Utilizando imágenes bioluminiscentes encargado de investigar la sinergia entre Streptococcus pneumoniae Y el Virus de la Influenza en ratones lactantes

El objetivo general de este procedimiento es monitorear el efecto de la influenza, una infección viral, en la progresión de la neumonía por S. en ratones recién nacidos colonizados asintomáticamente. Los primeros tallos infecciosos se preparan cultivando los organismos en un cultivo de caldo estándar. En el caso de las s. pneumoniae bioluminiscentes, o en los huevos de gallina para el virus de la gripe A, los ratones de cinco días de edad son colonizados por S. pneumoniae a través de una infección intranasal.

Una vez que los ratones tienen entre ocho y 14 días de edad, se infectan con influenza A o se infectan simuladamente. Las imágenes bioluminiscentes in vivo se pueden utilizar para controlar la diseminación de la neumonía por S en los pulmones de ratones coinfectados. En el caso de la gripe A, en última instancia, se pueden obtener resultados que muestran la exacerbación y diseminación de las neumonías bioluminiscentes.

En la gripe, un virus infectó a los ratones bebés. Por lo tanto, la principal ventaja de utilizar esta técnica frente a otras técnicas comúnmente utilizadas, como la disección de animales en cada momento después de la eutanasia, es que se puede seguir la infección en el mismo animal a lo largo del tiempo. La segunda gran ventaja es que se puede seguir la cinética de la infección en un órgano u otros sitios que no son tan fácilmente accesibles, como el oído medio.

La demostración de los procedimientos estará a cargo de mi colega Patrick Redding, que es investigadora principal en el departamento, Kirsty Short, que es estudiante de posgrado en mi laboratorio y yo mismo. Cultivo de bioluminiscentes. Las S pneumoniae recogen una sola colonia bacteriana, inoculan la colonia en un frasco estéril de McCartney que contiene 10 mililitros de caldo Todd Hewitt.

Suplementado con un 0,5% de extracto de levadura y un trozo de barrena de sangre e incubación. El cultivo estáticamente a 37 grados centígrados. Una vez que la densidad óptica del cultivo a 600 nanómetros alcance de 0,4 a 0,45, coloque el cultivo en hielo húmedo e incube durante cinco minutos.

Colocar el cultivo en hielo detendrá el crecimiento de las células bacterianas y mantendrá las células en esta fase de crecimiento. Para determinar el título infeccioso de la placa madre, dilución en serie de la culata en placas de barrena de sangre e incubar las placas a 37 grados centígrados. Durante 18 a 24 horas, la concentración de bacterias viables en la cepa se puede derivar de la colonia resultante.

Cuente para almacenar el stock bacteriano, agregue un mililitro de glicerol estéril al 80% al cultivo de 10 mililitros. Haga alícuotas de 200 a 500 microlitros y almacene las muestras a menos 70 grados centígrados. Un virus crece en el líquido aoico de los huevos de gallina embrados de 10 días de edad mediante perforación.

Un pequeño orificio en el virus de la cáscara de huevo se inyecta en la cavidad de Allan Toic a través de la bolsa de aire. Para localizar la cavidad de Allan Toic, primero vela el huevo colocando una fuente de luz sobre el huevo. Marque la ubicación del saco de aire en un punto libre de venas utilizando etanol al 70%.

Desinfecte la superficie del huevo con el escribano joyero, perfore un pequeño orificio a través de la cáscara del huevo al nivel del saco de aire, justo por encima de la marca. Coloca el huevo con el agujero hacia arriba. En soporte para huevos de cartón.

Llene una jeringa de un mililitro equipada con una aguja de calibre 26, 100 microlitros de virus. Pase la aguja a través del orificio y, apuntando directamente hacia abajo, perfore a través del saco de aire en la cavidad subyacente de Alan Toic donde se puede dispensar el virus, retire con cuidado la aguja con cera derretida. Selle el agujero en la cáscara del huevo y colóquelo en una incubadora de huevos humidificada.

Fijado a 35 grados centígrados. Después de una incubación de dos días, retire el huevo y cúbralo con una vela para controlar la viabilidad del embrión. Si los vasos sanguíneos son visibles, el embrión está vivo.

Si el interior del huevo es negro, el embrión ha muerto y el óvulo debe desecharse. Incubar el huevo durante la noche a cuatro grados centígrados para matar el embrión mientras constriñe los vasos sanguíneos. Esto ayudará a preservar la integridad de los vasos sanguíneos y minimizar la pérdida de virus que puede ocurrir si las partículas virales entran en contacto con la sangre y se unen a los glóbulos rojos.

