Detección de desmontaje de biofilm mediante un ensayo de dispersión

Comience con una placa de varios pocillos que contenga una biopelícula bacteriana, bacterias encapsuladas dentro de la sustancia polimérica extracelular protectora o EPS.

Aspirar el medio para eliminar las bacterias no adherentes y lavar.

Trate los pocillos que contienen biopelículas con tampón solo, tampón con glucosa, tampón con sales biliares o tampón con glucosa y sales biliares.

Los tratamientos con tampón y glucosa favorecen la liberación de enzimas bacterianas que degradan el EPS del biofilm.

Esto da como resultado el desmontaje de la biopelícula, liberando las bacterias.

Mientras que las sales biliares y una combinación de sales biliares y tratamientos con glucosa imitan las condiciones de estrés y retienen las bacterias dentro del EPS protector.

Transfiera el sobrenadante de cada pocillo a una placa nueva de varios pocillos.

Detectar sobrenadantes diluidos en placas de agar e incubar.

Enumere las colonias bacterianas y determine la dispersión bacteriana para cada tratamiento.

Una mayor dispersión con tratamientos de tampón y glucosa en comparación con los tratamientos de sales biliares indica el desmontaje de la biopelícula.

Registre los valores de OD₆₀₀ de la placa de biopelícula nocturna en el lector de placas ajustando el control bien y en blanco. A continuación, aspire el medio de cultivo utilizando una línea de vacío sin molestar a la población adherente en la superficie de plástico. Lave suavemente los pocillos dos veces con 200 microlitros de PBS estéril.

Después de lavar con PBS a 130 microlitros del PBS precalentado, PBS con glucosa, PBS con sales biliares y PBS con sales biliares y glucosa a cada uno de los tres pocillos. Luego incube la placa a 37 grados centígrados durante 30 minutos. Después de 30 minutos, retire la placa de la incubadora. Pipetea el sobrenadante en una placa fresca estéril de 96 pocillos.

Finalmente, prepare de 1 a 10 diluciones seriadas del sobrenadante con PBS en la placa de 96 pocillos o en un bloque de dilución. A continuación, utilice una pipeta multicanal para transferir 5 microlitros de cada dilución en placas de agar LB. Incube las placas a 37 grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, cuenta el número de colonias.