Preparación y transformación de bacterias mediante electroporación de alto voltaje

Comience con un tubo que contenga bacterias inoculadas en un medio nutritivo.

Incubar agitando hasta que las células alcancen la fase de división activa.

Centrifugar para recoger las células y desechar el sobrenadante.

Lave repetidamente las células con glicerol helado para eliminar las sales y vuelva a suspender en glicerol para mantener la viabilidad celular.

Prepare un plásmido que contenga un gen de resistencia a los antibióticos en agua estéril con EDTA para evitar la degradación del ADN.

Mezcle la solución plásmida con las células bacterianas.

Aplique un pulso corto de alto voltaje para crear poros temporalmente en la membrana bacteriana.

Esto permite que el ADN plasmídico ingrese al citoplasma.

Transfiera inmediatamente las células a un medio de recuperación e incube agitando.

Los componentes del medio apoyan la reparación de membranas y la expresión génica de resistencia a antibióticos codificada por plásmidos.

Extienda las células en agar nutritivo que contenga el antibiótico e incube hasta que se formen colonias.

Elija una sola colonia y colóquela en una placa nueva para purificar los transformadores.

Para comenzar el experimento, prepare células electrocompetentes de las 10 cepas principales de E. coli .

Transfiera una sola colonia a un mililitro de medios LB. Incube el tubo a 37 grados centígrados mientras agita a 180 RPM. Diluir el precultivo a 500 en 25 mililitros de medio LB fresco e incubar el cultivo a 37 grados Celsius hasta que alcance la fase logarítmica 0,6 OD. Centrifugar la suspensión celular a 5.000 RPM durante 20 minutos.

Después de la centrifugación, vuelva a suspender el gránulo en 25 mililitros de 10% de volumen por volumen, agua de glicerol estéril helada y repita este paso cuatro veces, teniendo el volumen de resuspensión cada vez hasta alcanzar 1,5 mililitros.

A continuación, vuelva a suspender el gránulo en glicerol al 10% y divida la suspensión celular en alícuotas de 50 microlitros. Almacene las alícuotas a 80 grados centígrados negativos hasta por seis meses. Para continuar con el experimento, disuelva el plásmido deseado en agua estéril suplementada con EDTA 0,5 milimolares y descongele una alícuota de células electrocompetentes en hielo.

Agregue de 2,5 a 5 nanogramos de vector y mezcle las células descongeladas. Dispense las células en una cubeta de 0,1 centímetros. Aplique un pulso de 1,8 kilovoltios a las celdas e inmediatamente transfiera las celdas electroporadas a un mililitro de medio SOC.

Incube las células mientras agita durante una hora, transfiera alícuotas de 100 microlitros a placas de Petri que contengan agar LB y antibiótico, e incube las células durante la noche a 37 grados centígrados. Purifica los transformadores rayando colonias individuales en placas de Petri.