Name: Imágenes de células vivas de Bacillus subtilis Y Streptococcus pneumoniae Automatizada utilizando Time-lapse microscopía (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 31 s
Description: Aprende a realizar microscopía de fluorescencia time-lapse automatizada para visualizar células bacterianas vivas de Bacillus subtilis y Streptococcus pneumoniae. Este método permite estudiar la dinámica celular y el desarrollo de colonias microbianas.

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El trabajo en el grupo de JWV con el apoyo de una beca de la UE Marie-Curie Reintegración, una beca Sysmo2 (NWO-ALW/ERASysBio), un horizonte de subvención (ZonMW) y por una beca VENI (NWO-ALW). El grupo de OPK con el apoyo de varias subvenciones STW (NWO), un SYSMO1 (IGdeJ) y SYSMO2 subvención, las FSE Eurocores biología sintética, la subvención (SynMod) y por el Centro de Genómica Kluyver de Fermentaciones Industriales y el Instituto superior de Alimentación y Nutrición.

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<li>Martin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+recA+gene+of+Streptococcus+pneumoniae+is+part+of+a+competence-induced+operon+and+controls+lysogenic+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The recA gene of Streptococcus pneumoniae is part of a competence-induced operon and controls lysogenic induction.</a> Mol Microbiol. 15, 367-367 (1995).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

En contraste con muchas otras técnicas de célula única, el método de time-lapse microscopía de fluorescencia se describe aquí se puede utilizar para seguir la historia de una celda específica en relación con sus antepasados, su comportamiento, y eventos de la división. En combinación con los promotores objetivo marcado con fluorescencia o las proteínas, la activación específica vía de desarrollo puede ser seguido en el tiempo y localización de la proteína, así como la dinámica de proteínas pueden ser monitoreados durante el desarrollo de bacterias. Como se indicó anteriormente, los estudios se concentra en diferentes especies bacterianas se pueden realizar mediante la adaptación de las condiciones de crecimiento de acuerdo a los requerimientos de una bacteria específica. Las únicas limitaciones que encontramos están relacionados con las condiciones de crecimiento y tamaño de la muestra. Debido a un entorno cerrado, las condiciones del medio no se puede cambiar durante el experimento. Además, un máximo de cuatro cepas por experimento se puede controlar de manera eficiente. Teniendo en cuenta algunas medidas críticas, el método de análisis de células individuales se describe aquí se puede aplicar fácilmente utilizando cualquier microscopio automatizado. En el siguiente, un resumen de los pasos críticos se les dará. La información detallada se puede encontrar en el texto principal de preparación general:. Es una buena idea para comprobar los ajustes de enfoque automático necesarios para una bacteria específica antes del experimento. Asimismo, se aproximan a los valores óptimos para la visualización de la fluorescencia debe ser determinada de antemano, si es posible. Además, después de un preparado de línea de tiempo ayuda a tener todo el material listo para su uso en el tiempo (pre-calentamiento de la cámara del microscopio, la programación de la configuración de microscopio, la preparación de la diapositiva una hora antes de que las células se encuentran en la fase de crecimiento deseado, ver Figura 1) . Crecimiento de la B. subtilis en TLM y el MDL: TLM y el MDL son químicamente definido los medios de comunicación en la que el hambre B. subtilis sólo crece lentamente. El período de tiempo en el que las células se cultivan en los medios de comunicación podría tener que prolongarse dependiendo de la cepa específica. El lento crecimiento impide que las células acumulan unos sobre otros Preparación de la muestra microscopio:. Burbujas de aire entre la estructura del gen, la lámina de vidrio y la hoja de la cubierta tiene que ser prevenida para evitar la sequedad amplia del medio de agarosa-based. Lo mismo vale para la interfaz de deslizamiento medio / cover. Es crucial que las células lo suficientemente seco para evitar la natación y / o el crecimiento de capas múltiples Time-lapse microscopía de fluorescencia:. Pre-calentamiento de la lámina, así como la cámara del medio ambiente es crucial para evitar mayores problemas de enfoque automático. Las células deben ser seleccionados en el medio de una almohadilla de agar, ya que estos tienen la mayor probabilidad de permanecer en el campo y centrarse en el experimento (siempre que la muestra se secó lo suficiente). Un máximo de 10 puntos por los experimentos todavía funciona correctamente. Después de haber seleccionado la primera celda de interés sólo utilizar el software para ajustar el enfoque (véase el texto para más detalles). Comprobar si las células están todavía en el foco durante las primeras horas del experimento, en intervalos de 30 minutos. Análisis: Es importante comprobar antes de los procedimientos de análisis más amplio si el fondo del medio tiene valores similares en los canales de fluorescencia. Pequeñas partículas de polvo, los componentes del medio, las lentes sucios o pequeños grupos de agarosa pueden contribuir a la fluorescencia a nivel local aumentó, lo que hace la película de difícil o imposible de analizar Resolución de problemas:. Si las células crecen en la parte superior de la otra, esta bien podría indicar que el cubreobjetos se adjunta demasiado pronto o que el medio no es adecuado para el crecimiento de las monocapas microcolonias. Si las células de interés continuamente mueren de forma prematura, mientras que otras células en el portaobjetos se dividen felizmente, es posible que desee comprobar si se pone el filtro UV en la posición. También podría ayudar a disminuir el tiempo de exposición o la intensidad de la luz durante los experimentos de largo.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios (opcional) </th></tr><tr><td> Gene marco </td><td> ABgene </td><td> AB-0578 </td><td> 1,7 x 2,8 cm </td></tr><tr><td> de alta resolución de baja fusión de agarosa </td><td> Sigma </td><td> A4718 </td><td></td></tr><tr><td> cubreobjetos grande </td><td> varios </td><td></td><td> 24 x 50 mm </td></tr><tr><td> Si lo desea, la membrana de colorante, por ejemplo, FM 5-95 </td><td> Invitrogen </td><td> T23360 </td><td> otros tintes membrana también están disponibles: <a href="http://probes.invitrogen.com/media/pis/mp34653.pdf">http://probes.invitrogen.com/media/pis/mp34653.pdf</a> </td></tr><tr><td> Time-lapse microscopio con cámara ambiental </td><td> varios </td><td></td><td> ver los detalles de nuestro dispositivo en las secciones correspondientes </td></tr></tbody></table>

