Génotypage rapide des tissus de souris en utilisant Sigma Extract-N-Amp PCR Kit Tissu

Le génotypage complet d'un échantillon de queue de souris, y compris la digestion des tissus et la lecture de PCR, se fait en une heure et demie au moyen de Sigma SYBR Green Extract-N-Amp Tissue kit de PCR.

Bonjour, je m’appelle Linda et je travaille dans le laboratoire du Dr Edwin Niki à l’Université de Californie à Irvine. Aujourd’hui, je vais vous montrer comment j’utilise le cyber-vert de la stigmatisation, en extrayant un kit de PCR tissulaire pour génotyper rapidement des souris transgéniques. Habituellement, j’utilise ce kit pour génotyper nos souris embryonnaires lorsque je fais des cultures cellulaires dissociatives aiguës et j’ai besoin de découvrir rapidement, très rapidement, le génotype de notre souris.

Mais pour les besoins d’aujourd’hui, nous avons des queues de souris adultes dans lesquelles nous pouvons vous montrer comment j’utilise ce kit. Ce protocole implique une digestion rapide de la bière et une extraction de l’ADN, puis une étape de neutralisation rapide. Et nous utilisons l’extrait d’ADN dans une PCR en temps réel, où nous pouvons surveiller nos amplicons PCR.

Donc, si vous êtes prêt, commençons. Donc, avant de commencer, nous voulons nous assurer que notre bloc de chaleur est réglé à 95 degrés Celsius, que notre cyber-vert est décongelé et conservé sur de la glace jusqu’à ce qu’il soit nécessaire et que nos autres réactifs décongèlent à température ambiante. Dans mon seau à glace, j’ai mes deux amorces que nous utiliserons pour le génotypage et elles ont été spécialement conçues pour notre gène d’intérêt et validées pour QPCR.

J’ai également mon contrôle positif pour le gène d’intérêt et mon contrôle négatif et un échantillon de tissu que j’ai déjà prélevé sur une souris adulte. Maintenant, lorsque vous prélevez votre échantillon de tissu, il est très important d’être extrêmement strict. Lorsque nous prélevons des queues de souris embryonnaires, nous rinçons toujours nos pinces avec de l’éthanol à 70 % avant et avant chaque prélèvement de tissus.

Et nous rinçons toujours les échantillons de queue dans le TBS, vous devez d’abord faire un mélange principal de la préparation des tissus et de l’extraction de l’ADN pour chaque queue, vous allez vouloir 100 microlitres de la solution d’extraction et 25 microlitres de la solution de préparation des tissus. Je vais utiliser mon P 200 et mes pointes de pipette filtrante pour mesurer cent microlitres de solutions d’extraction et 25 microlitres de solution de préparation tissulaire dans un nouveau tube de rph eend. Vous allez vouloir mélanger votre solution de mélange principal en pipetant de haut en bas.

Et donc vous allez vouloir ajouter 125 microlitres de votre mélange principal dans votre intérêt, en vous assurant que s’il s’agit d’une queue de souris adulte, l’extrémité coupée est complètement immergée dans la solution de micro maître et vous pouvez la vortex au doigt et vous l’incubez à température ambiante pendant 10 minutes. Au cours de l’incubation de 10 minutes, je vais préparer mon mélange principal vert préféré, qui comprend le mélange principal vert de cidre qu’ils incluent dans le kit d’eau de qualité milli Q ou PCR, et nos amorces, de l’eau de qualité PCR et nos amorces avant et arrière. Et c’est tout.

Maintenant que l’incubation de 10 minutes est terminée, nous allons devoir chauffer et activer la réaction à 95 degrés pendant trois minutes. Notre inactivation de trois minutes est terminée et nous allons maintenant ajouter la solution de neutralisation fournie dans le kit et nous allons ajouter une centaine de microlitres par réaction et vous allez mélanger cela par vortex. Après avoir ajouté le tampon de neutralisation, vos échantillons d’ADN peuvent être stockés à quatre degrés Celsius jusqu’à ce que vous soyez prêt à les utiliser.

En fait, nous voulons notre génotype tout de suite. On passe donc tout de suite dans le QPCR, comme ça mes queues sont neutralisées et prêtes. Mon master mix PCR cyber green est prêt et j’ai installé mes tubes PCR sur un bloc froid.

