Rapide par PCR en utilisant thermocyclage Microscale convection thermique

L’objectif général de cette procédure est de démontrer comment le principe du thermocyclage PCR par convection thermique peut être appliqué pour exécuter une réaction réelle. Pour ce faire, il faut d’abord introduire l’idée du fonctionnement du thermocyclage par convection naturelle, ainsi que les principes de conception de base. La deuxième étape de la procédure consiste à montrer comment préparer la cartouche du réacteur et charger les réactifs à l’intérieur.

La troisième étape de la procédure consiste à assembler la cartouche du réacteur dans l’unité de chauffage et à exécuter la réaction. La dernière étape de la procédure consiste à retirer les réactifs après la réaction et à vérifier les résultats par électrophorèse sur gel. En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus qui montrent une réplication rapide de l’ADN par thermocyclage PCR par convection naturelle.

Bonjour, je suis Radha OU du laboratoire de l’UGAs à l’Université Texas a et m. Aujourd’hui, nous allons vous montrer une procédure pour effectuer un thermocyclage PCR rapide en utilisant la convection naturelle comme la lampe à lave. Nous utilisons cette procédure en laboratoire pour étudier la conception et l’optimisation de dispositifs de thermocyclage qui exploitent ce principe.

Alors commençons. Ce protocole commence par la conception et la construction d’un dispositif simple de thermocyclage par convection. Le dispositif utilisé pour cette démonstration se compose de cartouches de chambre de réaction en plastique interchangeables qui sont prises en sandwich entre deux plaques d’aluminium dont les températures sont contrôlées indépendamment.

Les puits cylindriques du réacteur ont été encastrés en usinant des réseaux de trous dans des blocs de polycarbonate avec différentes combinaisons de diamètre entier et d’épaisseur de feuille de plastique utilisées pour obtenir les rapports d’aspect souhaités. Une conception optimale implique de choisir la bonne géométrie de réacteur qui générera un flux circulatoire capable de transporter les réactifs à travers les températures clés impliquées dans le processus de PCR. Les paramètres géométriques qui peuvent être modifiés dans les réacteurs cylindriques considérés : il s’agit de la hauteur et du diamètre, ou de manière équivalente du rapport d’aspect.

La surface inférieure du réacteur est chauffée à l’aide d’un bloc d’aluminium contenant des cartouches chauffantes interfacées avec un régulateur de température entraîné par microprocesseur. La température à la surface supérieure du réacteur est régulée à l’aide d’un bloc d’aluminium relié à un bain d’eau à recirculation. L’ensemble est serré à l’aide de vis en nylon pour limiter la conduction thermique entre les blocs d’aluminium opposés.

Préparez chaque libération de 100 micros de la réaction PCR en mélangeant 10 fois une solution tampon de chlorure de magnésium 25 millimolaires, deux DTP distillés, l’amorce directe de la sonde de bêta-actine et l’amorce inverse du modèle génomique humain, l’ADN et la polymérase K-O-D-D-N-A. Avant de charger les réactifs, scellez la surface inférieure de la chambre de PCR à l’aide d’une fine feuille de ruban d’aluminium, rincez les puits du réacteur avec une solution aqueuse de 10 milligrammes par millilitre d’albumine sérique bovine suivie d’un anti-buée rain X. Enfin, pipetez les réactifs dans les puits du réacteur à l’aide d’embouts de chargement de gel et scellez la surface supérieure avec du ruban téflon FEP.

Avant de commencer la réaction, préchauffez les deux blocs d’aluminium aux températures de surface supérieure et inférieure souhaitées. Prenez en sandwich le réacteur en plastique chargé de réactifs PCR entre les blocs chauffants en aluminium et fixez rapidement l’ensemble à l’aide de vis en nylon. Une fois que la réaction s’est déroulée pendant le temps souhaité, éteignez les radiateurs et placez la surface chauffée inférieure de l’appareil sur un bloc métallique refroidi pour le refroidir rapidement et arrêter le flux convectif.

