Pases células madre neurales humanas

Hola, soy Steve. Trabajo en el laboratorio del Dr. Flanagan en el Departamento de Patología de la Universidad de California, Irvine. Hoy te voy a mostrar cómo dividir células precursoras neurales humanas.

Esta técnica consiste en codificar un nuevo matraz con una solución de fibronectina humana, levantar las células con tampón de disociación celular, luego neutralizar el tampón de disociación celular con una solución de suero al 10%, centrifusionar la suspensión celular y resus, suspender las células en fresco, medio, y transferir la suspensión celular a un nuevo matraz. En nuestro laboratorio, cultivamos células precursoras neurales humanas cambiando la mitad de sus medios cada dos días, y las pasamos aproximadamente una vez a la semana dividiendo una a dos. Cuando paso células, puedo contarlas si quiero cambiarlas por un experimento de inmunoquímica, o si quiero hacer una transfección con un efector nuclear.

Es importante usar un tampón de disociación celular al empaquetar las células porque, en primer lugar, no es enzimático, a diferencia de la tripsina, y es mucho más suave con las células. Hola, estamos en la sala de cultivo de tejidos Ahora, y antes de mostrarles cómo se ve un matraz confluente de células precursoras humanas, primero voy a preparar el cultivo de tejidos. Primero, voy a apagar la luz ultravioleta y encender la luz y el flujo de aire.

A continuación, voy a desinfectar la campana con etanol al 70% rociando una toalla de papel y limpiando la campana. Es importante rociar una toalla de papel con un 70% de etanol y no directamente en el interior de la campana porque rociar la campana con 70% de etanol podría dañar el filtro HEPA, que es realmente costoso. A continuación, voy a rociar todos los reactivos e instrumentos.

Y finalmente, voy a rociar las mangueras de la aspiradora, y ya está todo listo. Echemos un vistazo a estas celdas. Por lo tanto, estas células parecen confluentes en un 80%.

Se trata de células precursoras neurales humanas aisladas de fetos humanos, y las cultivamos en frascos T 25. Los dividimos cada semana, uno o dos. Ya estoy listo para pasar por mis celdas.

Y primero voy a traer un nuevo matraz T 25 que cubrí durante cuatro horas con fibronectina humana de BD biosciences. Así que quité la solución de fibronectina. Voy a enjuagar este matraz con BBS antes de mover las células al matraz.

Y ahora voy a sacar las células de la incubadora de 37 grados. Ahí están. Ahora voy a quitar la solución de lavado PBS del nuevo matraz que estaba recubierto con fibronectina humana.

Y voy a añadir dos mililitros de medios acondicionados viejos en el nuevo matraz. Así que ahora necesito enjuagar mis células con PBS antes de poder sacarlo de la superficie. Entonces, primero, voy a quitar los medios restantes, agregar aproximadamente dos milésimas de pulgada de PBS de inmediato sin mojar las celdas y secarlas.

Voy a esperar unos dos minutos antes de eliminar el PBS y poner a la venta el búfer de disociación para sacar las ventas de la superficie del flak. Ahora voy a eliminar PBS y, de nuevo, voy a intentar agregar un tampón de disociación celular de inmediato para que las células no se sequen. Así que voy a agregar 1.5 mils de tampón de disociación celular.

Y a diferencia de PBS, voy a agregarlo directamente a las celdas y voy a tratar de cubrir la mayor superficie posible. Así que estoy moviendo el matraz de un lado a otro mientras agrego lentamente este tampón a las celdas. Y voy a esperar ahora unos cinco minutos para que las células empiecen a salir de la superficie.

Y voy a dejar el matraz a temperatura ambiente en la campana. Como puedes ver aquí, las células primero comienzan a redondearse y luego comienzan a salir de la superficie y ya puedes ver algunas, algunas células flotando. Y si golpeas el matraz ampliamente en el costado, eso ayudará a que se desprendan.

Así que han pasado cinco minutos y, como puedes ver, la solución se ha vuelto muy densa con células que se han desprendido de la superficie. Y ahora voy a neutralizar el efecto del tampón de disociación celular agregando 4.5 mils de medio que contiene suero. Así que voy a usar suero fetal bovino inactivado por calor al 10% en medios D-M-E-M-F 12, y lo voy a agregar directamente sobre la superficie del matraz para asegurarme de que no queden células adheridas.

Y voy a pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo para desalojar cualquier célula restante. Y luego voy a transferir la solución celular a un tubo cónico de 15 milésimas de pulgada. Y voy a hacerlo girar a mil RPM durante un minuto.

Así que las celdas terminan de girar y tenemos aquí una hermosa paleta de celdas. Voy a retirar el medio de suero con mucho, mucho cuidado sin tratar de alterar la paleta. Y luego voy a volver a suspender la paleta en cuatro milésimas de pulgada de los medios.

Así que voy a tratar de resuspender el pellet para que haya, haya, no queden grumos de células para que la solución se vuelva homogénea y contenga, no contenga grumos. Y como estoy haciendo una división de uno a dos, voy a tomar dos de los cuatro molinos y transferirlos al nuevo matraz que ya contiene dos milésimas de pulgada del medio de condición. Y finalmente, voy a etiquetar el matraz con el tipo de celda, el número de paso y la fecha.

Este es un vistazo a las celdas por las que pasamos hace media hora. Y como pueden ver, la mayoría de ellos se han adherido a la superficie y han comenzado a enviar procesos. Eso es todo, amigos.

Y ahora estoy listo para contar.