Name: El análisis de la función de las pequeñas GTPasas de la microinyección de plásmidos en células epiteliales polarizadas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-31T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Aprende a analizar pequeñas GTPasas en células epiteliales polarizadas mediante microinyección de plásmidos. Este método permite estudiar efectos primarios con mínimos efectos secundarios en el tráfico de membranas.

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Este trabajo fue financiado por una beca de los Institutos Nacionales de Salud (GM070736) a H. Fölsch. SF Ang fue apoyado por una beca A * Star de Postgrado, y RS Kang recibió el apoyo de las bases celulares y moleculares de la enfermedad de Programa de Formación (GM8061)

1. Aislamiento de ADN plásmido <ol><li> Use un libre de endotoxinas Sigma-Aldrich kit maxiprep para preparar ADN endotoxinas de acuerdo con el protocolo del fabricante. Este kit funciona para nosotros, ya que elimina las endotoxinas de forma fiable a partir de preparaciones de ADN. Endotoxinas que se les inyecta el ADN en los núcleos celulares se llevan a la muerte celular. </li><li> Añadir 100 ml de fenol / chlorofom / isoamilalcohol (25:24:1) para el ADN aislado, vórtice y vuelta durante 1 minuto a 13.000 rpm en una microcentrífuga Eppendorf. Transferir la fase superior del agua en un tubo nuevo y añadir 100 ml de cloroformo / isoamilalcohol (24:1), vórtice y el giro que el anterior. Transferir la fase superior del agua que contiene el ADN a un tubo nuevo. Este paso es necesario para eliminar las proteínas del ADN, lo que evita la obstrucción de la aguja de microinyección. </li><li> Precipitar el ADN mediante la adición de acetato de sodio (pH 6,0) a una concentración final de 300 mm y 2 x etanol 100% vol. Se incuba a 20 ° C durante la noche. Giro de ADN durante 20 minutos a 13.000 rpm en una microcentrífuga Eppendorf, lavar una vez con etanol al 70%, y resuspender en 300 libre de endotoxinas l de agua (Sigma-Aldrich). </li><li> Determinar la concentración de ADN. A la concentración de ADN típico varía de 1 a 5 g / l. </li></ol> 2. Cultivo de células MDCK <ol><li> Dividir las células MDCK. Recuento de células y las semillas de 4 X 10 5 células en claro de 12 mm filtros Transwell (0,4 micras de tamaño de poro, Corning Costar, 3460). Para un experimento de control que contiene una inyección simulada y dos diferentes proteínas Rab mutante que necesita para sembrar tres filtros. </li><li> Cultura células MDCK en medio MEM con 2 mM L-glutamina, 0,1 mg / ml de penicilina / estreptomicina y el 7% (vol / vol) de suero fetal bovino (= medios de cultivo MEM) a 37 ° C y CO 2 al 5%. </li><li> Cambiar los medios de comunicación en la cámara basolateral todos los días. Esto ayuda al proceso de polarización, porque se parece a la situación de las células epiteliales de los animales. </li><li> Dos días después de la siembra de verificación en un microscopio si las células están creciendo en una monocapa cerrados. Si usted no puede detectar todos los agujeros en la monocapa, lleve a cabo su experimento en el día 3. Si todavía hay agujeros, realizar su experimento en el día 4. </li></ol> 3. Microinyección Procedimiento y incubaciones de post-inyección <ol><li> En el día del experimento preparar 5 ml de medio de cultivo MEM más HEPES 50 mM en una placa de 60 mm x 15 para cada filtro y coloque en un 39 ° C incubadora. Además, estableció un pocillo de una placa de 12 pocillos con un medio de cultivo MEM ml más 50 mM de HEPES y 0,1 mg / ml de cicloheximida por filtro, y el lugar en una incubadora de 31 ° C. </li><li> Encienda el microscopio de microinyección y establecer su etapa calienta a 39 ° C. Nosotros usamos un microscopio invertido (Axiovert 200, Carl Zeiss MicroImaging, Inc.) con una etapa de calefacción, los objetivos 10X y 32X, y una FemtoJet Eppendorf (InjectMan NI2). Por último, abra el tanque de gas nitrógeno, que abastece a la mesa de aire con nitrógeno. </li><li> Diluir el ADN con agua filtrada (0,2 micras uso del filtro) a una concentración final de 0,2 mg / ml en un volumen total de 10 - 100 l. Posteriormente, el giro de ADN en microcentrífuga Eppendorf a 13.000 rpm durante 30 min. Quítele la parte superior y colocar en un tubo nuevo. Este paso asegura que cuando se carga el ADN diluido en la aguja de microinyección con precisión puede cargar "limpia" de ADN. Su ADN está listo para la microinyección. </li><li> Preparar a las células mediante la adopción de el filtro primero de su placa de cultivo. Con una