Induciendo un bloqueo de replicación de sitios en específico E. coli El uso de un sistema fluorescente represor operador

El objetivo general de este experimento es detener una horquilla de replicación en un bloque de nucleoproteínas y observar las estructuras del ADN en el sitio del bloque con el fin de estudiar las vías de reparación del ADN. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre la replicación y reparación del ADN, como cómo se procesa el ADN cuando el aparato de replicación de la célula encuentra un obstáculo proteico. La principal ventaja de esta técnica es que podemos detener de forma reversible una horquilla de replicación en un lugar específico del cromosoma en toda una población de células vivas.

Los siguientes miembros de mi laboratorio, la Dra. Karla Mettrick, y la estudiante de posgrado, Georgia Weaver y Tayla-Ann Corocher, demostrarán este procedimiento. Para este procedimiento se utiliza una cepa de E. coli que transporta una matriz operadora de tetraciclina en el plásmido pKM1. pKM1 codifica para TetR-YFP, una proteína represora de tetraciclina marcada con proteína fluorescente amarilla inducible.

Diluir un cultivo fresco durante la noche de esta cepa de E. coli a una densidad óptica de 600 nanómetros de 0,01 en un medio complejo diluido con antibióticos según sea necesario para la selección. Cultive el cultivo a 30 grados centígrados con agitación a una densidad óptica a 600 nanómetros de 0,05 a 0,1. Retire una muestra de 10 mililitros para que sirva como control no inducido.

Agregue 0.01% de arabinosa al cultivo restante para inducir la producción de TetR-YFP a partir de pKM1. Continúe cultivando tanto los cultivos no inducidos como los inducidos a 30 grados centígrados con agitación. Después de una hora, compruebe la presencia de un único punto focal dentro de cada célula del cultivo inducido mediante microscopía de fluorescencia.

Si se confirma que las células inducidas están bloqueadas, lo que indica que más del 70% de las células tienen un solo foco, se registra la densidad óptica y se extraen 7,5 mililitros de la muestra para su análisis mediante electroforesis bidimensional en gel. Extraiga una muestra equivalente del cultivo de control no inducido. Antes de la microscopía de fluorescencia, prepare las almohadillas de agarosa para evitar el movimiento de las células durante la visualización.

Para cada almohadilla de agarosa, pipetee 500 microlitros de agarosa fundida en un portaobjetos de microscopio y superponga el cubreobjetos inmediatamente antes de que la agarosa se solidifique. Guarde los portaobjetos entre pañuelos húmedos a cuatro grados centígrados hasta que los necesite. Cuando llegue el momento de revisar las células, retire el cubreobjetos de la almohadilla de agarosa y pipetee 10 microlitros de cultivo bacteriano en el centro de la almohadilla.

Después de aproximadamente cinco minutos, cuando la almohadilla de agarosa se haya secado, vuelva a colocar el cubreobjetos. Coloque una gota de aceite de inmersión en el cubreobjetos y coloque el portaobjetos debajo de la óptica. Visualice las células mediante microscopía de fase con un aumento de 100x.

En el cuadro de diálogo Adquirir del software de imágenes, establezca Tiempo de exposición en 100 milisegundos. Seleccione Adquirir para capturar la imagen. No mueva el escenario.

En el cuadro de diálogo Adquirido, seleccione YFP como iluminación para el obturador externo vinculado a la cámara. Establezca el tiempo de exposición en 1.000 milisegundos. Apague la luz del escenario y seleccione Adquirir para capturar la imagen de fluorescencia.

Para comenzar este procedimiento, agregue azida de sodio a las muestras de cultivo recolectadas previamente hasta una concentración final de 0.1% e incube en hielo durante al menos cinco minutos. Centrifugar las células a 5.000 veces g durante diez minutos. Deseche el sobrenadante.

Vuelva a suspender cada gránulo de célula en 200 microlitros de tampón PIV y transfiera las células a un tubo de microfuga. Microcentrífuga para pellet las células y desechar el sobrenadante. Trate un portaobjetos de microscopio con 40 microlitros de una solución de vidrio repelente al agua o de silicona adecuada.

Frote el portaobjetos con un pañuelo de papel hasta que esté seco. Resuspender las células con la densidad celular más baja en 50 microlitros de PIV y colocar a 50 grados centígrados en un bloque de calor. Para todas las demás muestras, ajuste los volúmenes de PIV para que la densidad celular final sea la misma en cada tubo.

Añadir a las muestras un volumen igual de solución de agarosa al 0,8% recién preparada en PIV. Mantenga las muestras en el bloque de calor para asegurarse de que estén por encima de los 50 grados centígrados para evitar la solidificación. Coloque 20 gotas de microlitros de la suspensión de célula de agarosa en el portaobjetos tratado para producir tapones que sean hemisféricos.

