Name: Liquide céphalo-rachidien profilage de microARN Utilisation quantitative PCR en temps réel (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: Apprenez le profilage de microARN dans le liquide céphalo-rachidien par PCR quantitative en temps réel. Cette méthode permet d'analyser 742 séquences uniques et s'adapte à divers échantillons biologiques pour la recherche en neurosciences.

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Le projet décrit a été soutenue par Prix Nombre R01MH079751 (PI: F. Peruzzi) de l&#39;Institut national de la santé mentale. Le contenu est exclusivement la responsabilité de leurs auteurs et ne représentent pas nécessairement les vues officielles de l&#39;Institut national de santé mentale ou l&#39;Institut national de la santé.

<ol><li>Pacifici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebrospinal+fluid+miRNA+profile+in+HIV-encephalitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cerebrospinal fluid miRNA profile in HIV-encephalitis.</a> J. Cell. Physiol. 10, (2012).</li>
<li>Krol, J., Loedige, I., Filipowicz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+widespread+regulation+of+microRNA+biogenesis%2C+function+and+decay%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet.%22%5BJournal%5D)">The widespread regulation of microRNA biogenesis, function and decay.</a> Nat. Rev. Genet.. 11, 597-610 (2010).</li>
<li>Calin, G. A., Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+signatures+in+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">MicroRNA signatures in human cancers.</a> Nat. Rev. Cancer. 6, 857-866 (2006).</li>
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<li>De Smaele, E., Ferretti, E., Gulino, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+as+biomarkers+for+CNS+cancer+and+other+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs as biomarkers for CNS cancer and other disorders.</a> Brain Res. 1338, 100-111 (2010).</li>
<li>Heneghan, H. M., Miller, N., Kerin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiRNAs+as+biomarkers+and+therapeutic+targets+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">MiRNAs as biomarkers and therapeutic targets in cancer.</a> Curr. Opin. Pharmacol. 10, 543-550 (2010).</li>
<li>Kosaka, N., Iguchi, H., Ochiya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNA+in+body+fluid%3A+a+new+potential+biomarker+for+cancer+diagnosis+and+prognosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Sci%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNA in body fluid: a new potential biomarker for cancer diagnosis and prognosis.</a> Cancer Sci. 101, 2087-2092 (2010).</li>
<li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+expression+profiles+classify+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">MicroRNA expression profiles classify human cancers.</a> Nature. 435, 834-838 (2005).</li>
<li>Shah, A. A., Leidinger, P., Blin, N., Meese, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRNA%3A+small+molecules+as+potential+novel+biomarkers+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">miRNA: small molecules as potential novel biomarkers in cancer.</a> Curr. Med. Chem. 17, 4427-4432 (2010).</li>
<li>Blondal, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+sample+and+miRNA+profile+quality+in+serum+and+plasma+or+other+biofluids%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Assessing sample and miRNA profile quality in serum and plasma or other biofluids.</a> Methods. 59, 1-6 (2013).</li>
<li>Jensen, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+two+commercial+global+miRNA+expression+profiling+platforms+for+detection+of+less+abundant+miRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Evaluation of two commercial global miRNA expression profiling platforms for detection of less abundant miRNAs.</a> BMC Genomics. 12, 435 (2011).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Les microARN sont de petits ARN non codantes qui régulent l&#39;expression des gènes par l&#39;inhibition de la traduction et / ou de promotion de la dégradation de l&#39;ARNm 2. En raison de leur grande stabilité dans des conditions exemptes de cellules, les microARN ont été détectés dans de nombreux fluides corporels. En outre, le profil d&#39;expression de microARN distinct a été corrélée avec le stade et / ou de la progression dans une variété de cancers chez l&#39;homme 9.3. <p class="jove...