hoja de bisturí (Blade pluma quirúrgica, acero inoxidable, n º 11), corte el filtro del soporte del filtro y el lugar en 5 ml, 39 ° C calentar el medio de crecimiento MEM más 50 mM HEPES (60 x 15 mm plato). Pesar por el filtro de la placa de cultivo de la hoja de bisturí que utilizó para cortarla. Colocarlo en el filtro tal que el agujero de la hoja de bisturí rodea el centro del filtro. Coloque la placa de cultivo en la etapa de calefacción del microscopio. </li><li> Carga 3.2 l de su ADN diluido (en este caso plásmidos codifican VSVGts045-GFP control = inyección simulada) en una aguja de microinyección (Femtotip II, Eppendorf, 930000043), gire la tapa protectora de la aguja y la dejó caer al suelo . Ahora que la aguja está listo para ser atornillada en su soporte. Para hacerlo, pulse la tecla de menú de su InjectMan y asegúrese de que la válvula se cierra. Enrosque la aguja en su soporte, cuidado con el tornillo de la aguja con demasiada fuerza ya que puede conducir a la rotura. A continuación, pulse la tecla de menú de nuevo, la aplicación de P c evitará que los medios de comunicación de ser succionado por la aguja durante el procedimiento microinjeciton. Por último, pulse el joystick para borrar homing almacenados. </li><li> Para bajar la aguja en la celdas, utilice el objetivo de 10X y poner la aguja en el haz de luz por encima del líquido. Ahora se centran en las células, poner el foco de nuevo girando la rueda de enfoque 180 º, y encontrar la aguja. A continuación, mueva lentamente la aguja en el foco, a continuación, llevar a cabo de nuevo el enfoque (de trabajo para acercar a las células en el foco de nuevo), bajar la aguja en lacus de nuevo. Repita hasta que la aguja toca la superficie de los medios de comunicación, momento en el que todo lo que vemos es un halo. Al llegar a un punto en el que las células están en el foco, pero la aguja es aún difusa (es decir, fuera del plano focal) cambio en el objetivo de 32X y una multa ajustes gruesos. </li><li> Establecer el límite z-al tocar la membrana apical con la punta de la aguja y restando alrededor de 10 micras como los núcleos están despidiendo a unos 10 m debajo de la membrana apical. </li><li> Después de establecer el límite de z, encontrar la presión de inyección derecha. Comenzará a las 95 PSI. Si la presión es demasiado alta, las células va a explotar. Si la presión es demasiado baja, aparecerá un punto blanco que se mantiene, pero no pasa nada. Con una inyección de éxito, usted verá un cambio de fase sin cambiar el tamaño de la celda. Para la inyección, deje la aguja de un par de micrones fuera del plano focal lo más rápido posible. Apunta con la aguja por encima del núcleo (es decir, la mitad de una celda individual) y pulse el botón de inyección de su joystick, pero no mantener el botón presionado. </li><li> Inyectar 100-500 células dentro del agujero de la hoja de bisturí que se encuentra en las células. Cuando haya terminado, ponga sus células con la placa de cultivo y la hoja de bisturí en una incubadora de 39 ° C, y se incuba durante 2 horas Durante este tiempo, VSVGts045-GFP se expresa y secreta en la sala de emergencias. Sin embargo, a los 39 ° C, VSVGts045-GFP no se pliegan correctamente y por lo tanto no puede salir de la sala de emergencias. Mientras tanto, la pequeña GTPasa de interés se acumula en el citosol en los experimentos de co-inyección. </li><li> Después de 2 horas, colocar las células en 1 ml de medio de cultivo MEM más HEPES 50 mM y 0,1 cicloheximida mg / ml en una placa de 12 pocillos y se incuba durante 2 horas a 31 ° C. Durante este período de persecución, VSVGts045-GFP se pliegan correctamente, salga de la sala de emergencia y se entrega a la superficie celular. </li><li> Repita los pasos 3,1 a 3,10 para los filtros de dos (inyectar plásmidos que codifican VSVGts045-GFP y, por ejemplo-V5 etiquetados Rab13T22N) y tres (inyectar plásmidos que codifican VSVGts045-GFP y, por ejemplo-V5 etiquetados Rab13Q67L). Cada inyección de unos 20 - 60 min. Sin embargo, es absolutamente crucial para el tratamiento de todos los filtros de la misma manera a lo largo de la incubación la temperatura de cambio y tinción de la superficie hasta que fijar las células. Después de la fijación, puede realizar el resto de su protocolo de tinción para todos los filtros al mismo tiempo. </li></ol> 4. Tinción de la superficie para el análisis de inmunofluorescencia Tenga en cuenta, con el fin de evitar el blanqueo de la señal de las buenas prácticas agrarias de VSVGts045-GFP, proteger a los ejemplares de la luz