Name: Modificado madre embrionarias de ratón basado en células para la cuantificación de la eficiencia de inducción cardiogénico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Aprende a identificar ventanas temporales críticas en la cardiogénesis mediante un ensayo estandarizado con células madre embrionarias de ratón. Este método cuantifica la eficiencia de inducción cardíaca mediante cuerpos embrionarios en placa de 96 pocillos.

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Este trabajo fue apoyado por los Asuntos de los Veteranos y las subvenciones del NIH 5U01HL100398 y 1R01HL104040.

1. Cuerpo embrionarias (EB) con la formación de fondo redondo de 96 pocillos de microtitulación <ol><li> Se cultivan las células ES de ratón en placas de 10 cm de cultivo celular con células ES de ratón medio complementado con LIF. </li><li> Cuando las células ES están listos para su uso (generalmente en la confluencia 50-70%), retire el material ES y aclarar las células una vez con 5 ml de PBS estéril. </li><li> Añadir 2 ml de 0,05% de tripsina / EDTA a cada placa y las placas se incuban a 37 ° C durante 3 a 5 minutos, Quench tripsina EDTA con 3 ml de medios ES. </li><li> La transferencia de células a tubos Falcon de 50 ml y giran a 1000 rpm durante 3 minutos. </li><li> Extraer el sobrenadante, resuspender el sedimento celular y con la cantidad deseada de los medios de comunicación EB. </li><li> Cuente el número de células y diluir las células a 5 x 10 3 células / ml en los medios de comunicación EB. </li><li> Use una pipeta multicanal para añadir 100μl de EB medios que contienen células en cada pocillo de 96 - ronda de placas microtiter. </li><li> Lugar 96 - ronda de placas de microtitulación y en una incubadora. </li></ol> 2. Identificación de ventanas de tiempo crítico de la vía de señalización clave (s) de cardiogénesis <ol><li> Añadir moduladores de determinadas vías de señalización y control del vehículo en cada pocillo de placas de microtitulación de 96 pozos que contienen células madre embrionarias en distintos momentos, como el día 0, día 1, día 2, los días 3 y 4, etc mitad de los pozos en cada uno de 96 y placa (48 pozos) se utilizan para cada punto de la hora de inicio del tratamiento. </li><li> Lavar bien los moduladores cambiando los medios de comunicación EB por cada 48 pozos en diferentes puntos de tiempo de parada. Por ejemplo, para conseguir dos días de tratamiento de células madre embrionarias a partir de el día 0, lavar la moduladores en el día 2. Para que cualquier tratamiento por más de 48 horas, cambio de los medios de comunicación EB complementado con moduladores fresca cada dos días hasta que la hora que desee detener. </li><li> Examine la contracción EB bajo el microscopio después del día 7. Puntuación de los pozos con la contratación EBS como los positivos para obtener los porcentajes de contratación EBS para cada uno: tiempo de tratamiento diferentes. </li><li> Los momentos críticos para cardiogénesis ES son los plazos en los que figura el porcentaje más alto de contraer EBs tratados con moduladores de la señalización en comparación con el control del vehículo. </li></ol> 3. Verificación de las ventanas de tiempo de señalización para cardiogénesis en EBs hecho de gotas colgantes <ol><li> Preparar platos Petri añadiendo con 3-4 ml de PBS para evitar la evaporación. </li><li> Siga los pasos del 1.1 ~ 1.5 para preparar células madre embrionarias en 2.5x10 4 células / ml de densidad celular final. </li><li> Vierta la mezcla de células bacterianas en el plato de fácil acceso. Utilizando una pipeta multicanal, 20 gotas l (que contiene alrededor de 500 células) en las tapas invertidas. No permita que las gotas individuales al tacto. Por lo general una tapa puede albergar hasta 80 gotas. Voltear la tapa de nuevo sobre el plato que contiene PBS. Incubar durante 24 horas o 48 horas para permitir la formación de EB en una incubadora. </li><li> Lave EB formado a partir de colgar las gotitas de cada tapa con 3 ml de los medios de comunicación EB y piscina 2 tapas de EBS para una nueva placa de Petri. Añadir los medios de comunicación EB a un volumen total de 10ml. </li><li> Transferencia de EBS en suspensión en el 0,2% de gelatina recubiertas placas de 6 pocillos en el día 4. En general 30 EBs se transfieren a cada pocillo. Añadir los medios de comunicación EB para obtener el volumen final de 2 ml para cada pozo. </li><li> Incubar moduladores de señalización en el período de tiempo identificados a partir de 96 experimentos y placa. </li><li> Observar la contracción EB bajo el microscopio después del día 7 y cardiogénesis puede ser caracterizado además por RT-PCR, tinción y otros, si es necesario. </li></ol>

