Imágenes de células vivas de Bacillus subtilis Y Streptococcus pneumoniae Automatizada utilizando Time-lapse microscopía
28 de julio de 2011
Este protocolo establece un procedimiento paso a paso para controlar el comportamiento de células individuales de bacterias diferentes en el tiempo el uso automatizado de fluorescencia time-lapse microscopía. Además, proporcionar directrices a analizar las imágenes de microscopía.
El objetivo general de este procedimiento es obtener imágenes de células vivas durante su crecimiento y división mediante microscopía de fluorescencia, para así estudiar el efecto de la historia y la ascendencia celular en el desarrollo bacteriano. Esto se logra primero transfiriendo las células desde un medio líquido con concentraciones relativamente altas de nutrientes a un medio líquido de carencia nutricional. A continuación, se utiliza una lámina microscópica sobre la cual las células bacterianas crecerán formando un microcolonia.
Se prepara un monocapa. Luego se registra una película de microscopía de fluorescencia con intervalos de tiempo. Finalmente, se procesa la película y se analizan los datos.
En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran el desarrollo de una sola célula bacteriana a través de microscopía de fluorescencia con intervalos de tiempo. La principal ventaja de esta técnica frente a técnicas existentes como la citometría de flujo y la microscopía estándar es que permite el monitoreo de la dinámica de proteínas, el comportamiento celular y el desarrollo de células individuales en el tiempo, demostrando el procedimiento estará en cone, un estudiante de doctorado de mi laboratorio. Para preparar b tuus, inocule células provenientes de stocks a menos 80 grados Celsius en 10 mililitros de medio para microscopía con intervalos de tiempo o medio TLM en frascos Erlenmeyer estériles suplementados con antibióticos si es necesario, cultive las células durante la noche a 30 grados Celsius y 225 RPM en un frasco Erlenmeyer estéril. A la mañana siguiente, siembre las células de uno a 10 en medio químicamente definido o CDM precalentado sin antibióticos, cultive las células de bee subtlest hasta la fase exponencial media, lo que toma aproximadamente cuatro horas. Mida la absorbancia del cultivo a 600 nanómetros y diluya las células hasta un valor aproximado de a 600 de 0.035.
Uso de CDM. Esta DO asegura que se depositen células individuales con espaciamiento adecuado entre ellas sobre la lámina de microscopio para la microscopía de lapso de tiempo. Una hora antes de que las células alcancen el crecimiento exponencial medio.
Prepare el portaobjetos de microscopio limpiando dos portaobjetos de vidrio con etanol al 70 % y agua. Retire una de las cubiertas plásticas de un marco genético, teniendo cuidado de no desarmar la cubierta plástica del otro lado del marco. Fije el marco genético en el centro de uno de los portaobjetos de vidrio pegándolo primero a un lado y luego guiando el resto con la uña.
Utilice un microondas para disolver 150 miligramos de agarosa de alta resolución y punto de fusión bajo en 10 mililitros de CDM. Asegúrese de que la agarosa se disuelva completamente para evitar la fluorescencia de fondo. Pipetee 500 microlitros del CDM de agarosa tibio en el centro del marco genético, asegurándose de que toda el área, incluyendo los bordes, quede completamente cubierta.
Trabaje rápidamente para evitar el secado excesivo de los aros. Coloque la segunda portaobjetos sobre el marco de genes Aros CDM lleno, intentando evitar burbujas de aire. Coloque el sándwich en posición horizontal a cuatro grados Celsius durante 45 minutos para permitir que los agros se solidifiquen suficientemente.
Una vez que el aros se haya solidificado cuidadosamente, deslice el vidrio superior. Utilice una cuchilla de afeitar para recortar tiras de aros de aproximadamente cinco milímetros de ancho sobre las cuales crecerán las bacterias. Se pueden usar un máximo de tres tiras por portaobjetos, separadas por espacios de aproximadamente cuatro milímetros a cada lado.
Estos espacios proporcionarán aire, que es esencial para el crecimiento de Blu. Retire con cuidado la segunda y última cubierta de plástico del marco genético para exponer el lado adhesivo. Cargue células individuales en aproximadamente 2,5 microlitros de líquido sobre el medio sólido, comenzando en la parte superior del cojín de agros sin tocarlo.
Con la punta de la pipeta, permita que el medio se distribuya uniformemente inclinando la placa hacia arriba y hacia abajo. Coloque un cubreobjetos limpio sobre el marco genético para fijar completamente el cubreobjetos. Utilice la uña para aplicar presión una vez que las células hayan sido cargadas.