cubriendo con papel de aluminio durante todos los procedimientos posteriores. <ol><li> Si desea realizar la tinción de la superficie, el lugar a las células en una placa de cultivo en una placa de metal en el hielo y lavar las células con 1X PBS enfriado con hielo 2 + (PBS [0,2 g / litro KCl, 0,2 g / litro KH 2 PO 4, 8 g / l de NaCl y 2,17 g / l de Na 2 HPO 4 x 7 H 2 O], más de 0,1 g / l de CaCl 2 y 0,1 g / litro de MgCl 2 x 6 H 2 O). Posteriormente, el lugar 30 l de un anticuerpo que reconoce el ectodominio de la proteína, en este caso el anticuerpo monoclonal de ratón TK1 (IgG 1, obtenidos a partir de finales de los años Kreis Thomas), en parafina limpia colocada sobre la placa de metal en el hielo. Coloque el filtro con las células de su boca abajo sobre la gota y añadir unas gotas de anticuerpos en la parte posterior del filtro. Incubar durante 1 h sobre hielo. </li><li> Células de lugar en una placa de 12 pocillos, lavar 3 veces con PBS enfriado con hielo 2 + (o RT PBS caliente 2 + sin manchar la superficie antes), y fijar con paraformaldehído 3% durante 15 min a temperatura ambiente. </li><li> Lave las células una vez con PBS 2 + y dejar en PBS 2 + durante 5 min. </li><li> Se incuban las células en el bloqueo / permeabilización de amortiguación (BPB) (2% [wt / vol] BSA, 0,4% [wt / vol] de saponina en PBS 2 +) con un 10% [vol / vol] de suero de cabra. Incubar 1 hora a temperatura ambiente. </li><li> Diluir anticuerpos primarios para detectar la GTPasa Rab expresado, en este ejemplo anti-V5 (anticuerpo monoclonal de ratón IgG2a, Invitrogen), 1:200 en el BPB. Giro anticuerpos diluido en una microcentrífuga Eppendorf durante 10 minutos a 13.000 rpm. Colocar 30 ul de la solución de anticuerpos en parafina limpia en una cámara húmeda. Lugar de las células en el filtro al revés sobre la caída de anticuerpos y se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente. </li><li> Vuelva a colocar las células (lado derecho) en una placa de 12 pocillos y lavar 5 veces durante 30 minutos con BPB a temperatura ambiente. </li><li> Diluir apropiado secundaria de anticuerpos, en este caso de cabra anti-ratón IgG 1 Alexa 594-etiquetado (por VSVG detección en la superficie, Invitrogen), y Cy5-anticuerpos secundarios marcados para reconocer su GTPasa Rab, en este ejemplo de cabra anti-ratón IgG 2a Cy5-etiquetados (Jackson ImmunoResearch), 1:200 a BPB y el giro que el anterior. Lugar 30 l solución de anticuerpos en parafina limpia en una cámara húmeda y las células de lugar en boca del filtro hacia abajo en la caída de anticuerpos. Incubar 1 hora a temperatura ambiente. </li><li> Repita el paso 4.6. </li><li> Sumerja las células en el filtro 3 veces en agua destilada y el lugar rpor lado DERECHO en portaobjetos. Añadir 10-15 l montaje (10% [wt / vol] DABCO, el 50% [wt / vol] de glicerol en agua destilada) en la parte superior de las células. 18x18 mm lugar de vidrio cubierta de micro en la parte superior y el uso de pañuelos de papel y presione suavemente la tapa de vidrio micro a las células. Sello con esmalte de uñas. </li><li> Analizar las muestras con un microscopio confocal. Se utilizó un Microsystem LSM 510, Carl Zeiss MicroImaging, Inc., que estaba equipado con un lente de 63X de inmersión en agua. </li><li> Para la preparación de las figuras, ajustar y combinar imágenes con programas como Adobe Photoshop y Adobe Illustrator. </li></ol> 5. Resultados representante Para ver ejemplos de cómo la co-expresión de proteínas G pequeñas interfiere con VSVG clasificación amablemente se refieren a los artículos publicados, ya sea para missorting apical 3, 4 o la inhibición de la entrega de la superficie de 7. <img src="/files/ftp_upload/2645/2645fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. En la inyección simulada, es decir, una inyección de sólo el plásmido que codifica VSVGts045-GFP, la proteína se entrega a la superficie basolateral de bien polarizado células MDCK a juzgar por la tinción de la superficie (en rojo, la Figura 1 A). Tenga en cuenta que no todos los VSVGts045-GFP se entrega a la membrana basolateral durante la persecución a 31 ° C como se evidencia por la señal intracelular amplia para la proteína total (en verde, las figuras 1 A y B). En las células que no están bien polarizadas VSVGts045-GFP se entregará también a la membrana apical (Figura 1 B). Si sus muestras de control de parecerse a la de células B en la Figura 1, no se puede confiar en sus datos y tener que repetir el experimento con células polarizadas mejor. Las barras de escala es de 5 micras.

