El análisis de la función de las pequeñas GTPasas de la microinyección de plásmidos en células epiteliales polarizadas

Este procedimiento ensaya los efectos de pequeñas ACEs GTP sobre el tráfico de membranas polarizadas. En primer lugar, se inyectan plásmidos de ADN que codifican el pequeño GTP ACE y las proteínas reporteras en los núcleos celulares de las células polarizadas. A continuación, extraiga el ADN a temperaturas que detengan las proteínas reporteras en el retículo endoplásmico o el TGN, mientras que el pequeño GTPA se acumula en el citosol, proceda a perseguir la proteína reportera hasta la superficie celular en presencia de cicloheide para evitar una mayor síntesis de proteínas.

Por último, marque la proteína reportera en la superficie celular para el análisis de inmunofluorescencia. Los resultados obtenidos de este ensayo permiten visualizar el cambio en la localización de la superficie a través de la microscopía confocal. La principal ventaja de esta técnica de métodos existentes como el trans transfect es que durante los cortos tiempos de sobreexpresión logrados con la microinyección, los efectos secundarios son mínimos, lo que nos permite estudiar los efectos primarios de las proteínas de interés.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de polaridad de la célula, como qué tan pequeño es el gtpa que regula el tráfico de membrana polarizada. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos individuales necesarios para una microinyección exitosa son difíciles de explicar sin ayuda visual Aísle el ADN plasmático libre de endotoxinas con el kit de preparación maxi sin endotoxinas Sigma Aldrich de acuerdo con el protocolo del fabricante. Para este experimento, utilice tres filtros transparentes de 12 milímetros de poro de 0,4 micrómetros para cultivar.

Las celdas se asientan cuatro veces 10 de las quintas celdas MDCK en cada filtro. Después de dos días, examine el cultivo bajo un microscopio para verificar que las células estén creciendo en una monocapa cerrada. Para microinyección.

El día de la microinyección, prepare placas de 360 por 15 milímetros de medio de crecimiento MM de cinco litros más 15 milímetros y colóquelas en una incubadora de 39 grados centígrados. Además, prepare tres placas de 12 pocillos de un mililitro de medio de crecimiento MEM más 50 milimolares heis y 0,1 miligramos por mililitro de cicloheximida y colóquelas en una incubadora a 31 grados centígrados. Encienda el microscopio de microinyección, configurado como este microscopio invertido con objetivos de etapa calentada de 10 x y 32 x, y un chorro einor femto.

Ajuste el escenario calentado a 39 grados centígrados. Abra también el suministro del tanque de gas nitrógeno a la mesa de aire. Ahora diluya el ADN con agua filtrada hasta una concentración final de 0,2 miligramos por mililitro.

A continuación, centrifugar el ADN en una microcentrífuga einor a 13.000 rpm durante 30 minutos. Retire la parte superior y colóquela en un tubo nuevo. A continuación, prepare las células MDCK sacando el primer filtro de su placa de cultivo con la cuchilla quirúrgica, corte el filtro del portafiltros y colóquelo en la placa preparada de 60 por 15 milímetros que contiene cinco mililitros de medios de crecimiento MEM calentados a 39 grados Celsius más 50 milimolares heis.

Para pesar el filtro en la placa de cultivo, coloque la cuchilla quirúrgica en el centro del filtro y luego transfiera la placa de cultivo a la etapa calentada del microscopio. Cargue de dos a tres microlitros del ADN diluido en una aguja de microinyección. Gira la cubierta protectora de la aguja y déjala caer al suelo.

Para colocar la aguja en el soporte, presione la tecla de menú de la inyección y asegúrese de que la válvula esté cerrada. Enrosca la aguja en su soporte. Tenga cuidado de no enroscar la aguja demasiado fuerte.

Como eso puede provocar roturas, vuelva a presionar la tecla de menú. Por lo tanto, la presión de compensación aplicada evitará que el medio sea aspirado por la aguja durante el procedimiento de microinyección. Finalmente, toque el joystick para borrar el homing almacenado para bajar la aguja sobre las celdas.

Use el objetivo 10 x y lleve la aguja hacia el haz de luz por encima del líquido. Ahora concéntrate en las células. Vuelve a enfocar girando la rueda de enfoque 180 grados hacia arriba y encuentra la aguja.

Mueva lentamente la aguja para enfocarla. A continuación, vuelve a sacarlo de foco. Trabajando para volver a enfocar las células.

