Génotypage rapide des tissus de souris en utilisant Sigma Extract-N-Amp PCR Kit Tissu

Bonjour, je m'appelle Linda et je travaille dans le laboratoire du Dr Edwin Niki à l'Université de Californie à Irvine. Aujourd'hui, je vais vous montrer comment j'utilise le kit d'extraction tissulaire PCR avec le colorant SYBR Green pour génotyper rapidement des souris transgéniques. Habituellement, j'utilise ce kit pour génotyper nos souris embryonnaires lorsque je réalise des cultures cellulaires dissociées aiguës et que j'ai besoin de déterminer rapidement le génotype de nos souris.

Mais pour les besoins d'aujourd'hui, nous disposons de queues de souris adultes à l'aide desquelles je peux vous montrer comment j'utilise ce kit. Ce protocole comprend une digestion par une enzyme de restriction rapide et une extraction de l'ADN, suivies d'une étape rapide de neutralisation. Ensuite, nous utilisons l'ADN extrait dans une PCR en temps réel, où nous pouvons surveiller nos amplicons de PCR.

Donc, si vous êtes prêt, commençons. Avant de commencer, nous devons nous assurer que notre bloc chauffant est réglé à 95 degrés Celsius, que notre colorant cyber vert est décongelé et conservé sur de la glace jusqu’à son utilisation, et que nos autres réactifs décongèlent à température ambiante. Dans mon seau à glace, j’ai mes deux amorces que nous utiliserons pour le génotypage, spécifiquement conçues pour notre gène d’intérêt et validées pour la PCR quantitative.

J'ai également mon témoin positif pour le gène d'intérêt, mon témoin négatif, et un échantillon de tissu que j'ai déjà prélevé sur une souris adulte. Lorsque vous prélèvez votre échantillon de tissu, il est très important d'être extrêmement rigoureux. Lorsque nous prélevons des queues d'embryons de souris, nous rinçons toujours nos pinces avec de l'éthanol à 70 % avant chaque prélèvement et entre chaque prélèvement.

Et nous rinçons toujours les échantillons de queue dans du TBS en premier ; vous devez préparer un mélange maître de la préparation des tissus et de l'extraction de l'ADN pour chaque queue. Vous aurez besoin de 100 microlitres de la solution d'extraction et de 25 microlitres de la solution de préparation du tissu. Je vais utiliser mon P200 et des embouts de pipette filtrants pour prélever 100 microlitres de la solution d'extraction et 25 microlitres de la solution de préparation du tissu dans un nouveau tube eend rph. Vous devrez homogénéiser votre solution mère en aspirant et en rejetant avec la pipette.

Vous devrez donc ajouter 125 microlitres de votre solution mère dans votre échantillon d'intérêt, en veillant à ce que, s'il s'agit d'une queue de souris adulte, l'extrémité coupée soit complètement immergée dans la solution mère, puis vous pouvez effectuer un vortexage du bout des doigts et incuber à température ambiante pendant 10 minutes. Pendant cette incubation de 10 minutes, je vais préparer mon mélange maître vert préféré, qui comprend le mélange maître vert cider fourni dans le kit, de l'eau milli Q ou de qualité PCR, ainsi que nos amorces, un peu d'eau de qualité PCR, et nos amorces directe et inverse. Et c'est tout.

À présent que l'incubation de 10 minutes est terminée, nous devons chauffer et activer la réaction à 95 degrés pendant trois minutes. L'inactivation de trois minutes est terminée, et nous allons maintenant ajouter la solution de neutralisation fournie dans le kit, soit cent microlitres par réaction, que vous mélangerez par vortexage. Après avoir ajouté le tampon de neutralisation, vos échantillons d'ADN peuvent être conservés à 4 degrés Celsius jusqu'à ce que vous soyez prêts à les utiliser.

Nous voulons en réalité obtenir notre génotype immédiatement. Nous passons donc directement à la PCR quantitative ; mes queues sont neutralisées et prêtes. Mon mélange maître PCR au vert cyber est prêt, et j'ai préparé mes tubes PCR sur un bloc réfrigéré.

