Name: Conteo de células madre neurales humanas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-08-22T00:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 37 s
Description: Aprende a contar células madre neurales humanas mediante hemocitómetro y azul de tripano. Este protocolo permite diferenciar células vivas de muertas para aplicaciones de cultivo tisular en neurociencia.

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Los autores desean agradecer al Dr. Philip H. Schwartz de la Comisión Nacional de Recursos Humanos de las células madre neurales en el Hospital Infantil s, Condado de Orange el Instituto de Investigación para proporcionar culturas hNSPC.

Pases células madre neurales humanas Nota: Consulte la <a href="/index/details.stp?ID=263">pases Humanos células troncales nerviosas</a> artículo sobre cómo separar y volver a suspender las células. https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263 Preparación de la suspensión celular para el recuento <ol><li> Lugar 25 l de 0,4% de la solución azul de tripano y 20 l de los medios de comunicación celular en un tubo eppendorf. </li><li> Resuspender las células para ser contadas golpeando suavemente el tubo que contiene las células en un volumen conocido de los medios de comunicación para crear una suspensión homogénea. Lugar 5 l de células en el tubo eppendorf de la etapa anterior. Este paso se diluye la concentración de células en un factor de 10. </li><li> Coloque la cubierta de vidrio en el hemocitómetro, y la carga de 11-12 l de la suspensión celular. <img src="/files/ftp_upload/old/262_2008_7_18_4/262_Figure-01.png" alt="262_Figure-01" width="511" height="139"> </li></ol> El recuento de células en el hemocitómetro <ol><li> Observar toda la red del hemocitómetro en un microscopio de contraste de fase. Se centran en un cuadrante de la red (como el de rojo). <img src="/files/ftp_upload/old/262_2008_7_18_5/262_Figure-02.png" alt="262_Figure-02" width="492" height="278"> </li><li> Células muertas o moribundas que aparecen de color azul debido a su membrana ha sido dañada y no se puede excluir el colorante azul de tripano. Las células viables no aparecen de color azul y estará rodeada por un "halo" de luz en contraste de fase (se "fase brillante"). </li><li> Cuente el número de células viables en un cuadrante (zona 1 mm 2). También se puede determinar la viabilidad celular mediante la división del número de células viables por el número total de células. Recuento de células en 3-4 cuadrantes al azar y determinar el número promedio de células por cuadrante. Dado que el volumen de un cuadrante se sabe que es de 10 ml-4 o 0,1 l, la concentración de células se puede determinar <img src="/files/ftp_upload/old/262_2008_7_18_6/262_Figure-03.png" alt="262_Figure-03" width="741" height="165"> </li><li> Puede usar los siguientes métodos abreviados para determinar las células # / l: <img src="/files/ftp_upload/old/262_2008_7_18_7/262_Figure-04.png" alt="262_Figure-04" width="368" height="69"> Número total de células en el tubo = # células / X l l en el tubo </li></ol>

<ol><li>Marchenko, S., Flanagan, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passaging+Human+Neural+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Passaging Human Neural Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. 7, 
 
 <a target="_blank" href="http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263">http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263</a> (2007).</li>
<li>Caprette, D. avidR. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+a+Hemacytometer%5BTitle%5D)+AND+%22BioEd+Online%22%5BJournal%5D)">Using a Hemacytometer.</a> BioEd Online. , 
 
 <a target="_blank" href="http://www.bioedonline.org/slides/slide01.cfm?q=%22hemacytometer&dpg=3">http://www.bioedonline.org/slides/slide01.cfm?q=%22hemacytometer&dpg=3</a> (2008).</li>
<li>Caprette, D. avidR. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+Chamber+%28Hemacytometer%29%5BTitle%5D)+AND+%22BioEd+Online%22%5BJournal%5D)">Counting Chamber (Hemacytometer).</a> BioEd Online. , 
 
 <a target="_blank" href="http://www.bioedonline.org/slides/slide01.cfm?q=%22hemacytometer%22&dpg=2
">http://www.bioedonline.org/slides/slide01.cfm?q=%22hemacytometer%22&dpg=2
</a> (2008).</li>
</ol>

Este protocolo describe de una manera sencilla y rápida para determinar la concentración de células para una variedad de experimentos con las células. Utilizando el método abreviado descritas en 3D, una forma rápida y precisa de determinar la concentración de células y el número total de células en un volumen determinado.