<ol><li>Fukuda, K., Yuasa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+as+a+source+of+regenerative+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+research%22%5BJournal%5D)">Stem cells as a source of regenerative cardiomyocytes.</a> Circulation research. 98, 1002-1013 (2006).</li>
<li>Foley, A. C., Mercola, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+induction+by+Wnt+antagonists+depends+on+the+homeodomain+transcription+factor+Hex%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Heart induction by Wnt antagonists depends on the homeodomain transcription factor Hex.</a> Genes Dev. 19, 387-396 (2005).</li>
<li>Naito, A. T., Shiojima, I., Akazawa, H., Hidaka, K., Morisaki, T., Kikuchi, A., Komuro, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+stage-specific+biphasic+roles+of+Wnt%2Fbeta-catenin+signaling+in+cardiomyogenesis+and+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Developmental stage-specific biphasic roles of Wnt/beta-catenin signaling in cardiomyogenesis and hematopoiesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 19812-19817 (2006).</li>
<li>Hao, J., Daleo, M. A., Murphy, C. K., Yu, P. B., Ho, J. N., Hu, J., Peterson, R. T., Hatzopoulos, A. K., Hong, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsomorphin%2C+a+selective+small+molecule+inhibitor+of+BMP+signaling%2C+promotes+cardiomyogenesis+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Dorsomorphin, a selective small molecule inhibitor of BMP signaling, promotes cardiomyogenesis in embryonic stem cells.</a> PloS one. 3, e2904-e2904 (2008).</li>
</ol>

El método de la gota colgante ha sido el método convencional utilizado para la formación de EB y en la diferenciación in vitro. Sin embargo, es laborioso y limita la flexibilidad de experimentación debido a problemas de logística. De la misma manera, los resultados también son más difíciles de validar como la habilidad del experimentador es crucial para la formación de EB éxito y la manipulación en forma de gotas colgantes. Un método más simple consiste en formar EBS en un plato de fondo redondo de 96, así como un proceso de un solo paso. Este formato permite la diferenciación in vitro para ser estandarizados y pueden alojar a más condiciones experimentales debido a la facilidad de la formación de EB y la manipulación posterior (por ejemplo, además del modulador o la eliminación). Además, el formato de 96 pocillos placa puede ser optimizado para ser una herramienta de evaluación eficiente en las células madre embrionarias de ratón.

<ul><li> CGR8 ratón las células se utilizan principalmente. </li><li> Medio ES: los medios de comunicación GMEM complementado con inactivado por calor, 10% de SFB, 2 mM L-glutamina, 0,05 mM 2-mercaptoetanol, y 200 U / ml murino LIF. </li><li> Medio EB: Preparar los medios de comunicación IMDM con inactivado por calor, 20% de SFB, 1,6 mM L-glutamina, 0,08 mM 2-mercaptoetanol, y 1X MEM no esenciales solución de aminoácidos. </li></ul>

modificado madre embrionarias de ratón basado en células para la cuantificación de la eficiencia de inducción cardiogénico

Modified Mouse Embryonic Stem Cell based Assay for Quantifying  Cardiogenic Induction Efficiency

Diferenciación de las células madre pluripotentes está estrechamente controlada por la regulación temporal y espacial de múltiples vías de señalización claves. Uno de los obstáculos a su entender ha sido los métodos variados en la correlación de los cambios de los principales eventos de señalización a la eficiencia de la diferenciación. Se describe aquí el uso de un ensayo con ratones con células madre embrionarias (ES) en base a identificar las ventanas de tiempo crítico para la Wnt / β-catenina y la activación de la señal de BMP durante la inducción cardiogénico. Anotando para la contratación de los órganos del embrión (EBS) en un formato de placa de 96 pocillos, que rápidamente se puede cuantificar la eficiencia cardiogénico e identificar las ventanas cruciales tiempo para Wnt / β-catenina y la activación de la señal de BMP en un curso de tiempo después de los tratamientos específicos modulador. El director describe aquí no se limita a la inducción cardiaca solo, y se puede aplicar al estudio de muchos linajes de células. Además, el formato de 96 y tiene el potencial para seguir desarrollándose como un alto rendimiento, análisis automatizado para permitir la comprobación de hipótesis experimentales más sofisticados.