Tout ce que je vais faire maintenant, c'est ajouter 16 microlitres de mon mélange maître dans chaque puits, puis ajouter 4 microlitres de l'extrait mutualisé ou 4 microlitres du contrôle positif ou négatif à chacun. Eh bien, tout ce que je fais, c'est ajouter 16 microlitres d'un mélange maître à chacun des puits. Ensuite, j'ajouterai 4 microlitres de l'extrait neutralisé aux 60 microlitres du mélange maître dans le puits, pour un volume réactionnel total de 20 microlitres.

Et je ferai la même chose pour les contrôles positif et négatif. Ajouter quatre microlitres à 16 microlitres avec un mélange maître PPR. Une fois que tous les composants sont ajoutés, vous pouvez les refermer avec une bande de huit bouchons optiquement transparents.

Vous devez faire attention à ne pas toucher la partie optiquement transparente des bouchons situés au-dessus de vos échantillons. J'utilise donc une serviette Kim pour appuyer sur les bouchons afin de m'assurer qu'ils sont bien scellés. J'ai doucement vortexé le mélange ADN et PCR, puis je l'ai mis en centrifugation. Nous sommes maintenant prêts à les placer dans l'appareil de PCR quantitative.

Ce que nous allons faire, c'est d'abord charger nos échantillons dans la machine PCR Opticon et créer une nouvelle configuration de plaque, dans laquelle notre premier puits contiendra notre échantillon, notre deuxième puits notre témoin positif, et notre troisième puits notre témoin négatif. Nous précisons que le volume de réaction total est de 20 microlitres. Ensuite, je vais charger un protocole conçu pour le génotypage rapide de l'individu.

Ce protocole comprend une étape de dénaturation de trois minutes, suivie d'un cycle de 15 secondes de dénaturation, 15 secondes d'hybridation primaire, puis 20 secondes d'extension primaire. La durée de l'extension primaire peut en réalité être réduite à environ 10 secondes, ce qui donne un total de seulement 40 secondes par cycle. Pour chaque cycle, ces trois étapes sont répétées environ 40 fois, comme dans une PCR classique, puis à la fin nous réalisons une courbe de fusion.

Nous avons donc configuré notre plaque et chargé notre protocole. Tout ce qu'il nous reste à faire est d'exécuter notre QPCR, qui commence par l'étape de dénaturation de trois minutes. D'après mon expérience, en utilisant les amorces que j'emploie ainsi que les échantillons de queue, et en recherchant les gènes que je cible, je sais que mes résultats positifs apparaîtront vers le 25e cycle, franchissant un seuil de cycle significatif.

Maintenant, le moment de ce croisement dépend fortement de votre échantillon de tissu, de ce que vous recherchez et de la quantité initiale d'ADN présente. Nous pouvons déjà constater que notre témoin positif a déjà donné un signal, et il semble que notre échantillon soit également positif. Comme vous le voyez, il commence à apparaître légèrement après notre témoin positif.

Nous devrons encore attendre un peu car nous en sommes seulement au 27e cycle, mais espérons-le, après quelques cycles supplémentaires, pourrons-nous confirmer que notre échantillon est positif, ce qui me permettra alors de poursuivre mon expérience. À ce stade, vous pouvez observer que le témoin négatif commence tout juste à apparaître, et cela parce que j'ai prélevé un excès de queue. Cela vous aide à être certain que tout signal apparaissant avant cet excès de queue négative sera positif.

Dès lors, tout ce qui apparaît avant le négatif, je le considérerais comme positif et je poursuivrais mon expérience. Une fois que le PCR a terminé les cycles, l'appareil effectue une analyse de courbe de fusion. Cela vous aidera à déterminer la composition et la pureté de votre produit.

Grâce à cela, vous pouvez vérifier si vous avez correctement choisi les échantillons positifs et négatifs. Par exemple, l'échantillon positif présentera un pic net et spécifique de température de fusion, correspondant à un produit PCR spécifique amplifié. Les échantillons négatifs présenteront un pic large et non spécifique de température de fusion, correspondant à de l'ADN non spécifique qui a été amplifié durant la PCR.

J'ai donc montré comment nous utilisons l'extrait Cyber Green de Sigma pour génotyper rapidement les queues de souris adultes. Toutefois, ce kit peut être utilisé avec divers tissus animaux, cheveux, salive, et je m'en sers pour le génotypage de queues d'embryons de souris. Nous apprécions ce kit car il est rapide.

Je peux obtenir mon génotype en une heure, ce qui est très pratique et simple. Merci d'avoir regardé et bonne chance.