Pyrosequencing pour l'identification microbienne et Caractérisation

L’objectif global de l’expérience suivante est d’identifier une bactérie par l’analyse de la séquence d’ADN ribosomique 16 s à l’aide de la méthodologie de pyroséquençage. Ceci est réalisé en amplifiant d’abord l’ADN cible par une réaction en chaîne par polymérase à l’aide d’une amorce biotinylée. L’amplicon biotinylé est ensuite immobilisé à l’aide de billes de spheros enrobées de streptavidine et purifié à l’aide de tampons de lavage.

Ensuite, l’amplicon est dénaturé et les amorces de séquençage ribosomique 16 s sont ELL sur les brins uniques d’ADN. L’objectif de cette étape est de préparer l’ADN pour le séquençage. Enfin, la réaction de séquençage de l’ADN a lieu par pyroséquençage, une méthode rapide et précise de séquençage des acides nucléiques basée sur le principe du séquençage par synthèse.

L’alicon biotinylé est utilisé comme matrice par l’ADN polymérase pour incorporer le DN TPS une base à la fois, conduisant à la génération de pyrophosphate. Un TP Sul Uréase convertit proportionnellement le pyrophosphate en A-T-P-A-T-P catalyse la conversion de Lucifer en Lucifer par l’intermédiaire de la luciférase, ce qui génère une lumière proportionnelle à la quantité d’un TP. La lumière est enregistrée comme un pic sur la trace pyro et indique l’incorporation de nucléotides. Les NTP DN non incorporés sont dégradés par apras avant que le DNTP suivant ne soit ajouté pour la poursuite de la synthèse.

Le signal chimiluminescent enregistré sur le programme permet de déterminer la séquence de l’ADN. Les résultats obtenus sont des séquences ribosomales 16 SDNA, qui sont utilisées pour identifier la bactérie par comparaison avec une base de données de référence d’ADN ribosomique. Le pyroséquençage est une technique polyvalente qui facilite le séquençage du génome microbien et peut être utilisée pour identifier les espèces bactériennes, discriminer les souches bactériennes et détecter les mutations génétiques qui confèrent une résistance aux agents antimicrobiens.

Dans cette vidéo, la procédure de génération d’amplicon bactérien, le pyroséquençage d’amplicon et l’analyse de la séquence d’ADN seront démontrés Pour commencer la procédure d’amplification de la matrice, décongelez toutes les solutions requises et mélangez soigneusement chacune d’elles. Tous les travaux peuvent être effectués à température ambiante. Configurez la réaction PCR selon ce tableau.

Notez qu’une concentration finale de chlorure de magnésium de 1,5 millimolaire donnera des résultats satisfaisants dans la plupart des cas. Cependant, si une concentration plus élevée de magnésium est nécessaire jusqu’à 3,5 microlitres de 25 millimolaires, du chlorure de magnésium peut être ajouté à une réaction. Un apprêt doit être biotinylé à son extrémité cinq principales, et il est recommandé que l’apprêt soit purifié à fond par HPLC.

Mélangez le mélange réactionnel en pipetant doucement de haut en bas, puis distribuez les volumes appropriés dans des tubes PCR. Ensuite, ajoutez de l’ADN modèle à chaque tube PCR. 10 nanogrammes d’ADN génomique par réaction sont recommandés.

Placez les tubes PCR dans un cycleur et démarrez ce programme de cyclage avant de faire le mélange principal. Faites tourner le flacon de perles de seros streptococciques et enrobées pour assurer une suspension homogène. Faites un master mix selon cet organigramme.

Combinaison de billes, d’un tampon de liaison et d’eau de haute pureté dans un microtube à centrifuger. En fonction du volume de produit PCR utilisé, 60 à 75 microlitres de mélange maître ont été distribués dans chaque puits d’une plaque PCR, de sorte que le volume total soit de 80 microlitres par puits. Ajoutez cinq à 20 microlitres de produit PCR biotinylé dans chaque puits.

Le volume par puits devrait maintenant être de 80 microlitres. Scellez les puits avec des capuchons à bande et agitez la plaque PCR à 1 400 tr/min pendant cinq à 10 minutes à température ambiante à l’aide d’un agitateur orbital. Commencez cette procédure en diluant les amorces de séquençage à 0,3 micromolaire avec un tampon à genoux et en distribuant 25 microlitres dans chaque puits de la plaque de réaction.

Positionnez la plaque sur le poste de travail sous vide. Remplissez les cavités du poste de travail selon ce schéma. 50 millilitres d’éthanol à 70 % dans l’auge, un 40 millilitres de solution de dénaturation dans l’auge deux, 50 millilitres de tampon de lavage dans l’auge, trois 50 millilitres d’eau de haute pureté dans l’auge quatre et 70 millilitres d’eau de haute pureté dans l’auge cinq.

Allumez la pompe à vide et assurez-vous que l’interrupteur de l’outil à vide est réglé sur on flush les sondes de filtre avec de l’eau de haute pureté. Dans l’auge cinq, positionnez la plaque PCR avec les billes sur le poste de travail en vous assurant que les plaques PCR et de réaction sont dans la même orientation. Abaissez l’outil à vide dans les puits de la plaque PCR.

