Name: Pases células madre neurales humanas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-08-22T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Aprende a realizar pases de células madre neurales humanas (hNSPCs) mediante fibronectina y buffer de disociación celular. Este método mejora la reproducibilidad en investigación de neurociencia y biología de células madre.

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Los autores agradecen el Dr. Philip H. Schwartz de la Comisión Nacional de Recursos Humanos de las células madre neurales en el Hospital de Niños del Condado de Orange el Instituto de Investigación para proporcionar hNSPCs y la instrucción inicial en su cultivo.

Nota: Para el cultivo de la rutina de nuestra hNSPCs, podemos cambiar el 50-100% de los medios de comunicación cada dos días y por lo general les paso 01:02 una vez por semana. La cultura de los medios de comunicación contiene un 20% BIT-9500, 1X factores de antibiótico / antimicótico, y el crecimiento (EGF, FGF y PDGF cada uno a 40 ng / ml) en DMEM: F12 medios de base. Preparación del frasco recubiertas y disociar las células <ol><li> Para preparar nuevos frascos para las células pases, abrigo T25 frascos con 10 mg / ml de fibronectina humana en el EMEM durante 4 horas, o durante la noche, en un 37 ° C incubadora de cultivo de tejidos. Justo antes de los pases de las células, eliminar la solución de fibronectina y enjuague los frascos con PBS. </li><li> La transferencia de la antigua &quot;condicionada&quot; medios de comunicación de las células para ser pasados ​​al nuevo recubiertos de fibronectina frascos (por ejemplo, que la mitad del volumen final de los medios de comunicación para cada frasco será la &quot;condición&quot; los medios de comunicación). Estas condiciones de cultivo para mantener estas células en su estado indiferenciado. </li><li> Una vez que todos los medios de comunicación se elimina de las células para ser pasados, lavar las células una vez con PBS. Tenga cuidado de no secar las células. </li><li> Añadir disociación celular Buffer (CDB) directamente sobre las células (1,0 a 1,5 ml de un frasco T25). Se incuban las células en el búfer durante unos 5 minutos a temperatura ambiente. Golpeando suavemente el frasco ayudará a acelerar el desprendimiento de células. </li></ol> Centrifugación, resuspensión, y las Pilas de Revestimiento <ol><li> Añadir el suero que contienen los medios de comunicación (DMEM: F12 con 10% inactivado por calor suero fetal bovino) (uso ~ 3 veces el volumen de la CDB) en el matraz con células desprendidas. Retire el papel y las células a un tubo cónico de 15 ml. Use una pequeña cantidad de suero fresco contiene los medios de comunicación para enjuagar el frasco y se recuperan las células residuales. </li><li> Centrifugar los medios de comunicación y las células a 1000 rpm (~ 200xg) durante 5 minutos. </li><li> Aspiración de los medios de comunicación que contiene suero y resuspender las células en medio de cultivo fresco, pipeteando arriba y abajo para hacer una suspensión celular homogénea. </li><li> La transferencia de la mitad de las células se resuspendieron en cada nuevo frasco de una división de 1:2. Anote el número de paso de nuevo en el frasco. </li></ol>

<ol><li>Flanagan, L. A., Rebaza, L. M., Derzic, S., Schwartz, P. H., Monuki, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+human+neural+precursor+cells+by+laminin+and+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Regulation of human neural precursor cells by laminin and integrins.</a> J. Neurosci. Res. 83, 845-856 (2006).</li>
<li>Nethercott, H. N., Maxwell, H., Schwartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Stem+Cell+Manual%3A+A+Laboratory+Guide%22%5BJournal%5D)">Neural stem cell culture.</a> Human Stem Cell Manual: A Laboratory Guide. Loring, J. F., Wesselschmidt, R. W., Schwartz, P. H. , Elsevier/Cell Press. (2007).</li>
<li>Palmer, T. D., Schwartz, P. H., Taupin, P., Kaspar, B., Stein, S. A., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture.+Progenitor+cells+from+human+brain+after+death%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell culture. Progenitor cells from human brain after death.</a> Nature. 411, 42-43 (2001).</li>
<li>Schwartz, P. H., Bryant, P. J., Fuja, T. J., Su, H., O'Dowd, D. K., Klassen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+neural+progenitor+cells+from+post-mortem+human+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of neural progenitor cells from post-mortem human cortex.</a> J Neurosci Res. 74, 838-851 (2003).</li>
</ol>

Hemos encontrado que este protocolo ofrece culturas fiable de hNSPCs. Un factor crítico para nuestras células es que tienen que ser lo bastante denso y las culturas no pueden ser pasados ​​al punto de que las células son escasas. En nuestras manos, culturas escasa crecen muy lentamente o desaparecen completamente división. Por esta razón, se suelen dividir nuestras culturas 1:2 o 1:3 cuando la cultura es extremadamente denso. Revestimiento de la superficie de una placa de cultivo con fibronectina es importante, ya que promueve la unión de l...

