Pases células madre neurales humanas
22 de agosto de 2007
La capacidad de manipular humana madre neurales / células precursoras (hNSPCs) in vitro permite investigar su utilidad como los trasplantes de células con fines terapéuticos y para explorar el desarrollo neuronal humano. Este protocolo presenta un método de cultivo y hNSPCs pases con la esperanza de la reproducibilidad de cada vez mayor de la investigación con células madre humanas.
Hola, soy Steve. Trabajo en el laboratorio del Dr. Flanagan, en el Departamento de Patología de la UC, Irvine. Hoy les mostraré cómo dividir células precursoras neuronales humanas.
Esta técnica consiste en recubrir un nuevo matraz con una solución de fibronectina humana, desprender las células utilizando un tampón de disociación celular, neutralizar luego el tampón de disociación celular con una solución de suero al 10%, centrifugar la suspensión celular y resuspender las células en medio fresco, y transferir la suspensión celular a un nuevo matraz. En nuestro laboratorio, cultivamos células precursoras neurales humanas cambiando la mitad del medio cada dos días, y las pasamos aproximadamente una vez por semana dividiéndolas de uno a dos. Cuando paso las células, puedo contarlas si deseo utilizarlas en un experimento de inmunoquímica, o si quiero realizar una transfección con un efector nuclear.
Es importante utilizar un tampón de disociación celular al envasar las células porque, en primer lugar, es no enzimático, a diferencia de la tripsina, y es mucho más suave para las células. Hola, estamos en la sala de cultivo tisular ahora, y antes de mostrarles cómo se ve un frasco confluyente de células precursoras humanas, primero voy a preparar el cultivo tisular. Primero, voy a apagar la luz ultravioleta y encender la luz y el flujo de aire.
A continuación, voy a desinfectar la cabina con etanol al 70 % rociando una toalla de papel y luego limpiando la cabina. Es importante rociar la toalla de papel con etanol al 70 % y no rociar directamente el interior de la cabina porque pulverizar etanol al 70 % dentro de la cabina podría dañar el filtro HEPA, el cual es muy costoso. A continuación, voy a rociar todos los reactivos e instrumentos.
Y finalmente, voy a rociar las mangueras del vacío, y ya estaremos listos. Echemos un vistazo a estas células. Estas células tienen un aspecto de aproximadamente 80 % de confluencia.
Estas son células precursoras neuronales humanas aisladas de fetos humanos, y las cultivamos en matraces T 25. Las dividimos aproximadamente cada semana, uno a dos. Ahora estoy listo para pasar mis células.
Y primero voy a traer un nuevo matraz T 25 que recubrí durante cuatro horas con fibronectina humana de BD biosciences. Así que eliminé la solución de fibronectina. Voy a enjuagar este matraz con BBS antes de transferir las células al matraz.
Ahora voy a sacar las células del incubador a 37 grados. Ahí están. Ahora voy a eliminar la solución de lavado de PBS del nuevo frasco que fue recubierto con fibronectina humana.
Y voy a añadir dos mililitros de medio condicionado viejo al nuevo matraz. Ahora necesito lavar mis células con PBS antes de desprenderlas de la superficie. Primero, voy a eliminar el medio restante y añadir inmediatamente unos dos mililitros de PBS sin dejar que las células se sequen.
Voy a esperar aproximadamente dos minutos antes de retirar el PBS y agregar el tampón de disociación para desprender las células de la superficie del frasco. Ahora voy a retirar el PBS y, nuevamente, intentaré agregar inmediatamente el tampón de disociación celular para que las células no se sequen. Por lo tanto, voy a agregar 1,5 mL del tampón de disociación celular.
Y a diferencia de PBS, voy a añadirlo directamente sobre las células y trataré de cubrir la mayor superficie posible. Por eso estoy moviendo el matraz de un lado a otro mientras añado lentamente este tampón sobre las células. Ahora voy a esperar unos cinco minutos para que las células comiencen a desprenderse de la superficie.
Y voy a dejar el matraz a temperatura ambiente en la campana. Como se puede ver aquí, las células primero comienzan a redondearse y luego empiezan a desprenderse de la superficie, y en realidad ya se pueden observar algunas células flotando. Y si golpea suavemente el matraz en el lateral, eso ayudará a que se desprendan.
Así que han pasado cinco minutos, y como pueden ver, la solución se ha vuelto muy densa con células que se han desprendido de la superficie. Ahora voy a neutralizar el efecto del tampón de disociación celular añadiendo 4,5 ml de medio que contiene suero. Voy a usar suero bovino fetal inactivado por calor al 10 % en medio D-M-E-M-F 12, y lo voy a añadir directamente sobre la superficie del matraz para asegurarme de que no queden células adheridas.
Y voy a pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo para desprender cualquier célula restante. Luego, voy a transferir la solución celular a un tubo cónico de 15 ml. Y lo voy a centrifugar a mil RPM durante un minuto.
Entonces, las células han terminado de centrifugarse y aquí tenemos un hermoso pellet celular. Voy a eliminar el medio con suero de manera muy, muy cuidadosa sin intentar perturbar el pellet. Luego, voy a resuspender el pellet en cuatro mililitros del medio.
Así que voy a intentar resuspender el precipitado para que no queden grumos celulares, de modo que la solución se vuelva homogénea y no contenga grumos. Y dado que estoy realizando una división uno a dos, voy a tomar dos de los cuatro mililitros y transferirlos al nuevo frasco que ya contiene dos mililitros del medio condicionado. Finalmente, voy a etiquetar el frasco con el tipo celular, el número de paso y la fecha.
Este es un vistazo a las células que pasamos hace media hora. Como pueden ver, la mayoría ya se han adherido a la superficie y han comenzado a emitir prolongaciones. Eso es todo, amigos.
