La detección de modificaciones post-traduccionales de los nativos intactos nucleosomas por ELISA

El objetivo general de este procedimiento es determinar con precisión los niveles relativos de modificaciones postraduccionales dentro de preparaciones de nucleosomas celulares totales obtenidos de un millón de células. Esto se logra preparando primero cultivos homogéneos de células de mamíferos de alta calidad. Luego, los núcleos se aíslan de las células a través de una disrupción mecánica con un downs, un homogeneizador y una centrifugación.

El siguiente paso es obtener nucleosomas intactos digiriendo la cromatina presente en los núcleos y realizando una serie de extracciones hipotónicas. Por último, los nucleosomas se interrogan mediante un ensayo ELIZA con los controles adecuados para identificar modificaciones postraduccionales específicas. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran los niveles relativos de modificaciones específicas presentes en las muestras de nucleosomas.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como el western blot y la inmunoprecipitación de cromatina, es que se puede determinar fácilmente una imagen global de varios estados de modificación de nucleosomas. El método es mucho más sensible y preciso que el Western blot y se puede realizar en la mayoría de los laboratorios equipados para la experimentación general de biología molecular. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de las células madre y la epigenética, como qué sucede cuando ocurren eventos importantes de diferenciación y reprogramación.

Para comenzar el procedimiento, primero se prueban las células con tres mililitros de tripsina por placa de 15 centímetros para obtener células recién tripizadas inizadas. Agregue 20 mililitros de butirato PBS helado. Transfiera las celdas a un tubo cónico de 50 mililitros y centrifugue el tubo para recolectar las celdas a 1000 RPM durante cinco minutos, aspire el sobrenadante y agregue 10 mililitros de butirato PBS helado para lavar, centrifugar la suspensión celular nuevamente a 1000 RPM durante cinco minutos.

Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en cuatro mililitros de tampón de lisis con inhibidores de la proteasa como se describe en el protocolo escrito. A continuación, pipetee las células en un homogeneizador de mortero tipo B en un homogeneizador de plumón de hielo con 20 golpes. A continuación, transfiera el homogeneizado a un tubo de centrífuga con hielo.

Centrifugar la muestra a 2000 G durante 10 minutos. A cuatro grados centígrados. Retire el súper nombrado, que contiene el material citoplasmático y resus.

Suspenda el pellet en dos mililitros de tampón de lavado con hielo frío C Con inhibidores de la proteasa, coloque suavemente el material resuspendido en capas sobre un cojín de cinco mililitros de sacarosa al 30% en un tubo de centrífuga fría. Para aislar los núcleos centrífugos a 2.400 G durante cinco minutos en un cubo oscilante, los núcleos del rotor migrarán a través del cojín y los restos celulares permanecerán en la interfaz. Después de la centrifugación, retire con cuidado todo el volumen de líquido y vuelva a suspender los núcleos en 250 microlitros de tampón C de lavado en frío con hielo con inhibidores de la proteasa, transfiera los núcleos a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.

Para comenzar el aislamiento de los nucleosomas, agregue tres microlitros de cloruro de calcio 0.1 molar a los núcleos y colóquelos en un bloque de calor de 37 grados Celsius hasta que la temperatura se equilibre. Luego agregue dos unidades de micro cocal nucleasa en 10 microlitros de micro cocal nucleasa, tampón e incube durante 12 minutos a 37 grados centígrados. Mezclar frecuentemente con una punta de pipeta.

Después de la incubación, detenga la reacción con seis microlitros de sodio 0,5 molar E-D-T-A-P-H ocho, y colóquelo en hielo para que se enfríe. A continuación, centrifugar la muestra a 2000 g durante cuatro minutos después de la centrifugación, desechar la nariz y volver a suspender el pellet. En 300 microlitros de 0,2 milimoles o EDTA sódico, incubar la muestra en hielo durante una hora con un pipeteo suave ocasional para mezclar.

Después de una centrifugación a 3000 G durante cuatro minutos. A cuatro grados centígrados, recoja el sobrenadante, que contiene los nucleosomas libres, en un nuevo tubo de Fuge y almacene en hielo nucleosomas adicionales deliberados. Suspenda el pellet en 300 microlitros de 0,2 milimoles o EDT de sodio como antes e incube en hielo durante una hora con una mezcla suave ocasional.

Después de la incubación, centrifugar la muestra. De nuevo, combine el snat resultante con la muestra restante en el tubo de micro fuga en hielo. Para comenzar el ensayo de nucleosoma Eliza, cargue una placa Eliza de 96 pocillos con una serie descendente de cinco diluciones en serie dobles de nucleosomas y tampón de recubrimiento, comenzando con 0,1 microgramos por 50 microlitros en el pocillo superior, todas las series de dilución deben cargarse por triplicado.

Recuerde incluir los pocillos con tampón de recubrimiento solo como controles. Incubar la placa durante la noche a cuatro grados centígrados al día siguiente. Utilice una lavadora de placas para lavar las placas con 200 microlitros por pocillo de 0,5% entre 20 en PBS a temperatura ambiente cuatro veces durante un total combinado de 10 minutos.

Ahora agregue 100 microlitros por pocillo de solución de bloqueo e incube durante una hora a temperatura ambiente en un rotador. Después de la incubación, retire el tampón de bloqueo agitando enérgicamente la placa invertida sobre un fregadero. A continuación, agregue el anticuerpo primario diluido en un volumen de 50 microlitros por pocillo en una solución de 5%PSA en 0.05%entre 20 en PBS incube la solución durante una hora en un rotador a temperatura ambiente.

Después de la incubación primaria de anticuerpos, lave las placas como antes de usar la lavadora de placas. Una vez finalizado el procedimiento de lavado, agregue 50 microlitros por pocillo de anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante diluido en PBS con 5% BS, A y 0.5%20 a temperatura ambiente de incubación durante una hora en un rotador después de la incubación de anticuerpos secundarios. Lave los platos como antes.

Uso de la arandela de placas para revelar la placa. Añadir 50 microlitros de sustrato Eliza de TMB a cada pocillo e incubar durante 10 minutos. A temperatura ambiente, los pocillos de la placa ELIZA se volverán azules y la intensidad es proporcional a la cantidad de modificaciones nucleosomas presentes dentro de cada uno.

Bueno, entonces detén la reacción. Añadiendo 50 microlitros por pocillo de dos ácidos sulfúricos normales. El color cambiará a marrón, centrifugará la placa a 1500 RPM durante dos minutos para disipar las burbujas de aire.

La placa ahora está lista para la cuantificación en un lector de placas métricas de color. Finalmente, lea la placa a 450 nanómetros y exporte los resultados para su análisis. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en dos días si se realiza correctamente después de su desarrollo.

Esta técnica abrió la puerta para que los investigadores en el campo de la investigación con células madre exploraran las respuestas epigenéticas a los eventos de diferenciación y reprogramación a nivel de todo el epiproteoma.