Es fundamental esperar a que el líquido se seque el tiempo suficiente para evitar células móviles y crecimiento en múltiples capas. Sin embargo, si las células se secan durante demasiado tiempo, tendrán problemas para crecer formando una monocapa de microcolonias. Por lo tanto, el tiempo necesario para secar las portaobjetos depende del experimento y no puede medirse.
Y, por consiguiente, por supuesto, es necesario adquirir una sensación práctica al respecto. Para prevenir problemas de enfoque automático durante las primeras horas del experimento de microscopía de lapso de tiempo, caliente previamente la preparación durante una hora a 30 grados Celsius para prepararla para la microscopía de lapso de tiempo. Caliente previamente la cámara ambiental al menos dos horas. Antes del inicio del experimento, seleccione los filtros del objetivo y el espejo dicróico adecuados según su configuración experimental.
Para experimentos prolongados, asegúrese de colocar un filtro UV entre la fuente de luz y la muestra. Además, si es posible, bloquee parte de la luz de excitación utilizando filtros de densidad neutra para minimizar la exposición. Programe el experimento de acuerdo con la configuración experimental específica.
Es recomendable determinar la cantidad de luz necesaria para construccos específicos, así como los ajustes de enfoque automático para otros microscopios de lapso de tiempo o bacterias, antes del experimento real. Tiempos de exposición más cortos y niveles más bajos de luz de excitación minimizarán el blanqueo y la fototoxicidad. Utilice luz escópica para la función de enfoque automático. Finalmente, coloque el portaobjetos preparado en la cámara ambiental precalentada del microscopio y supervise el crecimiento de células individuales hasta formar una monocapa de microcolonias a 30 grados Celsius.
Un experimento de fluorescencia con lapse de tiempo exitoso producirá una monocapa de microcolonias ubicada completamente dentro del campo de visión. Al final del experimento en esta película, el campo brillante está a la izquierda y se puede observar la fluorescencia a la derecha.
Aquí se muestra un ejemplo de una microcolonia de B subtiles en la que algunas células crecieron unas encima de otras, lo que dificulta reconstruir con precisión su historia y medir correctamente sus niveles de fluorescencia. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar exitosamente una muestra microscópica para microscopía de intervalos y cómo realizar una microscopía de fluorescencia de intervalos. Experimente con células BACE.
Descripción general
Este protocolo describe un método para monitorear el comportamiento de células bacterianas individuales a lo largo del tiempo mediante microscopía de fluorescencia automatizada con intervalos de tiempo. Incluye pautas detalladas para preparar muestras y analizar las imágenes resultantes.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Microbiología
- Biología celular
- Microscopía de fluorescencia
Antecedentes
- Comprender el comportamiento de las células bacterianas es fundamental para diversos estudios biológicos.
- La microscopía de lapso de tiempo permite la observación de la dinámica de células vivas.
- Este método proporciona información sobre los efectos de la historia celular en el desarrollo.
- Los métodos tradicionales pueden no captar los matices del comportamiento a nivel de célula individual.
Objetivo del estudio
- Visualizar células bacterianas vivas durante el crecimiento y la división.
- Analizar el impacto de las condiciones nutricionales en el desarrollo celular.
- Mejorar la comprensión de la dinámica de las proteínas y el comportamiento celular.
Métodos Utilizados
- Transfiera las células a medio de inanición para iniciar el crecimiento.
- Prepare un portaobjetos para microscopía para el crecimiento bacteriano.
- Registre películas de microscopía de fluorescencia con lapse de tiempo.
- Analice los datos registrados para observar el desarrollo celular.
Resultados principales
- Imágenes exitosas de células bacterianas individuales a lo largo del tiempo.
- Observación de la formación y desarrollo de microcolonias.
- Información sobre la dinámica de la expresión proteica en células individuales.
- Exposición de las ventajas de la microscopía de intervalos frente a los métodos tradicionales.
Conclusiones
- El protocolo permite eficazmente el estudio del comportamiento a nivel de célula individual en bacterias.
- La microscopía de lapso de tiempo es una herramienta poderosa para el análisis celular.