<table><tbody><tr><td>Hemocitómetro de contraste de fase</td><td>Herramienta</td><td>Hausser Scientific</td><td>02-671-54</td><td>Distribuido por Fisher con el número de catálogo indicado</td></tr><tr><td>Tinción azul de tripano al 0,4 %</td><td>Reactivo</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>15250-061</td><td>Distribuido por Invitrogen con el número de catálogo indicado</td></tr></tbody></table>

conteo de células madre neurales humanas

Counting Human Neural Stem Cells

El conocimiento del número exacto de células viables en un determinado volumen de una suspensión celular que se requiere para las manipulaciones rutinarias de cultivo de tejidos, como las células de revestimiento de inmunocitoquímica o para transfecciones celulares. Este protocolo describe un método sencillo y rápido para diferenciar entre células vivas y muertas y la cuantificación de la concentración celular y el número total de células con un hemocitómetro. Este procedimiento requiere en primer lugar separar las células de la superficie de crecimiento y resuspensión de ellos en los medios de comunicación. A continuación, las células se diluyen en una solución de azul tripán (idealmente a una concentración que dará a 20-50 células por cuadrante) y se coloca en el hemocitómetro. Por último, el promedio de los conteos de células viables en varios cuadrantes seleccionados al azar, dividiendo el promedio por el volumen de un cuadrante de 1 mm 2 (0,1 l) y multiplicar por el factor de dilución da el número de células por l. Al multiplicar esta concentración de células por el volumen total en l da el número total de células. Este protocolo describe contar humana madre neurales / células precursoras (hNSPCs), pero también se puede utilizar para muchos tipos de células.

El conocimiento del número exacto de células viables se requiere para muchos manipulaciones de cultivo de tejidos. Este protocolo describe cómo diferenciar entre células vivas y muertas y cuantificar las células usando un hemocitómetro. A pesar de que describe contar humana madre neurales / células precursoras (hNSPCs), que puede ser utilizado para otros tipos celulares.

Conteo de células madre neurales humanas

El conocimiento del número exacto de células viables en un volumen determinado de una suspensión celular es necesario para diversas manipulaciones rutinarias del cultivo de tejidos, tales como...

Ahora voy a mostrarle cómo contar células precursoras neuronales humanas. Usted contaría sus células cuando desee utilizarlas para inmunohistoquímica o cuando desee realizar una transfección con maquinaria de factores nucleares. Utilizo un hemocitómetro de contraste de fase que tiene una cuadrícula de borde y también usamos un colorante llamado azul de tripano. El colorante es útil porque puede diferenciar entre células vivas y muertas.Las células muertas o en proceso de muerte captan este colorante y aparecen azules. Cuando observa las células en el hemocitómetro, las células viables son capaces de excluir este colorante y, por lo tanto, no se ven azules. De esta manera, puede determinar la viabilidad de sus células para preparar una solución de tripano azul y medio.Voy a agregar 20 microlitros de la solución de trampa y azul a este tubo eppendorf de 0,5 ml. Luego voy a agregar 25 microlitros de medio. De esta manera, en este momento tendré 45 microlitros de una solución de trampa, azul de anilina y medio, de modo que cuando agregue cinco microlitros de la suspensión celular, obtendré una dilución uno a diez.Ahora voy a añadir cinco microlitros de la suspensión celular. Primero me aseguraré de que las células estén bien resuspendidas mediante vortexado con los dedos. Ahora quiero asegurarme de que esta solución esté bien mezclada.Así que voy a subir y bajar la cama varias veces. Finalmente, voy a cargar aproximadamente 12 microlitros de esta suspensión celular en un hemocitómetro. Tiene dos puertos y se puede utilizar cualquiera de los dos.Entonces, todo lo que tiene que hacer es introducir la solución en este puerto y el líquido será absorbido por acción capilar. Y ahora estoy listo para contar. Aquí se observa el hemocitómetro a 10 x y aquí tenemos un cuadrante que contiene 16 cuadros.Y como puede observarse, aquí podemos observar células vivas y muertas. Aquí tenemos células vivas como esta, esta y esta. Y también tenemos algunas células muertas como esta.Si observa, la célula muerta aparece de color azul oscuro, mientras que las células vivas tienen una especie de halo alrededor. Ahora voy a contar todas las células vivas. Voy a desplazarme de izquierda a derecha y de arriba hacia abajo.1, 2, 3, 4, 5, 6, 33, 1 32, 33, 34, 3 5, 3 6. Entonces tenemos un total de tres seis células en este cuadrante. Por lo tanto, cuando veo células que están en el límite del cuadrante, como a lo largo de esta línea aquí, para ser coherente, cuento las células que están en el borde izquierdo y en el borde superior.Y cuento sistemáticamente las células en esos bordes para todos los cuadrantes del hemocitómetro. Ahora vamos a calcular cuántas células tenemos por microlitro. Para ello, tomaré el promedio de células por cuadrante, que es 38, y lo multiplicaré por 10, que es un factor determinado por las dimensiones de la cámara.Y también vamos a multiplicar por 10, que es nuestro factor de dilución en este caso. Y al final, obtendremos el número de células por microlitro. Así que en este caso tenemos 3.800 células por microlitro.Y dado que resuspendimos nuestro pellet celular en 500 microlitros de solución, puede calcular cuántas células tiene en total. Y ya está todo listo.

