Liquide céphalo-rachidien profilage de microARN Utilisation quantitative PCR en temps réel

L’objectif global de cette procédure est de profiler les microARN dans les fluides céphalo-crachiens par PCR quantitative et d’analyser les données à l’aide d’un logiciel professionnel Gen X. Pour ce faire, il suffit d’isoler d’abord l’ARN total à partir d’échantillons de liquide céphalo-rachidien. La deuxième étape consiste à effectuer une transcription inverse afin de transcrire les ARN en CDNA.

Ensuite, les CDNA sont mélangés avec un mélange maître cyber green chargé dans 384 plaques de puits contenant des amorces pour 742 séquences uniques et amplifié à l’aide de la PCR en temps réel. La dernière étape consiste à analyser les données acquises à partir de l’amplification en temps réel. En fin de compte, les résultats peuvent être exprimés sous la forme d’un changement de pli, d’une augmentation ou d’une diminution au cours d’un contrôle, et visualisés dans diverses représentations graphiques.

Ainsi, le principal avantage de notre technique par rapport aux méthodes existantes comme les puces est que notre méthode est très sensible et nécessite une quantité minimale d’ARN. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront des difficultés en raison de la grande quantité de données générées et de l’utilisation du logiciel pour l’analyse des données. Tout d’abord, vaporisez la zone de travail et les pipettes avec RNA Zap.

Pour commencer, la synthèse de l’ADNC dilue les échantillons d’ARN matrice à une concentration de cinq nanogrammes par microlitre avec de l’eau sans nucléases. Ensuite, placez délicatement le tampon de réaction cinq x sur de la glace pour le décongeler. Ajoutez ensuite 40 microlitres d’eau sans nucléase à l’ARN pour remettre le réactif en suspension, agitez le tube et laissez-le sur la glace pendant 15 à 20 minutes.

Ensuite, sortez les enzymes du congélateur, agissez les tubes et placez-les sur de la glace. De plus, une fois que tous les réactifs ont décongelé, faites-les tourner rapidement. Préparez une solution de travail de transcriptase inverse dans un tube d’eph de 1,5 millilitre en ajoutant l’enzyme tampon de réaction cinq x.

Mélanger l’eau exempte de nucléases et l’épi d’ARN dans la matrice en utilisant les proportions indiquées dans le tableau un. Ensuite, mélangez la solution de travail en la faisant tourbillonner pendant une à deux secondes à vitesse maximale. Faites tourner brièvement la solution pendant 10 secondes, puis distribuez la solution de travail dans des tubes PCR sans nucléases.

Ajoutez ensuite l’ARN matrice directement dans les tubes PCR. Agitez doucement la réaction pendant une à deux secondes pour vous assurer que tous les réactifs sont bien mélangés et faites tourner les tubes pendant 10 secondes. Placez l’échantillon dans l’appareil de PCR et entrez les paramètres indiqués ici.

Démarrez ensuite le programme après la transcription rétro. Le CDNA est prêt pour l’amplification par PCR en temps réel et peut être stocké à moins 20 degrés Celsius jusqu’à cinq semaines. Pour commencer l’amplification PCR en temps réel, placez d’abord le CDNA et le master mix PCR sur de la glace.

Pour décongeler, protégez les flacons de mélange maître PCR de la lumière en les recouvrant de papier d’aluminium pendant qu’ils décongèlent. Une fois le vortex dégelé, le maître PCR se mélange pendant une à deux secondes. Ensuite, combinez 2000 microlitres de deux master mix XPCR et 1 980 microlitres d’eau dans un tube conique de 15 millilitres.

Ajoutez 20 microlitres de CDNA au mélange et agitez doucement les solutions pendant une à deux secondes. Ensuite, faites tourner les solutions dans une centrifugeuse réfrigérée à 1 500 fois G pendant une minute à quatre degrés Celsius. Placez ensuite le mélange réactionnel PCR dans un réservoir de pipette multicanaux.