imágenes de células vivas de bacillus subtilis y streptococcus pneumoniae automatizada utilizando time-lapse microscopía

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

Durante los últimos años los científicos se convirtió cada vez más conscientes de que los datos medios obtenidos de los experimentos basados ​​en la población microbiana no son representativos de la conducta, el estado o el fenotipo de las células individuales. Debido a esta nueva visión de la serie de estudios célula aumenta continuamente (para una revisión reciente ver 1,2,3). Sin embargo, muchas de las técnicas aplicadas sola célula no permiten seguir la evolución y el comportamiento de una celda específica único en el tiempo (por ejemplo, la citometría de flujo o microscopía estándar). Aquí, le ofrecemos una descripción detallada de un método de microscopía utilizado en varios estudios recientes 4, 5, 6, 7, lo que permite seguir y registrar (fluorescencia de) las células bacterianas individuales de Bacillus subtilis y Streptococcus pneumoniae a través del crecimiento y la división de muchas generaciones. Las películas resultantes pueden ser utilizados para construir los árboles filogenéticos se remontan al linaje de la historia de una sola célula dentro de una población que se originaron de un ancestro común. Este método de fluorescencia time-lapse microscopía no sólo pueden ser utilizados para investigar el crecimiento, la división y diferenciación de las células individuales, sino también para analizar el efecto de la historia de la célula y la ascendencia en el comportamiento celular específica. Además, time-lapse microscopio es ideal para examinar la dinámica de la expresión génica y localización de la proteína durante el ciclo celular de las bacterias. El método se explica cómo preparar las células bacterianas y la construcción del portaobjetos para permitir la derivación de células individuales en un microcolonias. En resumen, las células individuales son vistos en una superficie semi-sólido que consiste en el medio de cultivo complementado con la agarosa en el que crecen y se dividen en un microscopio de fluorescencia en una cámara de temperatura ambiental controlada. Las imágenes se capturan en intervalos específicos y posteriormente se analizaron mediante el software de código abierto ImageJ.