Y ahora estoy listo para contar.
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Descripción general
Este protocolo describe un método para el cultivo y el paso de células madre/neurales precursoras humanas (hNSPCs) in vitro. La técnica tiene como objetivo mejorar la reproducibilidad de la investigación con células madre humanas y facilitar la exploración del desarrollo neural y las posibles aplicaciones terapéuticas.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología de Células Madre
- Técnicas de Cultivo Celular
Antecedentes
- Las células madre/neurales precursoras humanas (hNSPCs) son fundamentales para estudiar el desarrollo neural.
- La manipulación in vitro de las hNSPCs puede conducir a avances terapéuticos.
- La reproducibilidad en la investigación con células madre es esencial para el progreso científico.
- Las técnicas de cultivo celular son fundamentales en la investigación en neurociencia.
Objetivo del estudio
- Proporcionar un método confiable para el cultivo de hNSPCs.
- Facilitar el uso de hNSPCs en aplicaciones experimentales.
- Mejorar la comprensión del desarrollo neural humano.
Métodos Utilizados
- Recubrimiento de frascos con fibronectina humana.
- Uso de tampón de disociación celular para levantar las células.
- Neutralización del tampón de disociación con una solución de suero.
- Centrifugación y resuspensión de las células en medio fresco.
Resultados principales
- Pasaje exitoso de las cNPCs humanas utilizando el método descrito.
- Mejora en la reproducibilidad de las prácticas de cultivo celular.
- Potencial de aplicación en experimentos de inmunoquímica y transfección.
- Establecimiento de un procedimiento rutinario para los cambios de medio y la frecuencia de pasaje.
Conclusiones
- El protocolo proporciona un enfoque sistemático para el cultivo de hNSPC.
- Mejoras en la reproducibilidad pueden conducir a mejores resultados experimentales.
- Investigaciones futuras pueden explorar el potencial terapéutico de las hNSPC.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El paso estandarizado de células madre/neurales precursoras humanas (hNSPCs) respalda modelos in vitro reproducibles para la validación de objetivos y la reducción mecanicista de riesgos en la investigación de enfermedades neurodegenerativas. La expansión confiable de hNSPCs permite entradas de ensayo consistentes para programas de cribado fenotípico y de identificación de compuestos líderes. Este protocolo aborda la variabilidad en el cultivo de células madre que puede dificultar estudios traslacionales de biomarcadores y la fidelidad de modelos preclínicos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la interrogación de la modulación de las vías neuronales mediante hNSPC estables genéticamente que expresan nestina y SOX2.
- Valor operativo: Reduce la variabilidad inducida por el cultivo que enmascara las lecturas de interacción con el objetivo en las fases iniciales de cribado.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Proporciona hNSPC con morfología adherente y bipolar adecuada para imágenes de alto contenido del crecimiento de neuritas o la expresión de marcadores sinápticos.
- Valor operativo: La división estandarizada 1:2 cada 7 días favorece densidades de siembra escalables para ensayos en placas de múltiples pocillos.
- Valor estratégico: Los frascos recubiertos con fibronectina mejoran la eficiencia de adhesión, reduciendo la inconsistencia entre pocillos en cribados de compuestos.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Valor científico: Mantiene la expresión de marcadores indiferenciados, preservando la multipotencialidad para la diferenciación en subtipos neuronales relevantes para enfermedades.
- Valor operativo: La retención de medio acondicionado durante el paseo celular permite estudios de factores paracrinos relevantes para las vías neuroinflamatorias.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
Este método de subcultivo se integra en el continuo de descubrimiento, desde la validación del blanco hasta la optimización del ensayo y la generación de modelos preclínicos, donde la consistencia de las hNSPC afecta la fiabilidad de los datos en todas las etapas.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la verificación de hipótesis mediante la expansión controlada de hNSPCs para estudios de cribado con CRISPR o de sobreexpresión.
- Cribado: Permite densidades de siembra reproducibles para cuantificar los efectos de compuestos sobre la viabilidad celular o los marcadores de diferenciación.
- Análisis: Produce suspensiones homogéneas adecuadas para citometría de flujo o inmunocitoquímica que proporcionan lecturas cuantitativas.
- Investigación Traducional: Se conecta con trabajos preclínicos al ofrecer una fuente escalable para generar neuronas o glía destinadas a estudios de eficacia en trasplantes.
- Reutilización Empresarial: Un revestimiento definido y una frecuencia de pasaje establecida permiten la transferencia tecnológica entre distintos centros para programas pluriproyecto de células madre.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva en ensayos derivados de células madre mediante la reducción de la deriva inducida por el paso celular.
- Valor operativo: Los pasos estandarizados de disociación y neutralización mejoran la reproducibilidad día a día.
- Valor estratégico: Permite una ampliación eficiente en términos de capital al reducir los lotes fallidos debido a subcultivos inconsistentes.
- Impacto en la cartera: Apoya decisiones ajustadas al riesgo en carteras de enfermedades neurodegenerativas al mejorar la fidelidad de los datos en cascadas de validación de dianas.
Consideraciones de Implementación
- Requiere capacitación en técnica aséptica para el manejo seguro de los tampones de disociación y los suplementos séricos.
- Depende del acceso a material de cultivo recubierto con fibronectina humana y tubos cónicos estériles para la centrifugación.
- Necesita la estandarización del momento del pase en relación con la confluencia (~80 %) para evitar la diferenciación inducida por el sobrecrecimiento.
- La adaptación a cultivos en suspensión o en forma de esferoides requeriría ajustes de la matriz más allá del recubrimiento adherente con fibronectina.
- Limitado a operaciones a escala de investigación; el pase conforme con las Buenas Prácticas de Manufactura requeriría biorreactores de sistema cerrado y reactivos calificados.