Retirez le réacteur en plastique et pipetez les produits hors des puits pour une analyse ultérieure. Préparez un gel à 2 % en chauffant 10 grammes d’agros avec 500 millilitres de tampon unique sur une plaque chauffante jusqu’à ce que la solution devienne claire. Chargez le gel de rose A dans l’arbre de coulée et insérez le peigne.

Laissez le gel prendre pendant environ 30 minutes. Retirez le peigne et ajoutez une fois le tampon TAE jusqu’à ce que le gel soit immergé. Préparez des échantillons d’ADN colorés par fluorescence avec deux microlitres de 100 fois de vert cyber.

Une solution : deux microlitres d’échantillon d’ADN, deux microlitres de six fois de colorant de chargement orange et quatre microlitres de tampon TAE. Chargez un marqueur de taille d’échelle d’ADN de 100 paires de bases et les échantillons d’ADN dans les puits du gel. Séparez l’ADN en faisant fonctionner le gel à 60 volts pendant une heure.

Retirez le gel et photographiez-le sous lumière UV pour obtenir les champs d’écoulement result. 3D à l’intérieur des réacteurs PCR convectifs ont été étudiés sur une gamme de rapports d’aspect différents à l’aide de la dynamique des fluides numérique ou CFD. Ces données ont révélé que des modèles complexes peuvent apparaître et qu’un sous-ensemble de ces champs d’écoulement complexes peut accélérer considérablement la réaction.

Ces effets géométriques peuvent être clairement observés en comparant les champs d’écoulement dans les réacteurs à des rapports d’aspect élevés et faibles avec un rapport d’aspect élevé. Les éléments fluides sont affectés le long des trajectoires, traçant des chemins qui sont essentiellement des boucles fermées et sont verrouillés pour suivre les mêmes chemins pendant de longues périodes. Par conséquent, il y a peu de possibilités d’échange entre les trajectoires d’écoulement qui exposent les réactifs à la séquence optimale des conditions thermiques pour la PCR et l’ensemble beaucoup plus grand de trajectoires restantes qui ne contribuent pas à l’amplification.

Le champ d’écoulement est très différent à un rapport d’aspect plus petit. Le champ d’écoulement est plus chaotique dans la mesure où les trajectoires des éléments fluides ne suivent plus de chemins fermés. Bien que les réactions soient soumises à un profil de température plus complexe, les éléments fluides sont capables d’explorer une gamme beaucoup plus large de trajectoires, de sorte qu’une plus grande partie du volume de réactif a la possibilité d’obtenir des profils thermiques optimaux.

Ces résultats suggèrent que, bien que les trajectoires d’écoulement individuelles à H sur D égale à neuf puissent sembler plus favorables à la PCR en produisant des profils de température similaires à ceux utilisés dans un thermocycleur conventionnel. La nature chaotique du champ d’écoulement à HOD est égale à trois, finit par dominer à l’échelle mondiale en favorisant un échange amélioré afin que les réactifs ne restent pas piégés dans des trajectoires défavorables pendant très longtemps. Pour tester cette hypothèse et déterminer quelle géométrie de réacteur était la plus favorable à la PCR, les deux cylindres ont été utilisés pour effectuer la réplication PCR d’une cible de 295 paires de bases associée au gène de l’actine bêta à partir d’un modèle d’ADN génomique humain. L’amplification du produit cible correct a été réalisée à plusieurs reprises en seulement 10 minutes à H sur D égale trois.

À l’inverse, la même réaction a nécessité au moins 20 minutes avant que des produits détectables ne soient observés à H sur D égale neuf. La spécificité de la réaction est également beaucoup plus grande lorsque H sur D est égal à trois lorsqu’un seul produit de PCR est obtenu. Alors que plusieurs produits non spécifiques sont générés en H sur D égale neuf, où le champ d’écoulement piège les éléments fluides dans des trajectoires thermiques défavorables pendant de longues périodes.

Nous venons de vous montrer comment exécuter une réaction PCR à l’aide d’un flux convectif. Thermocycleur. Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier de sceller les réactifs à l’intérieur de la chambre du réacteur sans laisser tomber de poches d’air. Ceux-ci perturberaient le champ d’écoulement à l’intérieur et inhiberaient la réaction.

Donc c’est tout. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.