Conteo de células madre neurales humanas
August 22nd, 2007
El conocimiento del número exacto de células viables se requiere para muchos manipulaciones de cultivo de tejidos. Este protocolo describe cómo diferenciar entre células vivas y muertas y cuantificar las células usando un hemocitómetro. A pesar de que describe contar humana madre neurales / células precursoras (hNSPCs), que puede ser utilizado para otros tipos celulares.
Ahora les voy a mostrar cómo contar las células neuroprecursoras humanas y contarían sus células cuando quieran ponerlas para la inmunoquímica o cuando quieran hacer una transfección con una máquina de factor nuclear. Utilizo un hemocitómetro de contraste de fase que tiene una rejilla de borde y también usamos un tinte llamado trip y azul. Y el tinte es útil porque puede diferenciar entre células vivas y muertas.
Las células muertas o moribundas absorben este tinte y aparecen de color azul. Cuando observas las células en el hemo, el citómetro y las células vivas pueden excluir este tinte y no parecen azules. De esa manera puede determinar la viabilidad de sus células para preparar una solución de viaje y azul y medio.
Voy a añadir 20 microlitros de trampa y solución azul en este tubo epi de 0,5 milésimas de pulgada. Y luego voy a agregar 25 microlitros de medio. De esa manera, en este momento tengo 45 microlitros de una solución de trap pan azul y media, de modo que cuando agregue cinco microlitros de suspensión celular, tendré una dilución de uno a 10.
Y ahora voy a agregar cinco microlitros de suspensión celular. Primero voy a asegurarme de que las células estén bien resuspendidas por el vórtice de los dedos. Así que ahora quiero asegurarme de que esta solución esté bien mezclada.
Así que voy a poner la cama arriba y abajo unas cuantas veces. Y, por último, voy a cargar unos 12 microlitros de esta suspensión celular en un hemocitómetro. Tiene, tiene dos puertos y puedes, puedes usar cualquiera de los dos.
Así que todo lo que tienes que hacer es introducir la solución en este puerto y el líquido va a ser aspirado por una acción capilar. Y ahora estoy listo para contar. Aquí hay un vistazo al hemocitómetro a 10 x y aquí tenemos un cuadrante que contiene 16 cuadrados.
Y como puedes ver, podemos observar aquí células vivas y muertas. Aquí tenemos células vivas como esta y esta y esta. Y también tenemos algunas células muertas como esta.
Si te fijas, la célula muerta aparece de color azul oscuro, mientras que las células vivas tienen una especie de granizo a su alrededor. Así que ahora voy a contar todas las células vivas. Así que voy a ir de izquierda a derecha y de arriba a abajo.
1, 2, 3, 4, 5, 6, 33, 1 32, 33, 34, 3 5, 3 6. Así que tenemos tres seis celdas en total en este cuadrante. Entonces, cuando veo celdas que están en el límite del cuadrante, como a lo largo de esta línea aquí, para ser coherente, cuento las celdas que están en el borde izquierdo y en el borde superior.
Y cuento constantemente las células en esos bordes para todos los cuadrantes del hemocitómetro. Así que ahora vamos a calcular cuántas células tenemos por microlitro. Y para hacer eso voy a tomar el promedio de las celdas por cuadrante, que es 38 y multiplicar por 10, que es un factor determinado por las dimensiones de la cámara.
Y también vamos a multiplicar por 10, que es nuestro factor de dilución en este caso. Y al final, vamos a obtener el número de células por microlitro. Así que en este caso tenemos 3.800 células por microlitro.
Y dado que resus suspendimos nuestra paleta de celdas en 500 microlitros de solución, puede calcular cuántas celdas tiene en total. Y ya estamos listos.
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Visión general
Este protocolo describe un método para contar células madre/precursoras neurales humanas (hNSPCs) utilizando un hemacitómetro. Enfatiza la importancia de diferenciar entre células vivas y muertas para varias aplicaciones de cultivo de tejidos.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Cultivo de tejidos
Antecedentes
- El recuento de células viables es crucial para las manipulaciones de cultivo de tejidos.
- Las células vivas pueden excluir ciertos colorantes, mientras que las células muertas no.
- El hemacitómetro es una herramienta estándar para el recuento de células.
- El colorante azul de Trypan se utiliza comúnmente para evaluar la viabilidad celular.
Propósito del estudio
- Proporcionar un método confiable para contar hNSPCs.
- Diferenciar eficazmente las células vivas y muertas.
- Ayudar a los investigadores en la preparación para experimentos adicionales como inmunoquímica o transfección.
Métodos utilizados
- Uso de un hemacitómetro de contraste de fase.
- Aplicación de colorante azul de Trypan para distinguir la viabilidad celular.
- Recuento de células bajo un microscopio.
- Preparación de una solución de azul de Trypan y medio.
Principales resultados
- Diferenciación exitosa entre células vivas y muertas.
- Cuantificación precisa de hNSPCs.
- Demostración de la efectividad del colorante azul de Trypan.
- Validación del hemacitómetro como un método confiable de recuento.
Conclusiones
- El protocolo proporciona un enfoque sencillo para el recuento celular.
- Es aplicable a varios tipos de células más allá de las hNSPCs.
- Entender la viabilidad celular es esencial para experimentos exitosos de cultivo de tejidos.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Accurate quantification of viable human neural stem/precursor cells (hNSPCs) is essential for reproducible tissue culture workflows in neuroscience drug discovery. This protocol enables reliable cell viability assessment and concentration measurement, supporting consistent experimental seeding for downstream applications such as immunocytochemistry and transfection. By standardizing live/dead discrimination using Trypan blue and hemacytometer-based counting, the method enhances predictive confidence in early-stage target validation and assay development pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables precise seeding of hNSPCs for target engagement and pathway modulation studies.
- Operational Value: Reduces variability in cell-based assays by ensuring consistent input of viable cells.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides quantitative, reproducible cell concentration data critical for assay standardization.
- Operational Value: Supports scalable preparation of cell suspensions for high-content screening formats.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains cellular input consistency across discovery-to-preclinical transition stages.
- Operational Value: Facilitates cross-functional collaboration through standardized cell counting practices.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the early discovery continuum, supporting reliable cell preparation from target validation through assay optimization and preclinical efficacy testing.
- Discovery Biology: Ensures accurate cell dosing for target validation experiments involving hNSPCs.
- Screening: Delivers standardized, quantifiable cell inputs necessary for reproducible assay performance.
- Analytics: Generates viable cell concentration and total count outputs used to normalize experimental conditions.
- Translational Research: Supports continuity in cell handling between in vitro discovery and preclinical models.
- Enterprise Reuse: Represents a transferable, low-complexity capability applicable across multiple cell types and projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves predictive confidence by minimizing variability in cell-based experimental inputs.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization across laboratories and teams.
- Strategic Value: Supports better go/no-go decisions through reliable assay foundations.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement by ensuring data quality in early efficacy screening.
Implementation Considerations
- Requires basic tissue culture technique and microscopy proficiency.
- Dependent on hemacytometer availability and proper cleaning to avoid contamination.
- Necessitates consistent operator training for unbiased quadrant selection and border-counting rules.
- Limited by manual counting throughput; not suited for high-throughput automation without adaptation.
- Relies on correct dilution and mixing to ensure representative sampling of cell suspension.