- Estudios futuros pueden basarse en este método para explorar otras dinámicas bacterianas.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El monitoreo del comportamiento de células individuales en bacterias permite reducir de forma mecanicista los riesgos asociados a la validación de dianas antimicrobianas, revelando la heterogeneidad en el crecimiento, la división y la expresión proteica. Este enfoque fortalece la confianza predictiva en las etapas iniciales del descubrimiento al vincular la historia celular con los resultados fenotípicos, orientando la selección de proyectos en el desarrollo de antibióticos. La microscopía de intervalos proporciona continuidad traslacional desde la selección mecanicista hasta la evaluación en modelos preclínicos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Examina hipótesis terapéuticas mediante el seguimiento de las respuestas individuales de las células a cambios nutricionales y perturbaciones genéticas a lo largo del tiempo.
- Valor operativo: Permite la validación funcional de objetivos mediante la observación directa de la dinámica de proteínas y el comportamiento celular en células individuales.
- Valor predictivo: Facilita la identificación de candidatos principales al correlacionar la ascendencia celular con la estabilidad fenotípica a través de generaciones.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Listo para ensayo: Prepara sistemas biológicos validados para la selección de compuestos posteriores mediante el establecimiento de formación reproducible de microcolonias en almohadillas de agarosa.
- Resultados cuantitativos: Genera datos de fluorescencia y de campo claro con resolución temporal que permiten la medición de tasas de crecimiento, temporización de la división y localización proteica.
- Escalabilidad: Permite la reutilización de la plataforma en diferentes especies bacterianas (B. subtilis, S. pneumoniae) para la evaluación estandarizada de dianas antimicrobianas.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Relevancia para la enfermedad: Modela el comportamiento del patógeno en especies clínicamente relevantes como S. pneumoniae para orientar estudios sobre el mecanismo de acción de los antimicrobianos.
- Alineación de biomarcadores traslacionales: Relaciona la dinámica proteica a nivel celular individual con fenotipos a nivel de población, apoyando decisiones de avance o interrupción basadas en biomarcadores.
- Avance ajustado al riesgo: Reduce la ambigüedad mecanicista en modelos preclínicos mediante la validación de los efectos sobre el blanco a resolución individual de células.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método sitúa la imagen de seguimiento temporal de células individuales entre la validación del objetivo y la optimización del fármaco líder, permitiendo la comprobación de hipótesis y la reducción del riesgo mecanicista antes del cribado de compuestos.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la aclaración de vías al visualizar cómo la dinámica de la expresión génica influye en el comportamiento celular durante el crecimiento y la división.
- Selección: Proporciona microcolonias listas para ensayos, con espaciado estandarizado y formación de monocapa, para una evaluación confiable de compuestos.
- Análisis: Ofrece variables dependientes cuantitativas, incluyendo intensidad de fluorescencia, momento de división y seguimiento de linajes, para el análisis comparativo entre condiciones.
- Investigación Traducional: Conecta observaciones a nivel de célula individual con la continuidad preclínica mediante modelos de comportamiento dependientes del ancestro en sistemas de patógenos.
- Reutilización Empresarial: Establece una capacidad de microscopía reutilizable para la evaluación de dianas antimicrobianas en proyectos múltiples mediante modelos de bacterias Gram-positivas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva en la validación de objetivos mediante la observación directa de la dinámica proteica a nivel de célula individual y la heterogeneidad conductual.
- Valor operativo: La preparación estandarizada de portaobjetos y los controles ambientales garantizan la reproducibilidad entre laboratorios y series experimentales.
- Valor estratégico: Mejora en las decisiones de avance o interrupción de proyectos al reducir los riesgos de los objetivos basándose en la consistencia de la respuesta a nivel de célula individual, en lugar de promedios poblacionales.
- Impacto en la cartera: Priorización ajustada al riesgo de candidatos antimicrobianos mediante datos fenotípicos resueltos a nivel de linaje para evitar falsos positivos derivados del enmascaramiento poblacional.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en técnicas de cultivo microbiano, microscopía de fluorescencia y software de análisis de imágenes como ImageJ.
- Depende de cámaras ambientales con control de temperatura, filtros de densidad neutra y protección contra rayos UV para imágenes de larga duración.
- Exige la estandarización entre equipos en la preparación de portaobjetos, la concentración de agarosa y los protocolos de carga celular para lograr consistencia entre laboratorios.
- Las consideraciones para la adaptación incluyen la optimización del espesor de la agarosa y la composición nutricional según la especie bacteriana y su velocidad de crecimiento.
- Las limitaciones prácticas incluyen los riesgos de fototoxicidad durante imágenes prolongadas y las dificultades para rastrear células que crecen en formaciones multicapa.
