Aislamiento libre de marca y el enriquecimiento de las células a través Contactless Dielectroforesis

El objetivo general de este procedimiento es inducir el movimiento de traslación de las células suspendidas en un flujo impulsado por la presión mediante el uso de electroforesis de colorante sin entrar en contacto con los electrodos de la muestra. Esto se logra suspendiendo primero las celdas de interés en un tampón de baja conductividad. El segundo paso es cargar el dispositivo microfluídico con la suspensión de la celda e introducir fluido altamente conductor en los canales de los electrodos.

A continuación, el dispositivo preparado se conecta a un dispositivo electrónico de alto voltaje y la respuesta de frecuencia del movimiento de la célula se registra mediante video alimentado por una cámara conectada a un microscopio invertido. El paso final es analizar las imágenes de video para predecir cuantitativamente las propiedades eléctricas de las células. En última instancia, la electroforesis de matriz sin contacto se utiliza para demostrar que las celdas con diferentes propiedades eléctricas se pueden clasificar de una manera no dañina y sin etiquetas, utilizando dispositivos microfluídicos económicos y fáciles de fabricar.

Por lo tanto, este método es útil para aplicaciones como la clasificación de células vivas de muertas, el aislamiento de tumores, la iniciación de células, la separación de células cancerosas en función de la etapa y la observación de los efectos de los medicamentos en diferentes células en sus propiedades dieléctricas. Las principales ventajas de esta técnica frente a los métodos existentes, como la clasificación celular activada por fluorescencia, es que las células se pueden clasificar y caracterizar en función de sus propiedades biofísicas intrínsecas sin necesidad de un etiquetado basado en biomarcadores y también que se puede mantener la esterilidad de la muestra eliminando el contacto entre los electrodos y la muestra. Bueno, tuvimos esta idea por primera vez cuando quisimos desarrollar una técnica que evitara varios de los problemas, como la contaminación de la muestra, la electrólisis, la fabricación costosa y que se asocia con los dispositivos electroforéticos tradicionales.

Para aislar células de mamíferos. Siga los procedimientos informados anteriormente utilizando fotorresistencia y grabado iónico reactivo profundo para grabar el diseño de canal deseado en una oblea de silicio, depositando una capa delgada de teflón para mejorar la liberación del microdispositivo de la oblea. Envuelva la oblea con papel de aluminio para evitar que se derrame.

Mezcle polimetilalano o PDMS en una proporción de 10 a uno de elastómero a agente de curado DGA durante aproximadamente 20 minutos y vierta sobre la oblea. Luego caliente la oblea durante 45 minutos a 100 grados centígrados para evitar dañar el recubrimiento de teflón del sello después de enfriarlo. Retira el papel de aluminio.

Recorte el PDMS con una cuchilla quirúrgica y perfore los orificios de acceso en la salida de entrada del canal. Utilizando un punzón romo adecuado al tamaño del tubo, se utiliza un punzón romo de 1,5 milímetros. A continuación, limpie un portaobjetos de microscopio de vidrio como se indica en el protocolo de texto.

Limpie el dispositivo PDMS con cinta adhesiva Scotch Magic. Examine bajo un microscopio para asegurarse de que los canales estén limpios. A continuación, exponga el portaobjetos y el dispositivo PDMS al plasma de aire durante dos minutos, presione firmemente el lado del canal del dispositivo contra el portaobjetos de vidrio, evitando la formación de burbujas de aire entre el dispositivo y el portaobjetos.

Prepare un tampón de baja conductividad como se describe en el protocolo de texto, que se denominará búfer DEP. Suspenda las células en el tampón DEP a 3 millones de células por mililitro aquí se utilizan células L cancerosas de ratón, de etapa tardía, epiteliales de la superficie ovárica o musgos después de morir las células usando una membrana fluorescente. El tinte permeable mide la conductividad de la suspensión de la célula dy.

La conductividad debe ser de aproximadamente 100 microsiemens por centímetro. Si la medición de la conductividad es demasiado alta, gire la muestra hacia abajo. Suspenda el tampón en profundidad y repita la medición de la conductividad.

El aspecto más difícil de este protocolo es evitar las burbujas en los canales de electrodos y las burbujas del canal de muestra en los canales de electrodos pueden evitar las conexiones de electro orificio y las burbujas en el canal de muestra pueden evitar el flujo constante. Asegúrese de realizar los pasos demostrados para evitar burbujas y garantizar un flujo constante antes de cargar el chip microfluídico de inmersión C. Colócalo al vacío durante 30 minutos.

Mientras tanto, corte un trozo de tubo flexible para abarcar la distancia desde la bomba de jeringa hasta la etapa del microscopio donde se ubicará el chip microfluídico aquí. Se requiere un tubo de seis pulgadas de largo. Coloque el tubo en la punta de la aguja de la jeringa.

A continuación, estime la longitud necesaria para el tubo de salida dividiendo el volumen de muestra objetivo recogido por el área de la sección transversal del tubo. Corte la longitud requerida del tubo. A continuación, extraiga la suspensión celular en una jeringa.

Verifique que no haya burbujas en el tubo o la jeringa. Al retirar el chip de la aspiradora, inserte el tubo de salida y cebe el canal de muestra rápidamente. Para evitar burbujas de aire atrapadas en los canales, golpee suavemente la jeringa al cebar.