Este protocolo establece un procedimiento paso a paso para controlar el comportamiento de células individuales de bacterias diferentes en el tiempo el uso automatizado de fluorescencia time-lapse microscopía. Además, proporcionar directrices a analizar las imágenes de microscopía.

Imágenes de células vivas de Bacillus subtilis Y Streptococcus pneumoniae Automatizada utilizando Time-lapse microscopía

Durante los últimos años, los científicos se han vuelto cada vez más conscientes de que los datos promedio obtenidos de experimentos basados en poblaciones microbianas no son...

El objetivo general de este procedimiento es obtener imágenes de células vivas durante su crecimiento y división mediante microscopía de fluorescencia, para así estudiar el efecto de la historia y la ascendencia celular en el desarrollo bacteriano. Esto se logra primero transfiriendo las células desde un medio líquido con concentraciones relativamente altas de nutrientes a un medio líquido de carencia nutricional. A continuación, se utiliza una lámina microscópica sobre la cual las células bacterianas crecerán formando un microcolonia.Se prepara un monocapa. Luego se registra una película de microscopía de fluorescencia con intervalos de tiempo. Finalmente, se procesa la película y se analizan los datos.En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran el desarrollo de una sola célula bacteriana a través de microscopía de fluorescencia con intervalos de tiempo. La principal ventaja de esta técnica frente a técnicas existentes como la citometría de flujo y la microscopía estándar es que permite el monitoreo de la dinámica de proteínas, el comportamiento celular y el desarrollo de células individuales en el tiempo, demostrando el procedimiento estará en cone, un estudiante de doctorado de mi laboratorio. Para preparar b tuus, inocule células provenientes de stocks a menos 80 grados Celsius en 10 mililitros de medio para microscopía con intervalos de tiempo o medio TLM en frascos Erlenmeyer estériles suplementados con antibióticos si es necesario, cultive las células durante la noche a 30 grados Celsius y 225 RPM en un frasco Erlenmeyer estéril. A la mañana siguiente, siembre las células de uno a 10 en medio químicamente definido o CDM precalentado sin antibióticos, cultive las células de bee subtlest hasta la fase exponencial media, lo que toma aproximadamente cuatro horas. Mida la absorbancia del cultivo a 600 nanómetros y diluya las células hasta un valor aproximado de a 600 de 0.035.Uso de CDM. Esta DO asegura que se depositen células individuales con espaciamiento adecuado entre ellas sobre la lámina de microscopio para la microscopía de lapso de tiempo. Una hora antes de que las células alcancen el crecimiento exponencial medio.Prepare el portaobjetos de microscopio limpiando dos portaobjetos de vidrio con etanol al 70 % y agua. Retire una de las cubiertas plásticas de un marco genético, teniendo cuidado de no desarmar la cubierta plástica del otro lado del marco. Fije el marco genético en el centro de uno de los portaobjetos de vidrio pegándolo primero a un lado y luego guiando el resto con la uña.Utilice un microondas para disolver 150 miligramos de agarosa de alta resolución y punto de fusión bajo en 10 mililitros de CDM. Asegúrese de que la agarosa se disuelva completamente para evitar la fluorescencia de fondo. Pipetee 500 microlitros del CDM de agarosa tibio en el centro del marco genético, asegurándose de que toda el área, incluyendo los bordes, quede completamente cubierta.Trabaje rápidamente para evitar el secado excesivo de los aros. Coloque la segunda portaobjetos sobre el marco de genes Aros CDM lleno, intentando evitar burbujas de aire. Coloque el sándwich en posición horizontal a cuatro grados Celsius durante 45 minutos para permitir que los agros se solidifiquen suficientemente.Una vez que el aros se haya solidificado cuidadosamente, deslice el vidrio superior. Utilice una cuchilla de afeitar para recortar tiras de aros de aproximadamente