Pendant 20 secondes ou jusqu’à ce que tout le volume ait été aspiré, les billes seront capturées par l’outil d’aspiration avec l’aspirateur toujours en place. Rincez l’outil avec de l’éthanol à 70 % pendant 20 secondes ou jusqu’à ce que tout le volume ait été aspiré. Ensuite, rincez l’outil avec une solution de dénaturation pendant 20 secondes ou jusqu’à ce que tout le volume ait été aspiré.

Après cela, rincez l’outil avec un tampon de lavage pendant 20 secondes ou jusqu’à ce que tout le volume ait été aspiré avec l’aspirateur toujours en place. Soulevez l’outil à plus de 90 degrés verticaux pendant cinq secondes pour permettre à tout le liquide de s’écouler de l’outil à vide. Éteignez maintenant la pompe et alignez l’outil d’aspiration avec trois plaques de réaction.

Abaissez l’outil d’aspiration dans les puits. Ensuite, secouez doucement d’un côté à l’autre pendant environ 10 secondes pour libérer les billes dans les puits contenant l’amorce de séquençage. Placez l’outil d’aspiration dans l’abreuvoir pour le nettoyage afin d’ajuster l’amorce de séquençage à l’ADN.

Placez la plaque de réaction dans un support de plaque de préchauffage. Chauffez la plaque à 80 degrés Celsius pendant deux minutes. Retirez la plaque du support et placez-la sur le comptoir pour la refroidir à température ambiante pendant cinq minutes.

Commencez cette procédure en allumant l’instrument à l’aide de l’interrupteur d’alimentation situé au-dessus du cordon d’alimentation pour déterminer les volumes nécessaires. Configurez un fichier d’exécution dans le logiciel de l’instrument et, dans le menu Outils, sélectionnez Informations de pré-exécution. Remplissez une cartouche en suivant les instructions fournies dans la page d’information de pré-exécution.

Placez la pointe de la pipette dans le coin de chaque puits aussi bas que possible, en veillant à ce qu’il n’y ait pas de bulles d’air. Ouvrez le couvercle de la cartouche et insérez-la avec l’étiquette vers l’avant. Assurez-vous que la cartouche est correctement insérée et fermez le portail.

Ouvrez le cadre de support de la plaque et positionnez la plaque de réaction à l’intérieur de l’instrument. Fermez le cadre de support de la plaque et le couvercle de l’instrument. Insérez la clé USB avec les fichiers d’exécution créés avec le logiciel de l’instrument dans le port USB situé à l’avant de la presse à instruments.

D’accord pour voir le menu des fichiers d’exécution souhaités. Utilisez les flèches de défilement pour sélectionner le fichier d’exécution souhaité et appuyez sur Sélectionner. Lorsque tous les niveaux de pression et de température prédéfinis sont atteints, l’instrument commence à distribuer des réactifs pendant un cycle.

L’écran de l’instrument affiche le pyro du puits sélectionné en temps réel. Utilisez les flèches de défilement pour voir les pyros des autres puits. Lorsque l’instrument confirme que la course est terminée et que le fichier de course a été enregistré sur la clé USB, appuyez sur fermer.

Retirez la clé USB. Les résultats d’un pyroséquençage typique sont présentés ici. Les amorces PCR directes et inverses sont conçues pour les régions conservées de la matrice d’ADN, qui est la séquence ribosomique de 16 s.

Dans cet exemple, l’amorce de séquençage est positionnée immédiatement en amont d’une séquence d’ADN hypervariable bien caractérisée dans l’amplicon représenté en bleu. Cette séquence hypervariable permet l’identification bactérienne d’un grand nombre d’espèces bactériennes en utilisant l’amorce de séquençage conservée comme contrôle de qualité interne, la séquence d’ADN encadrant la région variable peut être vérifiée pour s’assurer que la bonne région d’ADN a été analysée. Le logiciel de pyroséquençage permet de comparer et d’aligner la séquence générée sur une base de données interne de séquences ribosomales bactériennes pour l’identification bactérienne.

De plus, une séquence peut être analysée pour déterminer les mutations qui confèrent une résistance aux antibiotiques. Par exemple, l’analyse des mutations dans les gènes ribosomiques 23 s d’helicobacter pylori révèle deux modèles de mutation, GAA ou un GA, qui confèrent une résistance aux antibiotiques. Le pyroséquençage est une technique polyvalente qui facilite le séquençage du génome microbien.

Les avantages du pyroséquençage des applications microbiologiques comprennent un criblage rapide et fiable à haut débit et une identification précise des microbes et des mutations du génome microbien. De plus, la méthodologie de pyroséquençage permet d’analyser toute la diversité génétique de la résistance aux médicaments antimicrobiens, y compris le typage des mutations ponctuelles, des insertions et des délétions des SNP, ainsi que la quantification de plusieurs copies de gènes qui peuvent se produire dans certains profils de résistance aux antimicrobiens. Merci d’avoir regardé cette vidéo et bonne chance pour vos expériences de séquençage.