<ol><li>Mellman, I., Nelson, W. J. Nature reviews. 9 (11), 833-833 (2008).</li>
<li>Rodriguez-Boulan, E., Kreitzer, G., Musch, A. Nature reviews. 6 (3), 233-233 (2005).</li>
<li>Ang, A. L., Fölsch, H., Koivisto, U. M. The Journal of cell biology. 163 (2), 339-339 (2003).</li>
<li>Kroschewski, R., Hall, A., Mellman, I. Nature cell biology. 1 (1), 8-8 (1999).</li>
<li>Moskalenko, S., Henry, D. O., Rosse, C. Nature cell biology. 4 (1), 66-66 (2002).</li>
<li>Schuck, S., Gerl, M. J., Ang, A. Traffic (Copenhagen, Denmark). 8 (1), 47-47 (2007).</li>
<li>Nokes, R. L., Fields, I. C., Collins, R. N. The Journal of cell biology. 182 (5), 845-845 (2008).</li>
<li>Collins, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cell%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Molecular cell.</a> 12, 1064-1064 (2003).</li>
<li>Hall, A. Science (New York, N.Y. 279 (5350), 509-509 (1998).</li>
<li>Scales, S. J., Pepperkok, R., Kreis, T. E. Cell. 90 (6), 1137-1137 (1997).</li>
<li>Keller, P., Toomre, D., Diaz, E. Nature cell biology. 3 (2), 140-140 (2001).</li>
</ol>