Vuelve a enfocar la aguja. Repita hasta que la aguja toque la superficie del medio, momento en el que se observa un halo. Continúe alcanzando el punto en el que las células están enfocadas, pero la aguja aún está borrosa fuera del plano focal.

Ahora cambie al objetivo 32 x y busque la configuración del curso. Establezca el límite Z tocando la membrana apical con la punta de la aguja y restando unos 10 micrómetros. Como los núcleos se encuentran aproximadamente a 10 micrómetros por debajo de la membrana apical.

Ahora saque la aguja un par de micras del plano focal lo más rápido posible. Apunte con la aguja por encima del núcleo y presione y suelte el botón de inyección del joystick. Comience a 95 PSI para encontrar la presión de inyección correcta.

Si la presión es demasiado alta, las células explotan. Si la presión es demasiado baja, persiste un punto blanco, pero no sucede nada más. Realice una inyección exitosa que implique un cambio de fase sin un cambio de tamaño de celda.

Inyecte de 100 a 500 células dentro del orificio de la cuchilla quirúrgica que se encuentra sobre las células. A continuación, coloque las células con la placa de cultivo y la cuchilla quirúrgica en una incubadora a 39 grados centígrados e incube durante dos horas. Finalmente, transfiera las células a la placa preparada de 12 pocillos de un mililitro, MEM más 50 milimolares de 0,1 miligramos por mililitro, cicloheide e incube durante dos horas a 31 grados centígrados.

Para evitar el blanqueo de la señal GFP expresada, proteja las muestras de la luz cubriéndolas con papel de aluminio durante todos los procedimientos posteriores de tinción de superficies. Coloque las células en una placa de cultivo sobre una placa de metal con hielo y lave. Una vez con PBS plus plus plus helado en hielo, coloque una pieza limpia de paraform en la placa metálica sobre hielo pipetea 30 gotas de microlitros de un anticuerpo que reconoce el dominio ecto de la proteína de interés.

Ahora coloque el filtro que contiene células boca abajo sobre la gota y agregue unas gotas de anticuerpo en la parte posterior del filtro. Incubar durante una hora en hielo. Lave las células tres veces con PBS plus plus helado y fíjelas con aldehído paraforme al 3% durante 15 minutos a temperatura ambiente.

Proceda a lavar las celdas una vez con PBS plus plus y equilibre en PBS plus plus durante cinco minutos. Ahora incube las células en un tampón permeable de bloqueo. Incubar una hora a temperatura ambiente, diluir los anticuerpos primarios de uno a 200 en BPB para detectar la centrífuga RAB GTP ACE expresada durante 10 minutos A 13, 000 RPM pipeta, 30 microlitros de la solución de anticuerpos en un parámetro limpio colocado en una cámara húmeda.

Coloque las células del filtro boca abajo sobre las gotas de anticuerpos e incube durante una hora. A temperatura ambiente, vuelva a colocar las celdas con el lado derecho hacia arriba en un 12. Coloque y lave cinco veces durante 30 minutos con BPB a temperatura ambiente después de la incubación con anticuerpos secundarios apropiados, incluido un paso de lavado.

Sumerja las celdas del filtro tres veces en agua desionizada y colóquelas con el lado derecho hacia arriba sobre micro portaobjetos a 10 microlitros de montura, coloque un micro vidrio cubierto de 18 por 18 milímetros encima y, con pañuelos faciales, presione suavemente el cubreobjetos sobre las celdas. Finalmente, selle con esmalte de uñas en la inyección simulada de solo el plásmido que codifica V-S-V-G-T-S-O 45 GFP. La proteína se administra a la superficie basolateral de las células MDCK bien polarizadas, a juzgar por la tinción de la superficie roja en las células que no están bien polarizadas.

Parte de la proteína de fusión GFP se entregará a la membrana apical. Si los especímenes de control se ven así, no se puede confiar en los datos y el experimento debe repetirse con celdas mejor polarizadas. Nótese que no toda la fusión expresada a GFP se entrega a la membrana basolateral durante la persecución de 31 grados centígrados, como lo demuestra la extensa señal verde intracelular para la proteína total Una vez dominada, esta técnica debería tardar aproximadamente de 10 a 12 horas después de su desarrollo.

Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo del tráfico de membranas exploraran proteínas reguladoras en células epiteliales polarizadas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo expresar proteínas en células epiteliales polarizadas mediante la técnica de microinyección.