Se describe el uso de un ensayo basado en células ES de ratón para identificar ventanas de tiempo crítico para la Wnt / β-catenina y la activación de la señal de BMP durante la inducción cardiogénico. El método ofrece una plataforma estandarizada que cuantifica la eficiencia de forma fiable cardiogénico, y es aplicable al estudio de los linajes de células.

Modificado madre embrionarias de ratón basado en células para la cuantificación de la eficiencia de inducción cardiogénico

La diferenciación de las células madre pluripotentes está estrictamente controlada por la regulación temporal y espacial de múltiples vías de señalización clave. Uno de los obstáculos...

El objetivo general del siguiente experimento es identificar la regulación temporal crucial necesaria para la diferenciación de cardiomiocitos en células madre embrionarias de ratón. Esto se logra primero formando cuerpos embrionarios en una placa de fondo redondo de 96 pocillos para estandarizar la formación de EB como un segundo paso. Se añaden moduladores proteicos o químicos a los EB durante un curso temporal predeterminado, lo que permitirá el control temporal de las vías bajo estudio.A continuación, los EBS latientes se cuantifican manualmente para determinar la eficiencia de inducción de diversos esquemas de modulación de señales. Se obtienen resultados que muestran los requisitos temporales de las vías de señalización esenciales para la diferenciación de cardiomiocitos, basados en el porcentaje de EBS latientes formados y la confirmación mediante el método de gota colgante. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como las gotas colgantes es que estandariza y simplifica un procedimiento intensivo en mano de obra y permite una lectura directa para la cuantificación.Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología de células madre, como la identificación de la coagulación de señales esenciales que dirige la diferenciación hacia el tipo celular deseado. Para comenzar este procedimiento, cultive células madre embrionarias de ratón en placas de cultivo celular de 10 centímetros con medio para células madre de ratón suplementado con factor inhibidor de la leucemia. Cuando las células madre estén entre un 50 y un 70 % de confluencia, estarán listas para su uso.Retire el medio ES y lave las células una vez con cinco mililitros de PBS estéril. Añada dos mililitros de tripsina-EDTA al 0,05% a cada placa e incube las placas a 37 grados Celsius durante tres a cinco minutos. A continuación, detenga la acción de la tripsina con EDTA añadiendo tres mililitros de medio ES por placa y transfiera las células a un tubo cónico de 50 mililitros.Centrifugar a 1000 rotaciones por minuto durante tres minutos. Después de la centrifugación, eliminar el sobrenadante y resuspender el botón celular con la cantidad deseada de medio EB. Contar el número de células y luego diluir las células hasta cinco veces 10 a la tres células por mililitro.En medio EB, utilizando una pipeta multicanal, agregue 100 microlitros de medio EB que contenga células en cada pocillo de una placa de microtitulación de 96 pocillos con fondo redondo. La cantidad de placas de 96 pocillos necesarias dependerá del número de condiciones y puntos temporales del experimento. Coloque las placas de microtitulación de 96 pocillos con fondo redondo en un incubador humidificado a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono para identificar ventanas temporales críticas de las vías de señalización clave para la cardiogénesis.Se añaden moduladores de vías de señalización específicas a las células ES. En las placas de 96 pocillos con fondo redondo, agregue el modulador de señalización, que se diluye en medio, a cada pocillo en diferentes puntos temporales. La mitad de los pocillos en cada placa de 96 pocillos se utiliza para cada punto temporal inicial del tratamiento.Se añade un control de vehículo a las otras 48 pocillos para cada punto temporal. En diferentes momentos de parada, vamos a eliminar los moduladores de señalización de cada pocillo cambiando el medio, y se debe tener mucho cuidado al hacerlo para evitar alterar los cuerpos embrionarios en diferentes puntos temporales de parada. Elimine los moduladores cambiando el medio de los cuerpos embrionarios (EB) en los pocillos. Incline la placa de 96 pocillos aproximadamente 10 grados y retire suavemente el medio del pocillo utilizando una pipeta multicanal.Luego, agregue nuevamente medio EB sin modulador a cada pocillo para cualquier tratamiento que dure más de 48 horas. Cambie el medio EB suplementado con moduladores frescos cada dos días hasta el tiempo deseado de finalización. Siete días después de que los EB fueron inducidos mediante la transferencia de células ES a placas de 96 pocillos, examine la contracción de los EB bajo un microscopio.Puntúe los pocillos con EBS que presentan contracciones como positivos para obtener los porcentajes de EBS contráctiles para cada curso temporal de tratamiento diferente. Las ventanas temporales de señalización para la cardiogénesis identificadas mediante los experimentos en placas de 96 pocillos pueden verificarse en EBS elaborados a partir de gotas colgantes, para formar gotas colgantes de EBS. Primero prepare placas de Petri añadiendo tres a cuatro mililitros de PBS para prevenir aberraciones en las gotas posteriormente.A continuación, se vierte una suspensión de células ES preparada con una densidad final de 2,5 × 10⁴ células por mililitro en una placa bacteriológica para facilitar el acceso. Mediante un pipeta multicanal, agregue gotas de 20 µL de células ES sobre las tapas invertidas de las placas de Petri. No permita que las gotas individuales entren en contacto entre sí.Por lo general, una tapa puede contener hasta 80 gotas. Luego, invierta la tapa sobre la placa de Petri que contiene PBS e incube durante 48 horas en un incubador con 5% de dióxido de carbono a 37 grados Celsius para permitir la formación de cuerpos embrioides (EB). Después de 48 horas, lave los EB formados a partir de las gotas colgantes de cada tapa con tres mililitros de medio para EB.Coloque dos tapas de EBS en una nueva placa de Petri. Incube la placa de Petri durante cuatro días en un incubador con 5% de dióxido de carbono a 37 grados Celsius. En el día cuatro, transfiera los EBS en suspensión a placas de seis pocillos recubiertas con gelatina al 0,2% en general. Se transfieren 30 EBS a cada pocillo e incube con moduladores de señalización en el período de tiempo determinado a partir de los experimentos en placas de 96 pocillos, siete días después de haberse formado las gotas colgantes.Observe los EBS bajo el microscopio para detectar la contracción de los EB. Las células ES cultivadas en pozos redondos de una placa de 96 pozos formarán EBS, como se muestra en esta imagen representativa de un EB formado al día cuatro. Los puntos temporales críticos para la cardiogénesis de las ES son las ventanas temporales que contienen el mayor porcentaje de EBS contráctiles tratados con moduladores de señales en comparación con el control de vehículo. Aquí se muestra un foco de contracción espontánea de cardiomiocitos formado a partir de células ES tratadas con morfina dorsal al día 10 de diferenciación en una placa de microtitulación de 96 pozos.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo identificar de manera eficiente la regulación temporal crítica y las ventanas temporales de las vías de señalización clave en la cardiogénesis de las células madre embrionarias.