Una vez que el embrión ha sido asesinado, se puede recolectar el líquido Alan Toic. Desinfectar la superficie del huevo con etanol al 70%. Retire el sello de cera y, con unas tijeras curvas, corte alrededor de la parte superior del huevo para quitar el saco de aire por encima de la membrana Alan Toic.

Con pinzas estériles, perfore y despegue la membrana, exponiendo así el líquido. Utilice una pipeta para sujetar el embrión hacia un lado y otra pipeta de 10 mililitros. Para recolectar el líquido Alan Toic, recoja y extraiga el líquido de varios huevos en un tubo cónico de 50 mililitros.

Deseche cualquier líquido si está contaminado con yema o centrífuga de sangre, los fluidos Alan Toic se acumulan a 2000 RPM durante cinco minutos para pellet los desechos, recoja el sobrenadante, alícuota en tubos criogénicos de uno a dos mililitros y almacene a menos 70 grados centígrados. El título viral de las alícuotas puede determinarse mediante un ensayo de placa, descongelar una alícuota congelada de s. pneumoniae bioluminiscente y diluirse a 2000 UFC por inóculo de tres microlitros en PBS estéril, recoger suavemente un ratón de cinco días de edad sosteniéndolo en posición vertical. Use una pipeta estéril para dejar caer tres microlitros de bacterias o PBS para infecciones simuladas en las narinas.

Una vez que se haya inhalado todo el inóculo, vuelva a colocar al ratón en la jaula de tres a nueve días después de la colonización. Con la neumonía S bioluminiscente, los ratones pueden infectarse con la gripe. Un virus primero descongela una alícuota de líquido aoico infectado y se diluye a 20 PFU por inóculo de tres microlitros en PBS estéril, como se muestra para la neumonía por S.

Repita la infección intranasal como se muestra anteriormente. El líquido Alan Toico de los huevos no infectados se puede utilizar para las infecciones simuladas. Prepare una solución anestésica de 0,75 miligramos por mililitro de ketamina y 1,76 miligramos por mililitro de xilacina en agua inyectable.

Inyectar la solución anestésica en la cavidad peritoneal del ratón utilizando 100 microlitros por cada 10 gramos de peso corporal. Una vez que el ratón esté completamente anestesiado, colóquelo dentro de la caja de imágenes colocando cuidadosamente la región anatómica de interés paralela a la cámara. Una imagen ventral permitirá la visualización de las vías respiratorias, mientras que una imagen lateral proporcionará una captura más sensible de las orejas.

Coloque la caja que contiene el ratón dentro del IVIS y permita la entrada de flúor Isof a un caudal de 0,5 litros por minuto. Para mantener la anestesia, configure la máquina IVIS en la plataforma de imágenes correcta y Benning para prepararse para la captura de imágenes. Establezca el tiempo de imagen en siete minutos e inicie la imagen, mientras que siete minutos son suficientes para ratones C 57 black six de 20 días de edad infectados con nuestra cepa bioluminiscente S pneumoniae.

El tiempo de captura óptimo puede variar en función de la intensidad y la ubicación de la señal, así como de la cepa de ratón o bacteria utilizada. Una vez que se complete la imagen, transfiera el mouse a una caja precalentada con una almohadilla térmica y permita que se recupere de la anestesia antes de devolverlo a su jaula. Las imágenes pueden ser analizadas utilizando el paquete de software de imágenes vivas versión 3.0 de Caliper Life Sciences en ratones, colonizados solo con neumonía por S y simulados coinfectados con líquido estéril Alan Toic.

Se pueden detectar diferentes niveles bajos de luminiscencia en el área nasal, tres días y cuatro días después de la infección. Por el contrario, los ratones infectados con neumonía e influenza. Se puede detectar una señal de luminiscencia fuerte desde toda el área nasofaríngea y la intensidad y el tamaño de la señal de luminiscencia aumentan desde el tercer hasta el cuarto día después de la infección por gripe.

De acuerdo con la señal de bioluminiscencia más fuerte, la carga bacteriana en la cavidad nasal de los animales coinfectados es aproximadamente 100 veces mayor que la de un animal colonizado. Con la neumonía S solamente, se puede detectar un virus en la nariz y los pulmones de los animales infectados. Como se muestra aquí, el título del virus de la influenza A es similar en la nariz y los pulmones del animal coinfectado al cuarto día después de la administración intranasal del virus.

Por lo tanto, siguiendo este método se utilizan métodos como un ensayo de placa viral o la promesa de tejido homogéneo para obtener una determinación más precisa de la carga viral y la carga bacteriana en los tejidos de interés.