Los pasos más importantes para un experimento de microinyección éxito son la calidad y pureza del ADN y la polaridad de las células. Sin células polarizadas, el control de la inyección ya se han mistargeted VSVG y el experimento no se puede utilizar. Si el ADN es de mala calidad, el ADN puede obstruir la aguja de inyección que lleva a los pobres o no la expresión de la proteína deseada en absoluto. Además, es aconsejable usar plásmidos de expresión que se sabe que conducen a altos niveles de expresión como pRKV. <p ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Axiovert 200 Microscopio con la etapa calienta </td><td> Carl Zeiss Inc </td><td> La orden de encargo </td></tr><tr><td> InjectMan NI2 FemtoJet micromanipulador </td><td> Eppendorf </td><td> La orden de encargo </td></tr><tr><td> Femtotips II (agujas de microinyección) </td><td> Eppendorf </td><td> 930000043 </td></tr><tr><td> Microloader consejos </td><td> Eppendorf </td><td> 930001007 </td></tr><tr><td> Claro de 12 mm Transwell filtro admite </td><td> Corning Costar </td><td> 3460 </td></tr><tr><td> Endotoxinas libres para el plásmido maxiprep </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> NA0400 </td></tr></tbody></table>

el análisis de la función de las pequeñas gtpasas de la microinyección de plásmidos en células epiteliales polarizadas

Analyzing the Function of Small GTPases by Microinjection of Plasmids into Polarized Epithelial Cells

Las células epiteliales polarizar su membrana plasmática en los dominios apical y basolateral de vista bioquímico y funcionalmente diferentes, donde el dominio apical se enfrenta a la &#39;libre&#39; y las superficies de la membrana basolateral está en contacto con el sustrato y las células vecinas. Ambos dominios de la membrana están separados por uniones estrechas, que forman una barrera de difusión. Apical-basolateral polarización se pueden recapitular con éxito en el cultivo cuando las células epiteliales como el riñón canino Madin-Darby (MDCK) se siembran a alta densidad en los filtros de policarbonato y se cultivan durante varios días 1 2. Establecimiento y mantenimiento de la polaridad celular está regulado por una serie de pequeñas GTPasas de la superfamilia Ras como Rala, Cdc42, Tab8, Rab10 y Rab13 3 4 5 6 7. Al igual que todas las GTPasas estas proteínas del ciclo entre una inactivos PIB determinada del Estado y un Estado activo GTP. Mutaciones específicas en las regiones de unión de nucleótidos interferir con este ciclo de 8. Por ejemplo, Rab13T22N está permanentemente encerrado en el PIB de forma y por lo tanto llamado &quot;dominante negativo&quot;, mientras que Rab13Q67L ya no pueden hidrolizar GTP y por lo tanto encerrado en una &quot;dominante activo&quot; del Estado 7. Para analizar su función en las células de los dos alelos dominantes negativos activa y dominante de GTPasas se suelen expresar en niveles altos para interferir con la función de las proteínas endógenas 9. Una manera elegante de alcanzar altos niveles de sobre-expresión en un corto período de tiempo es la introducción de los plásmidos que codifican las proteínas relevantes directamente en los núcleos de las células polarizadas crecido en el filtro admite el uso de la técnica de microinyección. Esto se combina a menudo con la co-inyección de reportero plásmidos que codifican los receptores de la membrana plasmática que están específicamente ordenados en el dominio apical o basolateral. Una carga usados ​​para analizar la carga de clasificación para el dominio basolateral es un alelo sensible a la temperatura de la glicoproteína del virus de la estomatitis vesicular (VSVGts045) 10. Esta proteína no se pueden plegar correctamente a 39 ° C y por lo tanto se mantendrá en el retículo endoplasmático (ER), mientras que la proteína reguladora de interés se monta en el citosol. Un cambio a 31 ° C, entonces permitirá que VSVGts045 a veces bien, salir de la sala de emergencia y los viajes a la membrana plasmática 11. Esta persecución se realiza generalmente en presencia de cicloheximida para prevenir la síntesis de proteínas mayor que conduce a resultados más limpios. A continuación se describe en detalle el procedimiento de la microinyección de plásmidos en células polarizadas y incubaciones posteriores incluyendo los cambios de temperatura que permiten un análisis completo de las proteínas reguladoras implicadas en la clasificación basolateral.

Este artículo detalla los procedimientos involucrados en la sobreexpresión y el análisis de las pequeñas GTPasas en células epiteliales polarizadas utilizando la técnica de microinyección.

El análisis de la función de las pequeñas GTPasas de la microinyección de plásmidos en células epiteliales polarizadas

Las células epiteliales polarizan su membrana plasmática en dominios apical y basolateral, bioquímica y funcionalmente distintos, donde el dominio apical se orienta hacia...

