Induciendo un bloqueo de replicación de sitios en específico

El objetivo general de este experimento es detener una horquilla de replicación en un bloque nucleoproteico y observar las estructuras de ADN en el sitio del bloque para estudiar las vías de reparación del ADN. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre la replicación y reparación del ADN, como la forma en que se procesa el ADN cuando el aparato de replicación de la célula encuentra un obstáculo proteico. La principal ventaja de esta técnica es que podemos detener reversiblemente una horquilla de replicación en una ubicación específica del cromosoma en toda una población de células vivas.

Los siguientes miembros de mi laboratorio demostrarán este procedimiento: la Dra. Karla Mettrick, la estudiante de posgrado Georgia Weaver y Tayla-Ann Corocher. Para este procedimiento se utiliza una cepa de E.coli que porta un arreglo operador de tetraciclina en el plásmido pKM1. El plásmido pKM1 codifica para TetR-YFP, una proteína represora de tetraciclina marcada con proteína fluorescente amarilla inducible.

Diluya un cultivo fresco de esta cepa de E.coli, incubado durante la noche, hasta una densidad óptica a 600 nanómetros de 0,01 en un medio complejo diluido con antibióticos según sea necesario para la selección. Incube el cultivo a 30 grados Celsius con agitación hasta alcanzar una densidad óptica a 600 nanómetros de 0,05 a 0,1. Retire una muestra de 10 mililitros para utilizarla como control no inducido.

Añada arabinosa al 0,01 % a la cultura restante para inducir la producción de TetR-YFP a partir de pKM1. Continúe cultivando tanto las culturas no inducidas como las inducidas a 30 grados Celsius con agitación. Después de una hora, verifique la presencia de un único punto focal dentro de cada célula de la cultura inducida mediante microscopía de fluorescencia.

Si se confirma que las células inducidas están bloqueadas, indicado por más del 70 % de las células con un solo foco, registre la densidad óptica y retire 7,5 mililitros de la muestra para su análisis mediante electroforesis en gel bidimensional. Retire una muestra equivalente del cultivo control no inducido. Antes de la microscopía de fluorescencia, prepare las placas de agarosa para evitar el movimiento de las células durante la visualización.

Para cada almohadilla de agarosa, pipetee 500 microlitros de agarosa fundida sobre un portaobjetos y coloque inmediatamente la cubeta antes de que la agarosa se solidifique. Almacene los portaobjetos entre tejidos húmedos a cuatro grados centígrados hasta que sean necesarios. Cuando sea momento de observar las células, retire la cubeta de la almohadilla de agarosa y pipetee 10 microlitros de cultivo bacteriano en el centro de la almohadilla.

Después de aproximadamente cinco minutos, cuando la almohadilla de agarosa esté seca, reemplace el cubreobjetos. Coloque una gota de aceite de inmersión sobre el cubreobjetos y coloque la preparación bajo la óptica. Visualice las células utilizando microscopía de contraste de fase con un aumento de 100x.

En el cuadro de diálogo Adquirir del software de imagen, ajuste el Tiempo de exposición a 100 milisegundos. Seleccione Adquirir para capturar la imagen. No mueva la platina.

En el cuadro de diálogo Adquirido, seleccione YFP como la iluminación para el obturador externo vinculado a la cámara. Establezca el Tiempo de exposición en 1.000 milisegundos. Apague la luz del escenario y seleccione Adquirir para capturar la imagen de fluorescencia.

Para comenzar este procedimiento, agregue azida sódica a las muestras de cultivo previamente recolectadas hasta una concentración final de 0,1 % e incube en hielo durante al menos cinco minutos. Centrifugue las células a 5 000 ×g durante diez minutos. Deseche el sobrenadante.

Re_suspenda cada pellet celular en 200 microlitros de tampón PIV y transfiera las células a un tubo de microcentrífuga. Microcentrifugue para formar el pellet celular y deseche el sobrenadante. Trate un portaobjetos con 40 microlitros de una solución adecuada repelente al agua para vidrio o una solución de silicona.

Frote el portaobjetos con un tejido hasta que esté seco. Re_suspenda las células con la menor densidad celular en 50 microlitros de PIV y coloque en un bloque térmico a 50 grados centígrados. Para todas las demás muestras, ajuste los volúmenes de PIV de modo que la densidad celular final sea la misma en cada tubo.

Agregue un volumen igual de solución recién preparada de agarosa al 0,8 % en PIV a las muestras. Mantenga las muestras en el bloque térmico para asegurar que permanezcan por encima de 50 grados centígrados y evitar la solidificación. Coloque gotas de 20 microlitros de la suspensión de células en agarosa sobre el portaobjetos tratado para producir tapones con forma hemisférica.

Una vez que los tapones hayan solidificado, deslice suavemente todos los tapones de una muestra hacia un tubo microcentrífugo individual y agregue un mililitro de tampón de lisis celular. Incube a 37 grados celsius durante dos horas. Después de dos horas, retire el tampón de lisis celular y agregue 1 mililitro de solución de EDTA-Sarkosyl-Proteasa K o solución ESP.