<table><tbody><tr><td>BIT-9500 (BSA, Insulina, Transferrina)</td><td>Reactivo</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>09500</td><td></td></tr><tr><td>Antibiótico-Antimicótico</td><td>Reactivo</td><td>Invitrogen</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>DMEM:F12 (1X)</td><td>Reactivo</td><td>Invitrogen</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>EMEM (1X)</td><td>Reactivo</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>MT-10-010-CV</td><td>Distribuido por Fisher bajo el número de catálogo indicado</td></tr><tr><td>Suero bovino fetal</td><td>Reactivo</td><td>Invitrogen</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>FGF, recombinante básico humano</td><td>Reactivo</td><td>PeproTech Inc</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>PDGF-AB</td><td>Reactivo</td><td>PeproTech Inc</td><td>100-00AB</td><td></td></tr><tr><td>EGF, recombinante humano</td><td>Reactivo</td><td>BD Biosciences</td><td>CB40052</td><td>Distribuido por Fisher bajo el número de catálogo indicado</td></tr><tr><td>Frascos para cultivo celular, 25 cm²</td><td>Herramienta</td><td>Corning</td><td>10-126-28</td><td>Distribuido por Fisher bajo el número de catálogo indicado</td></tr><tr><td>Fibronectina, humana, natural</td><td>Reactivo</td><td>BD Biosciences</td><td>CB40008A</td><td>Distribuido por Fisher bajo el número de catálogo indicado</td></tr><tr><td>Células neurales/precursoras humanas</td><td>Células</td><td>Recurso Nacional de Células Madre Neurales Humanas</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tampón de disociación celular</td><td>Reactivo</td><td>Invitrogen</td><td>13150-016</td><td></td></tr></tbody></table>

pases células madre neurales humanas

Passaging Human Neural Stem Cells

La capacidad de manipular humana madre neurales / células precursoras (hNSPCs) in vitro constituye un medio para investigar su utilidad como los trasplantes de células con fines terapéuticos, así como para explorar muchos de los procesos fundamentales del desarrollo humano y la patología neuronal. Este protocolo presenta un método simple de cultivo y hNSPCs pases con la esperanza de la normalización de esta técnica y el aumento de la reproducibilidad de la investigación con células madre humanas. El hNSPCs usamos fueron aislados de cadáveres corteza cerebral postnatal por el Instituto Nacional de Recursos Humanos de las células madre neurales y crecido como adherente culturas en frascos recubiertas con fibronectina (Palmer et al, 2001;.. Schwartz et al, 2003). Nosotros la cultura de nuestro hNSPCs en DMEM: F12 medio libre de suero suplementado con EGF, FGF y PDGF y el paso de las 1:02 aproximadamente cada siete días. Usando estas condiciones, la mayoría de las células en el cultivo mantienen una morfología bipolar y expresan marcadores de células madre indiferenciadas neural (como la nestina y Sox2).

La capacidad de manipular humana madre neurales / células precursoras (hNSPCs) in vitro permite investigar su utilidad como los trasplantes de células con fines terapéuticos y para explorar el desarrollo neuronal humano. Este protocolo presenta un método de cultivo y hNSPCs pases con la esperanza de la reproducibilidad de cada vez mayor de la investigación con células madre humanas.

Pases células madre neurales humanas

La capacidad de manipular células madre/precursoras neurales humanas (hNSPCs) in vitro proporciona un medio para investigar su utilidad como trasplantes celulares para...

Hola, soy Steve. Trabajo en el laboratorio del Dr. Flanagan, en el Departamento de Patología de la UC, Irvine. Hoy les mostraré cómo dividir células precursoras neuronales humanas.Esta técnica consiste en recubrir un nuevo matraz con una solución de fibronectina humana, desprender las células utilizando un tampón de disociación celular, neutralizar luego el tampón de disociación celular con una solución de suero al 10%, centrifugar la suspensión celular y resuspender las células en medio fresco, y transferir la suspensión celular a un nuevo matraz. En nuestro laboratorio, cultivamos células precursoras neurales humanas cambiando la mitad del medio cada dos días, y las pasamos aproximadamente una vez por semana dividiéndolas de uno a dos. Cuando paso las células, puedo contarlas si deseo utilizarlas en un experimento de inmunoquímica, o si quiero realizar una transfección con un efector nuclear.Es importante utilizar un tampón de disociación celular al envasar las células porque, en primer lugar, es no enzimático, a diferencia de la tripsina, y es mucho más suave para las células. Hola, estamos en la sala de cultivo tisular ahora, y antes de mostrarles cómo se ve un frasco confluyen

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Investigación

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Biología

La introducción de un gen de interés en una célula es un poderoso método para dilucidar su función en vivo. Este protocolo describe un método eficaz para la transfección de una cultura de derechos humanos madre neurales / células precursoras (hNSPCs) utilizando el aparato de electroporación Nucleofector hecha por Amaxa.