cinco milímetros de ancho sobre las cuales crecerán las bacterias. Se pueden usar un máximo de tres tiras por portaobjetos, separadas por espacios de aproximadamente cuatro milímetros a cada lado.Estos espacios proporcionarán aire, que es esencial para el crecimiento de Blu. Retire con cuidado la segunda y última cubierta de plástico del marco genético para exponer el lado adhesivo. Cargue células individuales en aproximadamente 2,5 microlitros de líquido sobre el medio sólido, comenzando en la parte superior del cojín de agros sin tocarlo.Con la punta de la pipeta, permita que el medio se distribuya uniformemente inclinando la placa hacia arriba y hacia abajo. Coloque un cubreobjetos limpio sobre el marco genético para fijar completamente el cubreobjetos. Utilice la uña para aplicar presión una vez que las células hayan sido cargadas.Es fundamental esperar a que el líquido se seque el tiempo suficiente para evitar células móviles y crecimiento en múltiples capas. Sin embargo, si las células se secan durante demasiado tiempo, tendrán problemas para crecer formando una monocapa de microcolonias. Por lo tanto, el tiempo necesario para secar las portaobjetos depende del experimento y no puede medirse.Y, por consiguiente, por supuesto, es necesario adquirir una sensación práctica al respecto. Para prevenir problemas de enfoque automático durante las primeras horas del experimento de microscopía de lapso de tiempo, caliente previamente la preparación durante una hora a 30 grados Celsius para prepararla para la microscopía de lapso de tiempo. Caliente previamente la cámara ambiental al menos dos horas. Antes del inicio del experimento, seleccione los filtros del objetivo y el espejo dicróico adecuados según su configuración experimental.Para experimentos prolongados, asegúrese de colocar un filtro UV entre la fuente de luz y la muestra. Además, si es posible, bloquee parte de la luz de excitación utilizando filtros de densidad neutra para minimizar la exposición. Programe el experimento de acuerdo con la configuración experimental específica.Es recomendable determinar la cantidad de luz necesaria para construccos específicos, así como los ajustes de enfoque automático para otros microscopios de lapso de tiempo o bacterias, antes del experimento real. Tiempos de exposición más cortos y niveles más bajos de luz de excitación minimizarán el blanqueo y la fototoxicidad. Utilice luz escópica para la función de enfoque automático. Finalmente, coloque el portaobjetos preparado en la cámara ambiental precalentada del microscopio y supervise el crecimiento de células individuales hasta formar una monocapa de microcolonias a 30 grados Celsius.Un experimento de fluorescencia con lapse de tiempo exitoso producirá una monocapa de microcolonias ubicada completamente dentro del campo de visión. Al final del experimento en esta película, el campo brillante está a la izquierda y se puede observar la fluorescencia a la derecha.Aquí se muestra un ejemplo de una microcolonia de B subtiles en la que algunas células crecieron unas encima de otras, lo que dificulta reconstruir con precisión su historia y medir correctamente sus niveles de fluorescencia. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar exitosamente una muestra microscópica para microscopía de intervalos y cómo realizar una microscopía de fluorescencia de intervalos. Experimente con células BACE.

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Fuente: Makowski, Ł., et al. Imagen de células vivas del ciclo de vida del depredador bacteriano Bdellovibrio bacteriovorus mediante microscopía de fluorescencia en lapso de tiempo. J. Vis. Exp. (2020)Este vídeo demuestra imágenes de fluorescencia en lapso de tiempo de Bdellovibrio bacteriovorus que se alimentan de E. coli inmovilizada bajo una almohadilla de agarosa, permitiendo la visualización en tiempo real de la replicación intracelular y la liberación de descendencia para estudiar la...

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