Incubar a 50 grados Celsius durante la noche o hasta que los tapones sean transparentes. Una vez que los tapones sean transparentes, retire el tampón ESP y transfiera los tapones a un tubo de 15 mililitros. Añada 12 mililitros de tampón TE y deje en reposo durante 30 minutos.

Lave los tapones un total de cinco veces con tampón TE. Almacene los tapones a cuatro grados centígrados en un mililitro de tampón TE. Para analizar los intermediarios de replicación, el ADN en los tapones de agarosa se digiere con una enzima de restricción adecuada para la región de interés.

En este ejemplo, EcoRV corta el ADN inmediatamente antes del arreglo, dentro del arreglo y después del arreglo, produciendo fragmentos de 5,5 kb y 6,7 kb en la región de interés. Para comenzar este procedimiento, transfiera un tapón de agarosa a un tubo microcentrífugo nuevo y agregue 150 microlitros de tampón para enzima de restricción. Añada de 25 a 100 unidades de enzima de restricción y realice la digestión a 37 grados celsius durante seis a ocho horas.

Prepare un gel de agarosa al 0,4 % a cuatro grados Celsius. Vierta 300 mililitros de agarosa fundida en una bandeja de gel de aproximadamente 25 por 25 centímetros. Inserte un peine para hacer los pozos con un ancho aproximado igual al diámetro del tapón.

Una vez que el gel haya solidificado, retire el peine y traslade el gel a temperatura ambiente. Utilizando un asa de inoculación, deslice uno de los tapones de agarosa digeridos dentro de un pocillo, colocando el lado plano del tapón contra el costado del pocillo por donde el ADN entrará en el gel. Inserte un tapón individual de la misma manera en cada segundo pocillo.

Pipetee agarosa fundida al 0,4 % en los pocillos para sellar los tapones en su posición. Cargue una escalera de ADN de un kb en un pocillo vacío, dejando un espacio entre la escalera y las muestras. Corra el gel durante la noche en TBE 1x a temperatura ambiente.

Al día siguiente, tiña el gel en un baño acuoso que contenga 0,3 microgramos por mililitro de bromuro de etidio durante 20 minutos. Visualice el ADN mediante un transiluminador de luz ultravioleta de onda larga y corte cada fragmento de carril con un corte recto y uniforme, minimizando la inclusión de agarosa excesiva a ambos lados del carril. Coloque el carril de gel recortado en una bandeja de gel a 90 grados respecto a la dirección de migración del ADN.

El siguiente paso consiste en preparar 300 mililitros de agarosa para el gel de la segunda dimensión. Cuando la agarosa se enfríe a 50 grados celsius, pipetee la agarosa fundida alrededor de los fragmentos de gel para solidificar su posición. Vierta la agarosa restante en la bandeja hasta alcanzar una profundidad que esté al menos al mismo nivel que los fragmentos de gel.

Una vez que el gel se haya solidificado, realice la electroforesis en TBE 1x que contenga 0,3 microgramos por mililitro de bromuro de etidio a cuatro grados centígrados hasta que el ADN haya migrado aproximadamente 10 centímetros. Corte los bloques donde esté presente el ADN genómico, incluyendo el gel por encima, para incluir el ADN que no es visible. Posteriormente, el ADN dentro del gel se visualiza mediante hibridación Southern, como se describe en el protocolo del texto.

En este sistema, se confirmó un bloqueo de la replicación por la presencia mayoritaria de células que contenían un foco, correspondiente a una copia del arreglo dentro de la célula. La adición de anhidrotetraciclina revirtió el bloqueo, y la posterior duplicación del arreglo se visualizó como la acumulación de células con múltiples focos. Las células con replicación bloqueada también mostraron inhibición del crecimiento, que se revirtió mediante el crecimiento posterior en presencia de anhidrotetraciclina.

Para analizar los intermediarios de replicación, el ADN se sometió a electroforesis en la primera dimensión. Luego, se cortó el ADN de interés y una electroforesis en segunda dimensión dio como resultado una diagonal de ADN lineal. La hibridación Southern del ADN del arreglo reveló dos puntos en la muestra no bloqueada, correspondientes a los fragmentos esperados de 5,5 kb y 6,7 kb del arreglo.

La muestra bloqueada mostró una disminución en la mancha de 5,5 kb y la aparición de una señal elíptica que indica una acumulación de ADN en forma de Y. La adición de anhidrotetraciclina eliminó la señal de ADN en forma de Y. Otro intermediario común es la unión de Holliday, visualizada como una señal cónica en la parte superior del arco en Y y una señal aguda proveniente del ADN lineal en el extremo del arco en Y.

Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en ocho días si se lleva a cabo adecuadamente. Aunque es un procedimiento en 2D, es importante recordar que la calidad de los tapones de ADN es fundamental para la visualización óptima de las estructuras de ADN.