Este procedimiento analiza los efectos de las pequeñas GTPasas sobre el tráfico polarizado de membranas. Primero, coinyecte plásmidos de ADN que codifican la pequeña GTPasa y las proteínas reporteras en los núcleos celulares de células polarizadas. Luego, exprese el ADN a temperaturas que detengan las proteínas reporteras en el retículo endoplásmico o en el TGN, mientras la pequeña GTPasa se acumula en el citosol, y proceda a rastrear la proteína reportera hacia la superficie celular en presencia de cicloheximida para evitar la síntesis de nuevas proteínas.Finalmente, marque la proteína reportera en la superficie celular para el análisis de inmunofluorescencia. Los resultados obtenidos mediante este ensayo permiten visualizar el cambio en la localización superficial mediante microscopía confocal. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la transfección es que, durante los breves periodos de sobreexpresión logrados mediante microinyección, los efectos secundarios son mínimos, lo que nos permite estudiar los efectos primarios de las proteínas de interés.Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la polaridad celular, como cómo la gtpasa pequeña regula el tráfico polarizado de membranas. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos individuales necesarios para una microinyección exitosa son difíciles de explicar sin ayuda visual. Aísle el ADN plasmídico libre de endotoxinas con el kit maxi prep libre de endotoxinas de Sigma Aldrich según el protocolo del fabricante. Para este experimento, utilice tres filtros transbien transparentes de 12 milímetros y tamaño de poro de 0.4 micrómetros para el cultivo.Las células se siembran cuatro veces diez a la quinta potencia de células MDCK en cada filtro. Después de dos días, examine el cultivo bajo un microscopio para verificar que las células estén creciendo en una monocapa cerrada. Para microinyección.El día de la microinyección, prepare placas de 360 por 15 milímetros con cinco litros de medio de crecimiento MM más 15 milimolar de hepes y colóquelas en un incubador a 39 grados Celsius. Además, prepare tres placas de 12 pocillos con un mililitro de medio de crecimiento MEM más 50 milimolar de hepes y 0,1 miligramo por mililitro de cicloheximida, y colóquelas en un incubador a 31 grados Celsius. Encienda el microscopio de microinyección, configurado con este microscopio invertido con platina calefaccionada, objetivos de 10 x y 32 x, y un einor femto jet.Coloque la platina calefactada a 39 grados Celsius. También abra el suministro del tanque de gas nitrógeno hacia la mesa antivibraciones. Ahora diluya el ADN con agua filtrada hasta una concentración final de 0,2 miligramos por mililitro.Posteriormente, centrifugar el ADN en una microcentrífuga einor a 13.000 RPM durante 30 minutos. Retirar la porción superior y colocarla en un tubo nuevo. A continuación, preparar las células MDCK extrayendo el primer filtro de su placa de cultivo con la hoja quirúrgica, cortar el filtro del soporte y colocarlo en la placa preparada de 60 por 15 milímetros que contiene cinco mililitros de medio de crecimiento MEM calentado a 39 grados Celsius más 50 milimolar de hepes.Para sujetar el filtro en la placa de cultivo, coloque la hoja de bisturí en el centro del filtro y luego transfiera la placa de cultivo a la platina calentada del microscopio. Cargue de dos a tres microlitros del ADN diluido en una aguja de microinyección. Gire la cubierta protectora de la aguja y déjela caer al suelo.Para colocar la aguja en el soporte, presione la tecla de menú de la inyección y asegúrese de que la válvula esté cerrada. Enrosque la aguja en su soporte. Tenga cuidado de no apretar demasiado la aguja.Como esto podría provocar una rotura, presione nuevamente la tecla de menú. De este modo, la presión de compensación aplicada evitará que el medio sea succionado hacia la aguja durante el procedimiento de microinyección. Finalmente, pulse el joystick para borrar la posición de referencia almacenada y bajar la aguja sobre las células.Utilice el objetivo de 10x y coloque la aguja en el haz de luz por encima del líquido. Enfoque ahora las células. Enfoque hacia arriba nuevamente girando la rueda de enfoque 180 grados hacia arriba y localice la aguja.Mueva lentamente la aguja hasta enfocarla. Luego, desenfóquela nuevamente. Trabaje para volver a enfocar las células.Baje nuevamente la aguja hasta enfocarla. Repita hasta que la aguja toque la superficie del medio, momento en el