Imágenes de células vivas de Bacillus subtilis Y Streptococcus pneumoniae Automatizada utilizando Time-lapse microscopía

El objetivo general de este procedimiento es obtener imágenes de células vivas a través del crecimiento y la división mediante microscopía de fluorescencia para poder estudiar el efecto de la historia y la ascendencia celular en el desarrollo celular de las bacterias. Esto se logra transfiriendo primero las células de un medio líquido con concentraciones de nutrientes relativamente altas a un medio líquido de inanición. A continuación, un portaobjetos microscópico en el que las células bacterianas se convertirán en una microcolonia.

Se prepara la monocapa. A continuación, se graba una película de microscopía de fluorescencia de lapso de tiempo. Finalmente, se procesa la película y se analizan los datos.

En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran el desarrollo de una sola célula bacteriana a través de la microscopía de fluorescencia de lapso de tiempo. La principal ventaja de esta técnica sobre las técnicas existentes, como la citometría de flujo y la microscopía estándar, es que permite el seguimiento de la dinámica de las proteínas, el comportamiento celular y el desarrollo de células individuales en el tiempo, demostrando que el procedimiento será en cono, un estudiante de doctorado de mi laboratorio para preparar células inocular a menos 80 grados centígrados, almacenes en 10 mililitros de microscopía de lapso de tiempo o medio TLM en matraces de agitación estériles suplementados con antibióticos si es necesario, haga crecer las células durante la noche a 30 grados Celsius y 225 RPM en un matraz de agitación estéril a la mañana siguiente para saquear las células de una a 10 en precalentamiento, medio químicamente definido o CDM sin antibióticos, haga crecer las células más sutiles de la abeja hasta la fase exponencial media, que tarda aproximadamente cuatro horas. Mida la absorbancia del cultivo a 600 nanómetros y diluya las células hasta un aproximado de 600 de 0,035.

Uso de CDM. Este diámetro exterior garantiza que las células individuales con el espaciado adecuado entre ellas se detecten en el portaobjetos del microscopio para la microscopía de lapso de tiempo. Una hora antes de que las células alcancen un crecimiento exponencial medio.

Prepare el portaobjetos del microscopio limpiando dos portaobjetos de vidrio con etanol al 70% y agua. Retire una de las cubiertas de plástico de un marco genético, teniendo cuidado de no provocar el desmontaje de la cubierta de plástico en el otro lado del marco. Coloque el marco genético en el centro de uno de los portaobjetos de vidrio pegándolo primero a un lado y luego guiando el resto con una uña.

Use un microondas para disolver 150 miligramos de aros de alta resolución y bajo punto de fusión. En 10 mililitros de CDM, asegúrese de que el aros esté completamente disuelto para evitar la fluorescencia de fondo. Pipetee 500 microlitros del agro CDM caliente en el centro del marco genético, asegurándose de que toda el área, incluidos los bordes, esté completamente cubierta.

Trabajando rápidamente para evitar el secado excesivo de los aros. Coloque el segundo portaobjetos de vidrio en el marco genético lleno de Aros CDM tratando de evitar las burbujas de aire. Coloque el sándwich en posición horizontal a cuatro grados centígrados durante 45 minutos para permitir que los agros se solidifiquen lo suficiente.

Una vez que el aros se haya solidificado con cuidado, deslice el vidrio superior. Use una hoja de afeitar para cortar tiras agrícolas de unos cinco milímetros de ancho en las que crecerán las bacterias. Se puede utilizar un máximo de tres tiras por portaobjetos, separadas por espacios de unos cuatro milímetros a cada lado.

Estos espacios proporcionarán aire, que es esencial para el crecimiento de Blu. Retire con cuidado la segunda y última cubierta de plástico del marco genético para exponer el lado pegajoso. Cargue celdas individuales en aproximadamente 2,5 microlitros de líquido en el medio sólido, comenzando en la parte superior de la almohadilla agros sin tocarla.

Con la punta de la pipeta, deje que el medio se extienda uniformemente inclinando el portaobjetos hacia arriba y hacia abajo. Coloque una cubierta de microscopio limpia en el marco genético para fijar completamente el cubreobjetos. Use una uña para aplicar presión después de que se hayan cargado las celdas.

Es crucial esperar a que el líquido se seque el tiempo suficiente para que no se formen células nadadoras y crezca en múltiples capas. Sin embargo, si las células se secan durante demasiado tiempo, tendrán problemas para convertirse en una monocapa de micro cholones. Por lo tanto, el tiempo necesario para secar los portaobjetos depende del experimento y no se puede medir.

Y, en consecuencia, uno por supuesto necesita tener una idea de ello: para evitar problemas de enfoque automático durante las primeras horas del experimento de lapso de tiempo, precaliente el portaobjetos durante una hora a 30 grados centígrados para prepararse para la microscopía de lapso de tiempo. Precaliente la cámara ambiental al menos dos horas. Antes del inicio del experimento, seleccione los filtros de objetivo y el espejo dicroico apropiados de acuerdo con su configuración experimental.

Para experimentos largos, asegúrese de que se coloque un filtro UV entre la fuente de luz y la muestra. Además, si es posible, bloquee parte de la luz de excitación con filtros de densidad neutra para minimizar la exposición. Programe el experimento de acuerdo con la configuración experimental específica.

Es aconsejable determinar la cantidad de luz necesaria para construcciones específicas, así como los ajustes de enfoque automático para otros microscopios de lapso de tiempo o bacterias antes del experimento real. Los tiempos de exposición más cortos y los niveles más bajos de luz de excitación minimizarán el blanqueo y la fototoxicidad Utilice luz scópica para la función de enfoque automático. Finalmente, coloque el portaobjetos preparado en la cámara ambiental precalentada del microscopio y controle el crecimiento de células individuales en una monocapa de microcolonia a 30 grados Celsius.

Un experimento exitoso de fluorescencia de lapso de tiempo producirá una monocapa de microcolonia completamente ubicada dentro del campo de visión. Al final del experimento de esta película, el campo claro está a la izquierda y se puede ver fluorescencia. A la derecha.

Este es un ejemplo de una microcolonia de B Subtles en la que algunas células crecieron una encima de la otra, lo que dificulta el seguimiento preciso de su historia, así como la medición correcta de sus niveles de fluorescencia. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar con éxito una muestra microscópica para la microscopía de lapso de tiempo y cómo realizar una microscopía de fluorescencia de lapso de tiempo. Experimenta con células BACE.