Les microARN appartiennent à la famille de la petite (21-23 nt de long) non codantes des ARN qui régulent l&#39;expression des gènes post-transcriptionnel. microARN peuvent être sécrétées dans l&#39;espace extracellulaire où ils semblent être relativement stables. Alors que la détermination des changements dans l&#39;expression des miARN peut être une étape importante vers l&#39;identification de biomarqueurs, effectuer profils miRNA et la manipulation d&#39;une grande quantité de données peut être intimidant. Ici, nous décrivons un protocole pour déterminer les changements dans l&#39;expression des miARN dans le liquide céphalo-rachidien (applicable à d&#39;autres fluides corporels) par un temps réel sensible PCR. Nous décrivons également l&#39;utilisation de logiciels d&#39;analyse de données, y compris l&#39;analyse statistique et la représentation graphique des résultats. Toute la procédure est relativement simple et facile et, en fonction du nombre d&#39;échantillons à profilés et le nombre de machines de PCR en temps réel disponibles, également relativement rapides. La partie expérimentale nécessite précision dans la manipulationARN et pipetage dans des plaques à 384 puits, tandis que la section d&#39;analyse de données à l&#39;aide GenEx nécessite quelques connaissances de base en informatique et en statistiques.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Table 3. Liste des équipements.</td></tr><tr><td> Finnpipette Novus Pipette multicanaux </td><td>Thermo Scientific</td><td>HH05279</td><td></td></tr><tr><td> Finntip Pipette Tips </td><td>Thermo Scientific</td><td>9400613</td><td></td></tr><tr><td> Thermal Cycler C1000 </td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr><tr><td> 0.2 ml Low Profile, Tubes PCR transparents </td><td>Biorad</td><td>TLS0801</td><td></td></tr><tr><td> Bandes à capuchon plat </td><td>Biorad</td><td>TLS0803</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 Système de PCR en temps réel</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 Sealing Foil</p</td><td></td><td>>Roche04 729 757 001</td><td></td></tr><tr><td> Centrifugeuse réfrigérée 5804R </td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Rotor à godet pivotant, 4 places </td><td>Eppendorf</td><td>A-4-44</td><td></td></tr><tr><td> Mini centrifugeuse de paillasse </td><td>Fisher</td><td>05-090-100</td><td></td></tr><tr><td> Vortex de paillasse </td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1,5 ml Tubes de microcentrifugation, stérilisés </td><td>Fisher</td><td>02-681-5</td><td></td></tr><tr><td> Matrix Réservoir de réactifs, 25 ml </td><td>Thermo Scientific</td><td>8093</td><td></td></tr><tr><td> Thermomixer Confort </td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mini centrifugeuse de paillasse Sigma 1-15</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Bench-Top Vortex </td><td>Velp Scientifica</td><td>F202A0173</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tableau 4. Liste des réactifs.</td></tr><tr><td> Universal c-DNA synthesis kit, 16-32 rxns </td><td>Exiqon</td><td>203300</td><td></td></tr><tr><td> SYBR Green master mix, Universal RT, 25 ml </td><td>Exiqon</td><td>203400</td><td></td></tr><tr><td> Eau distillée ultrapure Dnase, Sans Rnase </td><td>Invitrogen</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td> MicroARN Panels humains PCR prêts à l’emploi (I+II) V2.R </td><td>Exiqon</td><td>203608</td><td></td></tr><tr><td>mirVana Kit d’isolement des miARN, 40 isolations</td><td>Ambion</td><td>AM1556</td><td></td></tr><tr><td> MS2 Transporteur d’ARN </td><td>Roche Applied Science</td><td> 10165948001</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoéthanol 98 %</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3148-25ml</td><td></td></tr><tr><td> éthanol 100 % </td><td>Carlo Erba</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td> eau sans nucléases </td><td>Qiagen</td><td>1039480</td><td></td></tr><tr><td>RNAse Zap</td><td>Ambion</td><td>AM9780</td><td></td></tr></tbody></table>

liquide céphalo-rachidien profilage de microarn utilisation quantitative pcr en temps réel

Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR

<html> Les microARN (miARN) constituent une couche puissante de la régulation des gènes en guidant RISC à cibler des sites situés sur des ARNm et, par conséquent, en modulant leur répression de la traduction. Changements dans l&#39;expression des miARN ont été révélés être impliqués dans le développement de toutes les grandes maladies complexes. En outre, des études récentes ont montré que les miARN peuvent être sécrétées dans l&#39;environnement extracellulaire et dans la circulation sanguine et d&#39;autres fluides corporels où ils peuvent circuler avec une grande stabilité. La fonction de ces miARN circulation reste largement insaisissable, mais des approches à haut débit systématiques, telles que miRNA tableaux de profilage, ont conduit à l&#39;identification de signatures miRNA dans plusieurs conditions pathologiques, y compris les maladies neurodégénératives et plusieurs types de cancers. Dans ce cadre, l&#39;identification de miARN profil d&#39;expression dans le liquide céphalo-rachidien, comme indiqué dans notre étude récente, rend miARN candidats intéressants pour l&#39;analyse de marqueurs biologiques. _content &quot;&gt; Il existe plusieurs outils disponibles pour le profilage de microARN, comme les puces, quantitative PCR en temps réel (qPCR), et le séquençage profond. Ici, nous décrivons une méthode sensible au profil microARN dans liquide céphalo-rachidien par PCR quantitative en temps réel. Nous utilisé les panneaux droits Exiqon microARN prêts à l&#39;emploi PCR I et II V2.R, qui permet la détection de 742 microARN humains uniques. Nous avons effectué les tableaux en triple courses et nous avons traité et analysé les données en utilisant le logiciel GenEx Professional 5. En utilisant ce protocole, nous avons profilé succès microARN dans divers types de lignées cellulaires et des cellules primaires, CSF, le plasma et les tissus inclus en paraffine fixés au formol.

Les résultats de cette étude ont été publiés 1. Figure 1 montre les résultats de l&#39;analyse des micro-ARN de référence de candidats en utilisant l&#39;application geNorm. En conséquence, deux microARN, miR-622 et miR-1266, ont été identifiés comme gènes de référence et ont été utilisés pour normaliser les valeurs de miARN. Pour l&#39;étude du LCR, nous avions trois groupes d&#39;échantillons: le VIH (n = 10), HIVE (n = 4), et le VIH + sans enc...

Nous décrivons un protocole de PCR en temps réel pour le profil de microARN dans le liquide céphalo-rachidien (LCR). A l&#39;exception des protocoles d&#39;extraction d&#39;ARN, la procédure peut être étendue à l&#39;ARN extrait à partir d&#39;autres fluides corporels, des cellules en culture, ou des échantillons de tissus.

Liquide céphalo-rachidien profilage de microARN Utilisation quantitative PCR en temps réel

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their ...

L'objectif général de cette procédure est de profiler les microARN dans les liquides céphalo-rachidiens par PCR quantitative et d'analyser les données à l'aide du logiciel professionnel Gen X. Cela est réalisé en isolant d'abord l'ARN total à partir d'échantillons de liquide céphalo-rachidien. La deuxième étape consiste à effectuer une transcription inverse afin de transcrire les ARN en ADNc.Ensuite, les ADNc sont mélangés à un mélange maître contenant du cyber green, puis distribués dans des plaques de 384 puits contenant des amorces pour 742 séquences uniques, et amplifiés par PCR en temps réel. La dernière étape consiste à analyser les données obtenues lors de l'amplification en temps réel. Finalement, les résultats peuvent être exprimés sous forme de variation d'expression (fold change), soit une augmentation ou une diminution par rapport à un témoin, et être visualisés selon diverses représentations graphiques.Ainsi, le principal avantage de notre technique par rapport aux méthodes existantes, comme les puces à ADN, réside dans sa grande sensibilité et sa faible exigence en ARN. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés en raison de la gr

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Nous allons démontrer la configuration et l'analyse des pré-microARN de 96 puits pour les tableaux QPCR aide d'un robot ainsi que par la main avec une pipette multicanaux Thermo Scientific Matrix.

Profilage de la pré-micro ARNs et micro-ARN en utilisant quantitative PCR en temps réel (qPCR) Arrays

Nous décrivons ici une inversion optimisé multiplexe transcriptase PCR quantitative (qRT-PCR) en combinaison avec le protocole d'une plateforme microfluidique comme un coût et le temps moyen efficace de dépistage à haut débit pour microARN (miARN) les niveaux d'expression, surtout quand on travaille avec des quantités limitées de l'échantillon.