cual se observará un halo. Continúe hasta alcanzar el punto en que las células estén enfocadas, pero la aguja aún esté borrosa fuera del plano focal.Ahora cambie al objetivo de 32 x y encuentre los ajustes generales. Establezca el límite Z tocando la membrana apical con la punta de la aguja y restando aproximadamente 10 micrómetros, ya que los núcleos se encuentran a unos 10 micrómetros por debajo de la membrana apical.Ahora saque la aguja unos pocos micrones del plano focal lo más rápido posible. Apunte con la aguja por encima del núcleo y presione y suelte el botón de inyección del joystick. Comience con 95 PSI para encontrar la presión de inyección adecuada.Si la presión es demasiado alta, las células estallan. Si la presión es demasiado baja, persiste un punto blanco, pero no ocurre nada más. Realice una inyección exitosa que implique un cambio de fase sin un cambio en el tamaño celular.Inyecte de 100 a 500 células dentro del orificio de la hoja quirúrgica que se encuentra sobre las células. Luego, coloque las células junto con la placa de cultivo y la hoja quirúrgica en un incubador a 39 grados Celsius y incube durante dos horas. Finalmente, transfiera las células a la placa de 12 pocillos preparada con un mililitro de MEM más 50 milimolar 0,1 miligramo por mililitro de cicloheida e incube durante dos horas a 31 grados Celsius.Para evitar el blanqueo de la señal de GFP expresada, proteja las muestras de la luz cubriéndolas con papel de aluminio durante todos los procedimientos posteriores de tinción de superficie. Coloque las células en una placa de cultivo sobre una placa metálica con hielo y lávelas. Una vez con PBS frío más más, coloque un trozo limpio de paraform sobre la placa metálica con hielo y agregue gotas de 30 microlitros de un anticuerpo que reconozca el dominio ectópico de la proteína de interés mediante pipeta.Ahora coloque el filtro que contiene las células boca abajo sobre la gota y agregue unas gotas de anticuerpo en la parte posterior del filtro. Incube durante una hora en hielo. Lave las células tres veces con PBS frío con hielo más más y fije con paraformaldehído al 3% durante 15 minutos a temperatura ambiente.Proceda a lavar las células una vez con PBS más más y equilibrar en PBS más más durante cinco minutos. Incube ahora las células en tampón bloqueante permeabilizante. Incube una hora a temperatura ambiente, diluya los anticuerpos primarios uno a 200 en BPB para detectar la RAB GTP ASA expresada, centrifugue durante 10 minutos a 13.000 RPM, pipetee 30 microlitros de la solución de anticuerpos sobre un parafilm limpio colocado en una cámara húmeda.Coloque las células sobre el filtro boca abajo sobre las gotas de anticuerpo e incube durante una hora. A temperatura ambiente, coloque nuevamente las células en posición normal hacia arriba en una placa de 12 pocillos y lave cinco veces durante 30 minutos con BPB a temperatura ambiente después de la incubación con los anticuerpos secundarios apropiados, incluyendo un paso de lavado.Sumerja las células en el filtro tres veces en agua desionizada y colóquelas con el lado derecho hacia arriba sobre portaobjetos con 10 microlitros de medio de montaje. Coloque un cubreobjetos micro de 18 por 18 milímetros encima y, utilizando pañuelos faciales, presione suavemente el cubreobjetos sobre las células. Finalmente, selle con esmalte de uñas en la inyección simulada solo del plásmido que codifica V-S-V-G-T-S-O 45 GFP. La proteína se entrega a la superficie basolateral de células MDCK bien polarizadas, según lo indicado por la tinción superficial roja en células que no están bien polarizadas.Alguna parte de la proteína de fusión GFP será transportada a la membrana apical. Si las muestras de control presentan este aspecto, los datos no son confiables y el experimento debe repetirse con células mejor polarizadas. Tenga en cuenta que no toda la proteína de fusión expresada hacia GFP es transportada a la membrana basolateral durante el período de seguimiento a 31 grados Celsius, como lo demuestra la intensa señal verde intracelular para la proteína total. Una vez dominada, esta técnica debería llevar aproximadamente de 10 a 12 horas tras su desarrollo.Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo del tráfico de membranas exploraran proteínas reguladoras en células epiteliales polarizadas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo expresar proteínas en células epiteliales polarizadas utilizando la técnica de microinyección.