Faites tourner brièvement les plaques prêtes à l’emploi dans une centrifugeuse réfrigérée à 1 500 fois G avant de retirer le joint de la plaque. Versez ensuite 10 microlitres du mélange maître PCR contenant du CD NA dans chaque puits d’une plaque de 384 puits. À l’aide d’une pipette à 16 canaux et scellez la plaque avec un film d’étanchéité optique.

Après avoir ajouté le mélange maître, faites tourner brièvement la plaque dans une centrifugeuse réfrigérée à 1 500 fois G pour tirer la solution au fond des puits. Mélangez les échantillons et retirez les bulles d’air pour interrompre l’expérience. À ce stade, stockez les réactions dans un endroit protégé de la lumière à quatre degrés Celsius jusqu’à 24 heures.

Ensuite, effectuez une amplification PCR en temps réel et une analyse de la courbe de fusion en suivant les paramètres détaillés dans le tableau deux. Pour commencer l’analyse, sélectionnez la deuxième méthode d’analyse dérivée dans le lightcycler Roche. Calculez ensuite le cycle de quantification ou les valeurs CQ.

Exportez les données sous forme de tableau et enregistrez-les sous forme de fichier texte. Ensuite, importez les données dans Gen X en cliquant d’abord sur le bouton de l’assistant d’importation de gon, puis en cliquant sur démarrer dans la fenêtre suivante, sélectionnez le format des fichiers de disposition d’instrument et de plaque. Les fichiers Excel de présentation de plaque peuvent être téléchargés sur le site Web de GON.

Ensuite, importez le panneau un et cliquez sur suivant. La table générée après l’importation du fichier contient des colonnes prédéfinies, modifiez les noms d’échantillons et ajoutez ou supprimez des colonnes de classification à cette étape. Cliquez sur Suivant lorsque vous avez terminé et enregistrez les données.

Ensuite, chargez-le dans l’éditeur de données Tout d’abord, étalonnez les données entre les plaques en choisissant l’étalonnage INTERPLATE dans le menu de prétraitement pour vous assurer que toutes les plaques sont calculées à l’aide des mêmes paramètres. Ensuite, définissez une valeur limite qui éliminera les données supérieures au cycle de seuil ou au ct. Si un micro-ARN a un CT plus grand pour une réplique sur trois, cette lecture sera remplacée par la moyenne du CT des deux autres sondes.

Définissez les gènes de référence en sélectionnant une liste de microARN qui ont des valeurs CQ similaires dans tous les échantillons et la norme de gène d’exécution. Ensuite, normalisez les données à l’aide des gènes de référence obtenus. Les valeurs résultantes correspondront au delta ct.

Supprimez les colonnes vides et presque vides en ouvrant la fenêtre de prétraitement et en sélectionnant Valider la feuille, puis en sélectionnant Appliquer sur la ligne de suppression des colonnes vides dans la ligne ci-dessous. Choisissez le pourcentage souhaité de données valides et cliquez sur Appliquer. Sélectionnez 100 % si vous souhaitez comparer uniquement les microARN communs à tous les échantillons.

Chargez le fichier MDF final dans Gen X et ouvrez le gestionnaire de données pour classer, regrouper et visualiser les microARN et les échantillons sur des cartes thermiques et des dendro grammes. Sélectionnez et créez ensuite des groupes d’échantillons, puis cliquez sur Appliquer lorsque vous avez terminé. Ensuite, dans la fenêtre du panneau de configuration, cliquez sur Exécuter.

Enregistrez la carte thermique dans le format souhaité, tel que TIFF ou bitmap, puis copiez et modifiez-la selon vos besoins. Cette barre graphique a été obtenue à partir de l’application de norme G au sein de la génération X pour analyser 10 gènes de référence possibles de micro-ARN. Ces résultats indiquent que MIR 622 et MI 1,266 sont les microARN exprimés de manière stable.

La boîte à moustaches présentée ici montre la distribution des données pour chacun des 11 microARN statistiquement significatifs au sein des groupes de VIHE et de VIH plus sans encéphalite. Dans chaque colonne, le graphique indique la médiane et les premier et troisième quartiles, ainsi que les valeurs maximale et minimale. À la suite de cette procédure, le profilage minéral peut être effectué sur n’importe quel liquide corporel, échantillon de tissu et cellule cultivée.