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

La introducción de un gen de interés en una célula es un poderoso método para dilucidar su función en vivo. Este protocolo describe un método eficaz para la transfección de una cultura de derechos humanos madre neurales / células precursoras (hNSPCs) utilizando el aparato de electroporación Nucleofector hecha por Amaxa.

Transfección de células madre neurales humanas con el Nucleofector Amaxa

La capacidad de manipular humana madre neurales / células precursoras (hNSPCs) in vitro permite investigar su utilidad como los trasplantes de células con fines terapéuticos y para explorar el desarrollo neuronal humano. Este protocolo presenta un método de cultivo y hNSPCs pases con la esperanza de la reproducibilidad de cada vez mayor de la investigación con células madre humanas.

Pases células madre neurales humanas

Inmunocitoquímica es un poderoso método para determinar la presencia, localización subcelular, y la abundancia relativa de un antígeno de interés en células cultivadas. Este protocolo presenta una forma fácil de seguir una serie de medidas que permitan una para conservar los anticuerpos y sacar el máximo provecho de su coloración.

Inmunocitoquímica: células madre neurales humanas

Este protocolo de vídeo se muestra cómo se discrimina y enumerar bona fide las células madre neurales en una población mixta de células precursoras neurales con el neuronales formadoras de colonias de células de ensayo.

Neural formadoras de colonias ensayo de células: un ensayo para discriminar Bona Fide células troncales nerviosas de células progenitoras neurales

Un método sencillo y fiable en el aislamiento y cultivo de células madre neurales en humanos descartados tejido cortical fetal se describe. Cultivos derivados de enfermedades neurológicas conocidas humanos pueden ser utilizados para la caracterización de los patológicos procesos celulares y moleculares, así como ofrecer una plataforma para evaluar la eficacia farmacológica.

Generación de las células troncales nerviosas de desechados Humanos tejido cortical fetal

Este protocolo describe un nuevo método de cortar mecánico que permite la expansión de la madre y de células progenitoras neurales agregados esféricos sin disociación a una única suspensión de células. Mantener el contacto célula / célula permite un crecimiento rápido y estable durante más de 40 pasajes.

Un método de expansión de GMPc aplicable para agregados de Neural humano madre y células progenitoras derivadas de células madre pluripotentes o tejido cerebral fetal

Se desarrolló un método para derivar directamente las células madre neurales humanas a partir de células progenitoras hematopoyéticas enriquecidas a partir de células de sangre periférica.

La inducción directa de las células madre neurales humanas a partir de células de sangre periférica progenitoras hematopoyéticas

Con la intención de caracterizar los cambios en los miRNAs en células madre neurales humanas diferenciadas (hNSCs) describimos la diferenciación de hNSC en un sistema tridimensional, la evaluación de los cambios en la expresión de microRNA por la matriz de PCR de miRNA, y el análisis computacional para la predicción de objetivos de miRNA y su validación por ensayo de luciferasa dual.

La diferenciación de una línea de células madre neurales humanas en las Tres Culturas de dimensiones, Genes Análisis de microARN y putativo objetivo

La médula espinal de los mamíferos adultos contiene células madre/progenitoras neurales (NSPCs) que pueden ser aisladas y expandidas en cultivo. Este protocolo describe la recolección, el aislamiento, el cultivo y el paso de NSPC generados a partir de la región periventricular de la médula espinal adulta de la rata y de donantes de trasplante de órganos humanos.

Aislamiento de células neurales madre / progenitoras de la región periventricular de la rata de Adultos y de la médula espinal humana

Las células madre neurales (NSC) se refieren a células que pueden auto-renovarse y diferenciarse en los tres linajes neuronales. A continuación, se describe un protocolo para determinar la frecuencia NSC en una población celular dada usando neurosphere formación y diferenciación en condiciones clonales.

Enumeración de células madre neurales Usando ensayos clonales

El objetivo de este protocolo es describir un enfoque para analizar el comportamiento de las células madre/progenitoras neurales adultas en respuesta a la manipulación quimiogenética de un circuito neural local específico.

Regulación específica del circuito de ensayo de células precursoras neuronales hipocampales adultas

Aprende a contar células madre neurales humanas mediante hemocitómetro y azul de tripano. Este protocolo permite diferenciar células vivas de muertas para aplicaciones de cultivo tisular en neurociencia.

Conteo de células madre neurales humanas

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