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Esta presentación demuestra un método mediante el cual la electroporación de células adherentes y cultivadas se utiliza para el estudio de la comunicación intercelular y de unión, mientras las células crecen en un portaobjetos recubierto con óxido de indio-estaño conductor y transparente.

Un ensayo funcional para Gap Junctional examen; La electroporación de células adherentes de indio-óxido de estaño

Este protocolo compara las afinidades relativas de los socios de unión para las GTPasas de la familia Rho, incluyendo Rac1. In vivo, las proteínas de unión a Rac1 compiten por una única interfaz de unión, cuya conformación está dictada por un nucleótido unido. El nucleótido es importante y difícil de controlar experimentalmente, debido a la alta tasa de hidrólisis.

La comparación de la afinidad de unión a proteínas GTPasa-utilizando ensayos de competición

Describimos un método para experimentos de agotamiento-rescate que preserva la integridad celular y la homeostasis de las proteínas. La adenofección permite análisis funcionales de proteínas dentro de procesos biológicos que se basan en dinámicas basadas en actina finamente ajustadas, como la división celular mitótica y la miogénesis, a nivel de una sola célula.

Adenofection: Un método para estudiar el papel de las chaperonas moleculares en Morfodinámica celular mediante experimentos de reducción-Rescate

La unión a trifosfato de guanosina (GTP) es uno de los primeros eventos en la activación de receptores acoplados a proteína G (GPCR). Este protocolo describe cómo caracterizar farmacológicamente las interacciones específicas de GPCR-ligando mediante la monitorización de la unión del análogo de GTP marcado con radio, [35S] guanosina-5'-O- (3-tio) trifosfato ([35S] GTPγS), en Respuesta a un ligando de interés.

Medición de la señalización del receptor acoplado a la proteína G mediante unión de GTP marcada con radio

Describimos cómo técnicas de micro - y Fotomanipulación como FRAP y fotoactivación permiten la determinación de los parámetros de motilidad y la dinámica espacio-temporal de las proteínas a migración de las células. Lecturas experimentales incluyen la dinámica subcelular y facturación de los reguladores de la motilidad o subyacente del citoesqueleto de actina.

Técnicas de micromanipulación que permite el análisis de las dinámicas morfogenéticas y facturación de los reguladores citoesqueléticos

Aquí se describe un protocolo para investigar la Prenilación y guanosina-5'-trifosfato (GTP)-carga de la GTPasa Rho. Este protocolo consta de dos métodos detallados, es decir, ensayo de fraccionamiento de la membrana y un GTPasa-ligado del inmunosorbente. El protocolo puede ser usado para medir la Prenilación y GTP carga de diferentes otras GTPasas pequeñas.

Detección de la pequeña GTPasa Prenilación y GTP obligatorio usar membrana fraccionamiento y GTPasa-linked Immunosorbent Assay

Aquí, presentamos un protocolo de electroporación in vitro reproducible para la manipulación genética de precursores primarios de células granulares cerebelosas (GCP) que es rentable, eficiente y viable. Además, este protocolo también demuestra un método sencillo para el estudio molecular de las vías de señalización de Hedgehog dependientes del cilio primario en células GCP primarias.

Método de electroporación eficiente y rentable para estudiar las vías de señalización primarias dependientes del cilio en el precursor de células granulares

Aprende a analizar pequeñas GTPasas en células epiteliales polarizadas mediante microinyección de plásmidos. Este método permite estudiar efectos primarios con mínimos efectos secundarios en el tráfico de membranas.

El análisis de la función de las pequeñas GTPasas de la microinyección de plásmidos en células epiteliales polarizadas

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