Cambios morfológicos de imagen en bacterias mediante microscopía de fluorescencia de células vivas

Comienza con un cultivo bacteriano inmovilizado bajo una losa de agarosa en un plato de fondo de cristal.

Las membranas celulares bacterianas están marcadas con un colorante fluorescente.

Las bacterias también están diseñadas para expresar un ARN antisentido que se dirige a un ARNm específico, inhibiendo la producción de una proteína esencial de división celular.

Añade una gota de aceite de inmersión al objetivo del microscopio de fluorescencia invertida.

Coloca el plato en una carcasa metálica y fíjalo en el escenario del microscopio.

Sube el objetivo hasta que el aceite toque el plato, luego céntrate en las células.

Utiliza software de imagen para configurar pilas Z y capturar imágenes a múltiples profundidades.

Comienza a adquirir imágenes de fluorescencia en time-lapse.

A medida que las células responden a la expresión del ARN antisentido, no se dividen y desarrollan formas hinchadas.

La organización de la membrana se altera, lo que provoca una fluorescencia desigual y focal que indica una división celular defectuosa.

Para obtener imágenes de la muestra, utiliza el botón de enfoque de ajuste grueso para asegurarte de que el objetivo está completamente bajado antes de inicializar el microscopio dentro del software del microscopio. Coloca una gota de aceite de índice de refracción de 1,517 en el objetivo de inmersión en aceite 100X y transfiere el plato de fondo de cristal que contiene la muestra al ataúd metálico de la carcasa.

Deslízate suavemente el plato hacia la abrazadera del palco y utiliza el mando de ajuste grueso para elevar el objetivo hasta que el aceite toque el fondo de cristal del plato. Usa el ocular y el botón de ajuste fino para enfocar la muestra, y cambia a modo cámara. En el software de imagen de la ventana Resolve 3D, selecciona el icono de Diseño/Ejecutar experimento.

Aparecerá un nuevo cuadro de diálogo titulado Diseñar/Ejecutar Experimento. Abre las pestañas de Diseño y Seccionamiento en el cuadro de diálogo para establecer el número de Z pilas y el grosor de la muestra. Para medir el grosor de las celdas en la muestra, ajusta incrementalmente el plano Z usando las flechas arriba y abajo en el cuadro de diálogo de Resolve 3D, estableciendo el punto de desenfoque de las celdas como límite superior e inferior para la Adquisición de Imagen.

Después de ajustar el porcentaje de transmisión de la intensidad de luz y la duración de la exposición para los canales seleccionados en el cuadro de diálogo de Resolver 3D, haz clic en Lista de Puntos para abrir la Lista de Puntos. En las pestañas de Diseño y Time Lapse, seleccione la casilla de verificación Time Lapse e introduzca los parámetros de time lapse. Selecciona la opción de lista de Puntos de Visita e introduce los puntos a imaginar en el cuadro de texto, separando los puntos por comas o guiones para secuencias completas.

Luego, edita los nombres y ubicaciones de los archivos en la pestaña Ejecutar y selecciona Reproducir en el cuadro de diálogo Comenzar el experimento para iniciar el experimento.