Cuando los tapones se hayan solidificado, deslice suavemente todos los tapones de una muestra en un solo tubo de microfuga y agregue un mililitro de tampón de lisis celular. Incubar a 37 grados centígrados durante dos horas. Después de dos horas, retire el tampón de lisis celular y agregue 1 mililitro de solución de EDTA-Sarkosil-Proteinasa K o ESP.

Incubar a 50 grados centígrados durante la noche o hasta que los tapones estén transparentes. Una vez que los tapones estén transparentes, retire el tampón ESP y transfiera los tapones a un tubo de 15 mililitros. Agregue 12 mililitros de tampón TE y deje reposar durante 30 minutos.

Lave los tapones un total de cinco veces con tampón TE. Guarde los tapones a cuatro grados centígrados en un mililitro de tampón TE. Para analizar los intermediarios de replicación, el ADN en los tapones de agarosa se digiere con una enzima de restricción apropiada para la región de interés.

En este ejemplo, EcoRV corta el ADN inmediatamente antes de la matriz, dentro de la matriz, y después de la matriz, para dar fragmentos de 5,5 kb y 6,7 kb en la región de interés. Para comenzar este procedimiento, transfiera un tapón de agarosa a un tubo de microfuga nuevo y agregue 150 microlitros de tampón de enzima de restricción. Agregue de 25 a 100 unidades de enzima de restricción y digiera a 37 grados centígrados durante seis a ocho horas.

Prepare un gel de agarosa al 0,4% a cuatro grados centígrados. Vierta 300 mililitros de agarosa fundida en una bandeja de gel de aproximadamente 25 por 25 centímetros. Inserte un peine para hacer los pozos aproximadamente del mismo ancho que el diámetro del tapón.

Cuando el gel esté listo, retire el peine y mueva el gel a temperatura ambiente. Usando un circuito de inoculación, deslice uno de los tapones de agarosa digeridos en un pocillo, colocando el lado plano del tapón contra el lado del pocillo donde el ADN ingresará al gel. Inserte un solo tapón de la misma manera en cada segundo pocillo.

Pipetear la agarosa fundida al 0,4% en los pocillos para sellar los tapones en su posición. Cargue una escalera de ADN de un kb en un pocillo vacío, dejando un espacio entre la escalera y las muestras. Ejecute el gel durante la noche en 1xTBE a temperatura ambiente.

Al día siguiente, tiñir el gel en un baño de agua que contenga 0,3 microgramos por mililitro de bromuro de etidio durante 20 minutos. Visualice el ADN con un transiluminador UV de onda larga y corte cada fragmento de carril con un corte recto y uniforme, minimizando la inclusión de exceso de agarosa a ambos lados del carril. Coloque el carril de gel extirpado en una bandeja de gel a 90 grados en la dirección de la migración del ADN.

El siguiente paso es preparar 300 mililitros de agarosa para el gel de segunda dimensión. Cuando la agarosa se enfríe a 50 grados centígrados, pipetee la agarosa fundida alrededor de las rodajas de gel para solidificar su posición. Vierta la agarosa restante en la bandeja a una profundidad que esté al menos al nivel de las rodajas de gel.

Una vez que el gel se solidifica, electroforesarlo en 1xTBE que contenga 0,3 microgramos por mililitro de bromuro de etidio a cuatro grados centígrados hasta que el ADN haya migrado aproximadamente 10 centímetros. Extirpe los bloques donde está presente el ADN genómico, incluido el gel que se encuentra encima, para incluir el ADN que no es visible. El ADN dentro del gel se visualiza posteriormente por hibridación del sur, como se describe en el protocolo de texto.

En este sistema, un bloque de replicación fue confirmado por una mayoría de celdas que contenían un foco correspondiente a una copia de la matriz dentro de la celda. La adición de anhidrotetraciclina revirtió el bloqueo y la posterior duplicación de la matriz se visualizó como la acumulación de células con múltiples focos. Las células con replicación bloqueada también mostraron inhibición del crecimiento que se revirtió con el crecimiento posterior en presencia de anhidrotetraciclina.

Para analizar los intermediarios de replicación, se electroforezó el ADN en la primera dimensión. A continuación, se extirpó el ADN de interés y una electroforesis de segunda dimensión dio como resultado una diagonal de ADN lineal. La hibridación sur del ADN de la matriz reveló dos puntos en la muestra no bloqueada que corresponden a los fragmentos esperados de 5,5 kb y 6,7 kb de la matriz.

La muestra bloqueada mostró una disminución en el punto de 5,5 kb y la adición de una señal elíptica que indica una acumulación de ADN en forma de Y. La adición de anhidrotetraciclina eliminó la señal de ADN en forma de Y. Otro intermediario común es la unión de Holliday visualizada como una señal de cono en la parte superior del arco Y y un pico del ADN lineal al final del arco Y.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en ocho días si se realiza correctamente. Si bien se trata de un procedimiento 2D, es importante recordar que la calidad de los tapones de ADN es fundamental para la visualización óptima de las estructuras de ADN.