Para evitar la ruptura de la delgada barrera aislante para cebar los canales de electrodos, coloque rápidamente las puntas de pipeta vacías en una salida de cada canal de electrodo fluido, pipeta de 200 microlitros de PBS que contiene una pequeña cantidad de bromo B. Y golpee suavemente para introducir el fluido en el extremo opuesto del canal de electrodos. Mantenga una presión suave hasta que PBS con bromo B suba visiblemente por la punta de la pipeta vacía, repita para cada electrodo. El canal R domine B se utiliza solo para fluorescencia.

Visualice los canales de los electrodos fluídicos después del cebado. Llene cada depósito de punta de pipeta con PBS, con R domine B.Evite la formación de burbujas en los depósitos de punta de pipeta y elimine cualquier burbuja visible pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo. Separe el tubo de salida y deséchelo adecuadamente.

A continuación, inserte un depósito de tubo de salida nuevo. Recopile el volumen de destino. Coloque el chip en la platina de un microscopio invertido equipado con la cámara digital.

Monte la jeringa en la bomba de jeringa e inserte los electrodos de alambre en los depósitos del canal de electrodos fluídicos, bombee el fluido a través de un mililitro por hora para garantizar un buen contacto entre la bomba de jeringa y la jeringa. Inspeccione visualmente la longitud del canal para garantizar un flujo sin obstáculos de las celdas y la ausencia de burbujas o fugas. A continuación, reduzca el caudal a cinco microlitros por hora.

Por seguridad. Pruebe la electrónica encendiendo el generador de funciones, el amplificador de alto voltaje y el osciloscopio, y ajustándola al voltaje y la frecuencia deseados. Aquí estos parámetros son 200 voltios y 20 kilohercios.

Una vez verificado el rendimiento aceptable, apague la alimentación. A continuación, conecte los electrodos al amplificador de alto voltaje. Al lograr un flujo constante, aplique el voltaje deseado a la frecuencia deseada En este experimento, el voltaje es de 200 voltios RMS a frecuencias entre cinco y 60 kilohercios.

Grabe los archivos de vídeo de la respuesta de la célula con técnicas de procesamiento de imágenes para cuantificar la distribución de la célula en el canal y caracterizar la frecuencia de cruce. Para hacer esto, mantenga un voltaje constante y varíe la frecuencia sistemáticamente al comienzo y al final del experimento, así como aleatoriamente entre ejecuciones experimentales. Registre la distribución de la celda de control, que es la distribución de las celdas sin aplicar ningún campo eléctrico.

Después de establecer una nueva frecuencia de espera, la cantidad de tiempo requerida para que las celdas fluyan desde la entrada a la ubicación monitoreada y luego comiencen a grabar, proceda a realizar el procesamiento de imágenes para caracterizar la frecuencia de cruce como se describe en el protocolo de texto, suspenda la mezcla deseada en el tampón DEP a una concentración total de 3 millones de partículas por mililitro. Aquí, esta mezcla es musgo L células con cuatro micrómetros de perlas fluorescentes en tampón DEP realizan los pasos descritos anteriormente. Para preparar un dispositivo CEP, opere el experimento a una frecuencia entre las dos frecuencias de cruce determinadas de las celdas objetivo y las partículas de fondo, de modo que las dos poblaciones de partículas experimenten fuerzas DEP en direcciones opuestas.

Para recoger el contenido de una muestra variada, retire el tubo de salida una vez recogido el volumen objetivo colocando un dedo de guante sobre la abertura de salida y tirando suavemente del tubo. Vierta el volumen objetivo recolectado en un depósito para su posterior análisis. En el caso de las células cancerosas de mamíferos, como la mayoría de las células L que se utilizan aquí, se observó un DEP negativo a cinco kilohercios y un DEP positivo fuerte.

A 60 kilohercios, las celdas MOS L tienen un diámetro de 17,7 más o menos 3,3 micrómetros, y las perlas tienen un diámetro nominal de cuatro micrómetros. Además de determinar la frecuencia de cruce de las células, esta técnica se puede utilizar para clasificar una mezcla ilustrada aquí por una mezcla de células L de MO y cuentas. Este ejemplo aprovecha la dielectroforesis negativa exhibida por cuatro perlas micrométricas a frecuencias en las que las células L de MO experimentan dielectroforesis positiva.

Cuando el dispositivo funcionó a 200 voltios RMS y 10 kilohercios, ambas celdas que se muestran aquí en verde y las cuentas que se muestran aquí en rojo se mezclaron ya que experimentaron DEP negativo a 50 kilohercios. Se observó el movimiento de las células MOS L hacia la parte superior del canal, mientras que las perlas se restringieron a la parte inferior del canal, lo que permitió la separación de la mezcla en dos componentes. Por lo tanto, siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otras técnicas posteriores, como el cultivo celular y las imágenes de inmunofluorescencia o ensayos bioquímicos para responder preguntas adicionales, como cómo se correlacionan las propiedades dieléctricas con las características físicas de las células.

Entonces, después de su desarrollo, esta técnica realmente allanó el camino para que los biólogos estudiaran cómo los cambios inducidos por metabolitos en el citoesqueleto de la célula se pueden correlacionar con sus propiedades dieléctricas utilizando un modelo de cáncer de ovario en ratón. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo enriquecer y clasificar células usando electroforesis sin contacto.