Haute profilage de microARN Débit: Multiplex Optimisé qRT-PCR à l&#39;échelle nanolitres sur l&#39;IFC de Fluidigm ArrayTM dynamique

Quantitative de réaction en chaîne polymérase en temps réel (qPCR) est une méthode rapide et sensible pour enquêter sur les niveaux d'expression de microARN (miARN différents) des molécules dans des échantillons tumoraux. En utilisant cette expression méthode de centaines de molécules différentes miARN peuvent être amplifiés, quantifiés, analysés et partir du même modèle d'ADNc.

Détection MicroRNA dans les tumeurs prostatiques par quantitative PCR en temps réel (qPCR)

Les microglies sont les macrophages résidents qui fournissent la première ligne de défense et de la surveillance immunitaire du système nerveux central. Les microARN sont des molécules régulatrices qui jouent un rôle important dans de nombreux processus physiologiques, y compris l'activation et la différenciation des macrophages. Dans cet article, nous décrivons la méthode de mesure des microARN dans la microglie.

Détection des microARN dans la microglie par PCR en temps réel dans le SNC normal et pendant neuroinflammation

Moléculaire de signalisation par des œstrogènes et les microARN sont essentiels dans le développement du cancer du sein et de la croissance. L'œstrogène active les récepteurs d'oestrogène, qui sont des facteurs de transcription. De nombreux facteurs de transcription peuvent réguler l'expression de microARN, et microARN régulés par les œstrogènes peuvent être profilée en utilisant différentes techniques de grande envergure.

Profilage de microARN œstrogène réglementés dans les cellules du cancer du sein

Dans le but de caractériser les changements dans les miARN sur les cellules souches neurales humaines différenciées (hNSCs), nous décrivons la différenciation des hNSC sur un système tridimensionnel, l’évaluation des changements dans l’expression des microARN par puce PCR miRNA, et l’analyse computationnelle pour la prédiction de la cible miARN et sa validation par double test de luciférase.

Différenciation d&#39;un Neural Stem Cell humaine ligne sur Trois Cultures dimensionnelles, les gènes Analyse des microARN et Putative cibles

MicroARN qui circulent ont récemment émergé comme biomarqueurs prometteurs et novateurs en vue de divers cancers et d'autres maladies. Le but de cet article est de discuter de trois plateformes de PCR différents basés sonde en temps réel et les méthodes qui sont disponibles pour quantifier et déterminer l'abondance des microARN circulation.

PCR en temps réel basée sur une sonde Approches de mesure quantitative des microARN

Une méthode sensible et précise de quantification des microARN acellulaires à l’aide d’une chimie à base de colorants et d’une technologie de PCR numérique en gouttelettes est décrite.

Circulant microARN Quantification Utilisation DNA-binding Dye Chemistry and Droplet PCR numérique

Nous présentons ici un protocole pour la détection de l'expression de microARN dans la membrane péritonéale de rat en utilisant une réaction quantitative en chaîne à la polymérase en transcription inverse quantitative en temps réel. Cette méthode est appropriée pour étudier le profil d'expression de microARN dans la membrane péritonéale de rat dans plusieurs états pathologiques.

Détection de l&#39;expression de microARN dans la membrane peritoneale des rats en utilisant une PCR quantitative en temps réel

Ce rapport décrit un protocole de mesure des niveaux absolus de miRNA plasma, à l’aide de la transcription inverse en temps réel quantitative PCR avec ou sans pré amplification. Ce protocole permet de mieux comprendre la quantité de plasma miARN et permet une évaluation qualitative des données correspondantes de différentes études ou laboratoires.

Quantification absolue des micro-ARN plasmatique chez les singes Macaques, à l’aide de la Transcription inverse en temps réel Quantitative PCR

Apprenez le profilage de microARN dans le liquide céphalo-rachidien par PCR quantitative en temps réel. Cette méthode permet d'analyser 742 séquences uniques et s'adapte à divers échantillons biologiques pour la recherche en neurosciences.

Liquide céphalo-rachidien profilage de microARN Utilisation quantitative PCR en temps réel

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