Tout ce que je vais faire maintenant, c’est ajouter 16 microlitres de mon mélange principal dans chaque puits, puis ajouter quatre microlitres de l’extrait mutualisé ou quatre microlitres du contrôle positif ou négatif à chacun. Eh bien, tout ce que je fais, c’est ajouter 16 microlitres d’un mélange principal à chacune des richesses. Ensuite, j’ajouterai quatre microlitres de l’extrait neutralisé aux 60 microlitres du mélange maître dans le puits pour un total de 20 microlitres de volume de réaction.

Et je ferai la même chose pour le contrôle positif et négatif. Ajout de quatre microlitres à 16 microlitres avec un mélange maître PPR. Une fois qu’ils sont tous ajoutés, vous pouvez les recouvrir d’une bande de huit capuchons optiquement transparente.

Vous devez faire attention à ne pas toucher la partie optiquement transparente des bouchons qui se trouvent au-dessus de vos échantillons. J’utilise donc une lingette Kim pour appuyer sur les capuchons afin de m’assurer qu’ils sont scellés. J’ai donc doucement vortex notre mélange de PCR et d’ADN et je les ai fait tourner et maintenant nous sommes prêts à les mettre dans la machine QPCR.

Ce que nous allons faire, c’est d’abord charger nos échantillons dans la machine PCR Opticon et je vais créer une nouvelle configuration de plaques, dont notre premier puits sera notre échantillon. Notre deuxième puits sera notre contrôle positif, et notre troisième puits est notre contrôle négatif, spécifiez, trouvez que notre volume de réaction est de 20 microlitres au total. Ensuite, je vais charger un protocole qui a été conçu pour la personne était le génotypage rapide.

Ce protocole implique une étape de dénaturation de trois minutes, un cycle de 15 secondes de dénaturation, 15 secondes d’agenouillement primaire, puis 20 secondes d’extension primaire. Maintenant, le réservoir d’extension principal peut en fait descendre à environ 10 secondes, et cela n’aura qu’un total de 40 secondes. Pour chaque cycle, ces trois étapes se répètent environ 40 fois comme une PCR normale, puis à la fin de celle-ci, nous prenons une courbe de fusion.

Nous avons donc configuré notre plaque et notre protocole est chargé. Tout ce que nous avons à faire maintenant est d’exécuter notre QPCR et cela commence à trois minutes de dénaturation. D’après mon expérience, en utilisant les amorces que j’utilise et en utilisant les échantillons de queue et vous recherchez les gènes que je recherche, je sais que mes points positifs commenceront à apparaître autour de 25 cycles franchissant un seuil de cycle de signification.

Maintenant, le moment où ces croisements dépendent fortement de votre échantillon de tissu, de ce que vous recherchez et de la quantité d’ADN initialement présente. Nous pouvons donc déjà voir que notre contrôle positif est déjà apparu et il semble que notre échantillon soit également positif. Comme vous le voyez, cela commence à apparaître un peu après notre contrôle positif.

Nous allons encore devoir attendre parce qu’il n’en est qu’à 27 cycles, mais j’espère que dans quelques cycles supplémentaires, nous pourrons être sûrs que notre échantillon est positif et je pourrai ensuite poursuivre mon expérience. À ce stade, vous pouvez voir que le contrôle négatif commence tout juste à apparaître, et c’est parce que j’ai pris un excès de queue. Cela vous aide à être sûr que tout ce qui se présente avant cette queue négative excessive sera positif.

Donc, à ce stade, tout ce qui précède le négatif, je le considérerais comme positif et je poursuivrais mon expérience. Une fois le cycle PCR terminé, la machine effectue une analyse de la courbe de fusion. Cela vous aidera à déterminer la composition et la pureté de votre produit.

Grâce à cela, vous pouvez savoir si vous avez correctement choisi les échantillons positifs et négatifs. Par exemple, l’échantillon positif aura un pic de température de fusion spécifique et aigu, qui correspond à un produit PCR spécifique, amplifié. Tout échantillon négatif aura un pic de température de fusion large non spécifique correspondant à l’ADN non spécifique qui a été amplifié pendant la PCR.

Je viens donc de vous montrer comment nous utilisons l’ampli d’extraction Cyber Green de Sigma pour génotyper rapidement les queues de souris adultes. Mais ce kit peut être utilisé avec divers tissus animaux, cheveux, salive, et je l’utilise pour génotypager les queues embryonnaires de souris. Nous aimons utiliser ce kit parce qu’il est rapide.

Je peux récupérer mon génotype en une heure, et c’est très pratique et simple. Alors merci d’avoir regardé et bonne chance.