiento de horquillas de replicación individuales dentro de células vivas.

Este experimento in vivo en células DT 40 que está a punto de observar puede realizarse en un día y requiere únicamente equipo de laboratorio general y un microscopio fluorescente. La doctora Rebecca Schwab, posdoctoranda de mi laboratorio, demostrará el procedimiento. Para etiquetar células DT 40 in vivo, comience con un cultivo en crecimiento exponencial. Añada la etiqueta IDU hasta una concentración final de 25 micromolar y mezcle la suspensión celular.

Incube bien las células durante 20 minutos a 38 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono. A continuación, agregue la etiqueta CLDU hasta una concentración final de 250 micromolar. Mezcle e incube la suspensión celular.

Ahora lave las células DT 40 con PBS frío. Suspender los pellets celulares en PBS frío y mantener las células etiquetadas en hielo. Coloque dos microlitros de la suspensión celular en un extremo de la portaobjetos y deje secar al aire hasta que el volumen de la gota se reduzca considerablemente, pero sin que quede completamente seco.

A continuación, agregue siete microlitros de solución de lisis de fibras sobre la suspensión celular y mezcle suavemente las soluciones agitando con la punta de una pipeta; incube durante dos minutos. A continuación, incline las laminillas a 15 grados para permitir que las fibras se extiendan a lo largo de la laminilla. Una vez que la solución de fibras haya alcanzado la parte inferior de la laminilla, colóquela en posición horizontal para que se seque al aire.

En este momento, debería observarse una línea delgada opaca a lo largo del portaobjetos. Marque el inicio de las fibras estiradas con un lápiz. Primero sumerja los portaobjetos en una mezcla de metanol y ácido acético en una proporción de tres a uno durante 10 minutos.

Lave las laminillas con agua destilada, luego sumérjalas en ácido clorhídrico 2,5 M durante 80 minutos. Lave las laminillas tres veces con PBS durante cinco minutos cada lavado. Retire el exceso de PBS con una toalla de papel.

Luego, coloque las laminillas en posición horizontal. A continuación, agregue con pipeta PBS con BSA al 5% encima de cada laminilla y coloque un cubreobjetos; incube durante 20 minutos. Deslice suavemente el cubreobjetos a lo largo de la laminilla de vidrio.

Elimine el exceso de BSA con una toalla de papel. Luego, pipete 50 microlitros de la solución del anticuerpo primario anti-BRDU sobre cada portaobjetos.

Cubra un portaobjetos con una laminilla y incube en una cámara humidificada durante dos horas. Después de retirar las laminillas, lave los portaobjetos tres veces en PBS durante cinco minutos. Aplique 50 microlitros de la solución de anticuerpo secundario, coloque las laminillas y proteja también los portaobjetos de la luz.

Luego, incubar durante una hora. Retire los cubreobjetos y lave las laminillas tres veces en PBS durante cinco minutos. Finalmente, agregue una gota de medio de montaje vector shield sobre cada laminilla.

Presione suavemente sobre un cubreobjetos y retire el exceso de líquido alrededor. Con una toalla de papel, selle los cubreobjetos con esmalte transparente para uñas y deje secar al aire. Almacene los portaobjetos a menos 20 grados Celsius.

Coloque una gota de aceite de inmersión sobre un portaobjetos cerca de la marca de lápiz e inicie la localización de las fibras. Aléjese del haz principal para encontrar áreas donde las fibras estén claramente separadas entre sí. En un experimento típico, seleccione imágenes utilizando únicamente un canal de color para evitar sesgos.

Luego, tome aproximadamente 10 imágenes de cada muestra. Desplácese a lo largo del portaobjetos para tomar las diferentes imágenes, ya que un área del portaobjetos puede no proporcionar longitudes de fibra representativas ni estructuras de replicación. Importe las imágenes a un programa de análisis de imágenes.

Mida las longitudes de los 100 tractos de fibras o cuente entre 150 y 200 estructuras de replicación diferentes. La técnica de marcado doble de fibras permite distinguir entre diferentes estructuras de replicación. El ADN recién replicado puede visualizarse como líneas de análogos de nucleótidos marcados con anticuerpos.

Aquí, una horquilla en alargamiento continuo se representa como señales adyacentes roja y verde. Los nuevos eventos de iniciación pueden dividirse en orígenes que se han activado mientras las células fueron incubadas con la primera marca y orígenes que se activaron durante la incubación con la segunda marca. El primero consiste en señales verdes, rojas y verdes adyacentes, y el último en una línea verde únicamente.

Los eventos de terminación se manifiestan como rojo adyacente a verde. Se observan señales rojas dispersas. Los orígenes consisten en señales consecutivas de origen y de terminación.

Según el diseño experimental, las horquillas estancadas o colapsadas pueden definirse ya sea como una señal únicamente roja o como una línea roja seguida de un tramo verde corto. En este experimento, las células silvestres DT 40 tienen una velocidad media de horquilla de 0,4 micrones por minuto. Con 63 % de horquillas en curso, 10 % de orígenes, 16 % de horquillas estancadas, 8 % de terminaciones y 3 % de fibras intercaladas.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo visualizar y analizar la dinámica de las horquillas de replicación en células DT 40. Esto le proporcionará una herramienta esencial para investigar defectos en la replicación del ADN.