La comparación de la afinidad de unión a proteínas GTPasa-utilizando ensayos de competición

El objetivo general de este procedimiento es comparar las afinidades relativas de los ligandos proteicos para las GTPas de la familia Row bajo condiciones cuidadosamente controladas de carga con nucleótidos. Esto se logra primero purificando los posibles ligandos competitivos, cada uno marcado con la misma etiqueta, por ejemplo, proteína verde fluorescente o GFP. El segundo paso consiste en purificar la GTPA de interés.

Por ejemplo, RAC uno y cargarlo con el nucleótido apropiado para alcanzar el estado de señalización GTPA deseado. A continuación, el GTPA cargado con nucleótido se incuba con una cantidad fija de un competidor de unión y cantidades crecientes del otro competidor de unión para obtener una curva de titulación de unión. El paso final consiste en separar las proteínas unidas a la GTpasa inmovilizada mediante electroforesis en gel y transferencia a membrana (western blot) y sondar la membrana para detectar la etiqueta GFP que comparten los dos socios de unión.

En última instancia, el inmunotransferencia se utiliza para identificar las concentraciones relativas a las cuales se captura una cantidad similar de cada compañero de unión marcado con GFP mediante la GTPasa. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la coprecipitación es que las propiedades de unión proteica de gtpa están dictadas por el nucleótido unido en la célula. El nucleótido unido es lábil, lo que dificulta la interpretación de los datos de unión proteica.

Comience este procedimiento con la purificación de G tpa marcada con GST y la expresión de proteínas que se unen a gtpa, como se detalla en el protocolo escrito. Lave los frascos de células transfectadas con solución salina tamponada con fosfato o PBS y drene el frasco durante cinco minutos. Aspire el líquido libre, luego raspe las células en 500 microlitros de tampón de lisis y colóquelas en un tubo microfuga, mezcle las células para lisarlas mediante inversión a cuatro grados Celsius durante 30 minutos.

Durante la lavado de la lisis, lave dos lotes de 40 microlitros de perlas GFP trap tres veces con tampón de lisis fresco. Sedimente las perlas a 2.700 × g durante dos minutos entre cada lavado. Tras la lisis, clarifique los lisados mediante centrifugación a 21.000 × g durante 10 minutos.

Transfiera el lisado clarificado de cada una de las proteínas competidoras a perlas de captura de GFP lavadas por separado. Permita que las proteínas de fusión GFP se unan durante dos horas, mezclando mediante inversión a cuatro grados Celsius. Lave las perlas de captura de GFP cargadas dos veces con tampón de lisis y dos veces con tampón de competencia.

Centrifugar las perlas en tampón de unión a 2.700 ×g durante dos minutos entre cada lavado. Eluir las proteínas de fusión GFP añadiendo 40 microlitros de glicina 0,2 M y pipeteando arriba y abajo durante 30 segundos; inmediatamente centrifugar las perlas a 21.000 ×g durante 60 segundos y transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de centrífuga que contenga cuatro microlitros de Tris-HCl 1 M. Realizar este paso rápidamente para limitar el daño a la proteína purificada. Analizar un microlitro de cada proteína purificada mediante inmunotransferencia (western blot) y detectar con un anticuerpo anti-GFP para determinar el rendimiento relativo, utilizando un sistema de inmunotransferencia cuantitativo según el protocolo del fabricante.

Igualar la concentración molar de proteína mediante la adición de tampón de unión competitiva. Tomar 90 microlitros de las perlas GST preparadas del bastidor uno y lavar tres veces con tampón de carga de nucleótido utilizando un clasificador magnético de partículas para precipitar las perlas en cada paso. Aspirar el tampón de las perlas y añadir 100 microlitros de tampón de carga de nucleótido según se requiera carga con G-D-P-G-T-P o sin nucleótido.

Para el experimento de competencia, añada 12 microlitros de GDP 100 milimolar, 12 microlitros de GTP gamma S 10 milimolar o ningún nucleótido a 60 microlitros de perlas GST rack1 para los controles de carga de nucleótidos. Divida las perlas restantes en tres cuartas partes de 10 microlitros y añada 2 microlitros de GDP 100 milimolar, 2 microlitros de GTP gamma S 10 milimolar o ningún nucleótido a cada tubo. Incube las mezclas de perlas durante 30 minutos a 30 grados Celsius con agitación.

Estabilice el bastidor con nucleótido unido, añadiendo un molar de cloruro de magnesio a la mezcla experimental y a las mezclas de control para realizar la unión competitiva. Prepare seis tubos microcéntrifugos, cada uno conteniendo 200 microlitros de tampón de unión competitiva.

Cada tubo también debe contener 10 microlitros del estante cargado con nucleótidos, una perla y cinco microlitros del estante. Como proteína de unión constante, añada a cada tubo 0, 1, 2, 0,55, 10 u 20 microlitros del estante de la proteína de unión A; como proteína de unión variable, añada la proteína de unión B. Estos volúmenes suponen concentraciones de stock aproximadamente iguales para las proteínas de unión constante y variable, y podrían necesitar ajustes.

Lleve el volumen total de la mezcla de unión a 235 microlitros mediante la adición del tampón de unión competitiva. A continuación, prepare un tubo de microcentrífuga que contenga 200 microlitros del tampón competitivo. 10 microlitros del portapipetas cargado con nucleótido experimental, un gránulo y 10 microlitros del portapipetas uno proteína A de unión. Luego, prepare los tubos control de G-D-P-G-T-P gamma S y sin nucleótido según se describe en el protocolo del texto.

Incube los tubos durante dos horas mezclando por inversión a cuatro grados Celsius tras la incubación. Lave las perlas tres veces con el tampón de unión de competición. Finalmente, eluya las proteínas unidas en 20 microlitros de tampón muestral reductor.

El inmunoensayo cuantitativo por transferencia de proteínas (western blot) de la etiqueta GFP de GFP RCC dos y GFP Corona en un dominio C-Propeller purificados revela que la proteína en la banda superior, GFP RCC dos, es 1,4 veces más abundante que la banda inferior y debe diluirse para lograr una relación molar uno a uno en el experimento de competencia. Un experimento control demuestra que el estado de carga de nucleótidos de rack uno dicta la especificidad de unión, titulando volúmenes crecientes de GFP RCC dos frente a un volumen fijo de GFP Corona en un dominio C-Propeller equimolar y realizando la transferencia. Las proteínas que se unen a rack uno permiten visualizar el cambio relativo en la proteína unida graficando las intensidades de las bandas GFP de ambos competidores en el mismo gráfico, y la identificación del punto en el que se cruzan las líneas permite determinar el volumen de proteína de unión variable en equilibrio.

Sin embargo, se debe tener cuidado para asegurar que problemas como la interacción entre competidores o un exceso de cebo GTPa no comprometan el experimento. Un aumento en un competidor sin la pérdida del otro, como se muestra aquí, indica un problema mientras se realiza este procedimiento. Es importante recordar verificar que exista una relación recíproca entre la abundancia de los factores de unión competidores.

Existen varios problemas que pueden distorsionar los resultados o que pueden resolverse siempre que se identifiquen mediante la inspección de los datos.