La comparación de la afinidad de unión a proteínas GTPasa-utilizando ensayos de competición

El objetivo general de este procedimiento es comparar las afinidades relativas de los socios de unión a proteínas para las ACE GT P de la familia Row en condiciones de carga de nucleótidos cuidadosamente controladas. Esto se logra purificando primero los socios de unión competitivos putativos, cada uno etiquetado con la misma etiqueta, por ejemplo, proteína fluorescente verde o GFP. El segundo paso es purificar el GTPA de interés.

Por ejemplo, RAC uno y cargar con el nucleótido apropiado para lograr el estado de señalización GTPA deseado. A continuación, el gtpa cargado de nucleótidos se incuba con una cantidad fija de un competidor de unión y cantidades crecientes del otro competidor de unión para lograr una curva de unión de valoración. El paso final es resolver las proteínas unidas a la pasa GT inmovilizada mediante Western blot y sondear la membrana en busca de la etiqueta GFP que se comparte entre los dos socios de unión.

En última instancia, la Western blot se utiliza para identificar las concentraciones relativas en las que la GTPasa captura cantidades similares de cada socio de unión marcado con GFP. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la coprecipitación, es que las propiedades de unión a proteínas de gtpa están dictadas por el nucleótido unido en la célula. El nucleótido unido es lábil, lo que dificulta la interpretación de los datos de unión a proteínas.

Comience este procedimiento con la purificación de G tpa marcado con GST y la expresión de las proteínas de unión a gtpa como se detalla en el protocolo de texto. RIN los matraces de células transfectadas en solución salina tampón fosfato o PBS y drenar el matraz durante cinco minutos. Aspirando el líquido libre, luego raspando las células en 500 microlitros de tampón de lisis en un tubo de micro fuga, mezcle las células para lisar por inversión a cuatro grados Celsius durante 30 minutos.

Durante la lisis, lave tres veces dos lotes de 40 microlitros de perlas trampa de GFP con sedimento tampón de lisis fresco. Las perlas a 2.700 veces G durante dos minutos entre lavados. Después de la lisis, clarificar los lisados por centrifugación a 21.000 veces G durante 10 minutos.

Transfiera el lisado clarificado de cada una de las proteínas de la competencia a perlas de trampa de GFP lavadas separadas. Permita que las proteínas de fusión GFP se unan durante dos horas, mezclándose por inversión a cuatro grados centígrados. Lave las perlas de trampa GFP cargadas dos veces en tampón de lisis y dos veces en competición.

Aglutinar las perlas de sedimentación tampón a 2.700 veces G durante dos minutos entre lavados. Eluir las proteínas de fusión GFP añadiendo 40 microlitros de glicina 0,2 molar y pipeteando hacia arriba y hacia abajo durante 30 segundos, sedimentar inmediatamente las perlas a 21.000 veces G durante 60 segundos y transferir el líquido a un nuevo tubo de fuga que contiene cuatro microlitros de un molar tris HCL, realice este paso rápidamente para limitar el daño a la proteína purificada. Analice un microlitro de cada proteína purificada por Western blot y pruebe con un anticuerpo anti GFP para establecer el rendimiento relativo utilizando un sistema de transferencia cuantitativa de acuerdo con el protocolo del fabricante.

Igualar la concentración de proteínas molares mediante la adición de tampón de unión a la competencia. Tome 90 microlitros de GST preparado, rejilla una perla y lávela tres veces con tampón de carga de nucleótidos usando un clasificador de partículas magnéticas para precipitar las perlas en cada paso. Aspire el tampón de las perlas y agregue 100 microlitros de tampón de carga de nucleótidos según si se requiere G-D-P-G-T-P o si no se requiere carga de nucleótidos.

Para el experimento de competencia, agregue 12 microlitros de 100 milimolares GD, 12 microlitros de 10 milimolares GTP gamma S o sin nucleótido a 60 microlitros de GST rack one beads para los controles de carga de nucleótidos. Divida las cuentas restantes en tres cuartos de 10 microlitros y agregue dos microlitros de 100 milimolares GDP, dos microlitros de 10 milimolares GTP gamma S o ningún nucleótido a cada tubo. Incubar las mezclas de perlas durante 30 minutos a 30 grados centígrados con agitación.

Estabilice el estante unido a nucleótidos, uno mediante la adición de un molar de cloruro de magnesio a la mezcla experimental y las mezclas de control para realizar la unión de la competencia. Instala seis tubos de micro fuga. Cada uno contiene 200 microlitros de tampón aglutinante de competición.

Cada tubo también debe contener 10 microlitros de la gradilla cargada de nucleótidos, una perla y cinco microlitros de la rejilla. Una proteína de unión A como proteína de unión constante a cada tubo, agregue 0, 1, 2, 0,55, 10 o 20 microlitros de rack, una proteína de unión B como proteína de unión variable. Estos volúmenes suponen concentraciones de stock aproximadamente iguales de las proteínas de unión constantes y variables y puede ser necesario ajustarlos.

Aumente el volumen total de la mezcla aglutinante a 235 microlitros mediante la adición del tampón aglutinante de competición. A continuación, coloque un tubo de micro fuga que contenga 200 microlitros del tampón de competición. 10 microlitros de rack experimental cargado con nucleótidos, una perla y 10 microlitros de rack una proteína de unión A.Luego configure el G-D-P-G-T-P gamma S y ningún tubo de control de nucleótidos como se describe en el protocolo de texto.

Incubar los tubos durante dos horas, mezclando por inversión a cuatro grados centígrados después de la incubación. Lave las cuentas tres veces con el tampón aglutinante de competición. Finalmente, eluir las proteínas unidas en 20 microlitros de tampón reductor de muestra.

La Western blot cuantitativa de la etiqueta GFP de GFP RCC 2 y GFP Corona purificadas en un dominio C.Propeller revela que la proteína en la banda superior, GFP RCC dos es 1,4 veces más abundante que la banda inferior y debe diluirse para lograr una proporción molar de uno a uno para el experimento de competencia. Un experimento de control demuestra que el estado de carga de nucleótidos del rack uno dicta la especificidad de unión, titulando volúmenes crecientes de GFP RCC dos contra un volumen fijo de GFP Corona equimolar en un dominio de hélice C y transferencia. Las proteínas que se unen a la estante uno permiten visualizar un cambio relativo en la proteína unida trazando las intensidades de la banda GFP para ambos competidores en el mismo gráfico, e identificando el punto en el que se cruzan las líneas, permite identificar el volumen de la proteína de unión variable en equilibrio.

Sin embargo, se debe tener cuidado para garantizar que cuestiones como la interacción entre competidores o el exceso de cebo gtpa no comprometan el experimento. El aumento de un competidor sin pérdida del otro, como se muestra aquí, indica un problema al intentar este procedimiento. Es importante recordar que existe una relación recíproca entre la abundancia de los socios vinculantes que compiten entre sí.

Hay una serie de problemas que pueden distorsionar los resultados y/o se pueden resolver siempre que se identifiquen mediante la inspección de los datos.