Transfección de células madre neurales humanas con el Nucleofector Amaxa

El conocimiento del número exacto de células viables se requiere para muchos manipulaciones de cultivo de tejidos. Este protocolo describe cómo diferenciar entre células vivas y muertas y cuantificar las células usando un hemocitómetro. A pesar de que describe contar humana madre neurales / células precursoras (hNSPCs), que puede ser utilizado para otros tipos celulares.

Conteo de células madre neurales humanas

Las células madre neurales se prepararon desde el hipocampo de los adultos no hibernan las ardillas de tierra del Ártico año de edad (AGS). Estas células madre neurales se puede ampliar a través de numerosos pasajes, diferenciados y se mantiene como una neurona cerca de 50:50 a la cultura gliales.

Crecimiento y diferenciación de las células del hipocampo adulto ardilla de tierra del Ártico troncales nerviosas

Un método sencillo y fiable en el aislamiento y cultivo de células madre neurales en humanos descartados tejido cortical fetal se describe. Cultivos derivados de enfermedades neurológicas conocidas humanos pueden ser utilizados para la caracterización de los patológicos procesos celulares y moleculares, así como ofrecer una plataforma para evaluar la eficacia farmacológica.

Generación de las células troncales nerviosas de desechados Humanos tejido cortical fetal

Este video demuestra el método para diferenciar células madre neurales humanas de neuroesferas a progenitores neurales y astrocitos utilizando tratamiento enzimático y cultivo en un medio rico en factores de crecimiento, lo que finalmente conduce a la maduración en células progenitoras especializadas.

Diferenciación de células madre neurales humanas en progenitores neurales y astrocitos

Las células madre neurales cosechadas desde el cerebro adulto están aumentando utilizan en aplicaciones que van desde la investigación básica del desarrollo del sistema nervioso para la exploración de potenciales aplicaciones clínicas en medicina regenerativa. Esto hace que el control riguroso de las condiciones de aislamiento y cultivo utilizadas para cultivar estas células críticas para sonar los resultados experimentales.

Cultivo de células madre neurales de Regiones convencionales y no convencionales del cerebro adulto de roedores

Este protocolo describe un nuevo método de cortar mecánico que permite la expansión de la madre y de células progenitoras neurales agregados esféricos sin disociación a una única suspensión de células. Mantener el contacto célula / célula permite un crecimiento rápido y estable durante más de 40 pasajes.

Un método de expansión de GMPc aplicable para agregados de Neural humano madre y células progenitoras derivadas de células madre pluripotentes o tejido cerebral fetal

Se desarrolló un método para derivar directamente las células madre neurales humanas a partir de células progenitoras hematopoyéticas enriquecidas a partir de células de sangre periférica.

La inducción directa de las células madre neurales humanas a partir de células de sangre periférica progenitoras hematopoyéticas

Con la intención de caracterizar los cambios en los miRNAs en células madre neurales humanas diferenciadas (hNSCs) describimos la diferenciación de hNSC en un sistema tridimensional, la evaluación de los cambios en la expresión de microRNA por la matriz de PCR de miRNA, y el análisis computacional para la predicción de objetivos de miRNA y su validación por ensayo de luciferasa dual.

La diferenciación de una línea de células madre neurales humanas en las Tres Culturas de dimensiones, Genes Análisis de microARN y putativo objetivo

La médula espinal de los mamíferos adultos contiene células madre/progenitoras neurales (NSPCs) que pueden ser aisladas y expandidas en cultivo. Este protocolo describe la recolección, el aislamiento, el cultivo y el paso de NSPC generados a partir de la región periventricular de la médula espinal adulta de la rata y de donantes de trasplante de órganos humanos.

Aislamiento de células neurales madre / progenitoras de la región periventricular de la rata de Adultos y de la médula espinal humana

En este estudio, proporcionamos una técnica detallada para un sistema de cultivo de organoides corticales simple pero robusto utilizando cultivos hPSC estándar sin alimentador. Este es un protocolo rápido, eficiente y reproducible para generar organoides que modelan aspectos de la senescencia cerebral in vitro.

Generación robusta y altamente reproducible de organoides cerebrales corticales para modelar la senescencia neuronal cerebral in vitro

Aprende a realizar pases de células madre neurales humanas (hNSPCs) mediante fibronectina y buffer de disociación celular. Este método mejora la reproducibilidad en investigación de neurociencia y biología de células madre.

Pases células madre neurales humanas

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