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Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Hemos establecido un protocolo para la inducción de cardioblastos directa de pluripotentes células madre embrionarias humanas mantenidas en condiciones definidas con pequeñas moléculas, lo que permite la derivación de una gran cantidad de células progenitoras cardiacas humanas y funcionales cardiovasculares cardiomiocitos para su reparación.

Derivación eficiente de los Derechos Humanos precursores cardiacos y cardiomiocitos de pluripotentes células madre embrionarias humanas mediante la inducción de moléculas pequeñas

Este manuscrito describe un protocolo paso a paso para la generación y cuantificación de diversos subtipos cardíacos reprogramados utilizando una administración mediada por retrovirus de Gata4, Hand2, Mef2c y Tbx5.

La evaluación de cardiomiocitos subtipos A raíz de reprogramación mediada por el factor de transcripción de fibroblastos embrionarios de ratón

Aquí, presentamos un método para aprovechar eficientemente el potencial de diferenciación cardiaca de jóvenes fuentes de células madre mesenquimales humanas con el fin de generar las células funcionales, contratantes, cardiomiocitos-como en vitro.

In Vitro Diferenciación de células madre mesenquimales humanas en células funcionales en cardiomiocitos

Aquí presentamos un método robusto para reprogramar fibroblastos embrionarios primarios en cardiomiocitos funcionales a través de la sobreexpresión de GATA4, Hand2, Mef2c, Tbx5, miR-1 y miR-133 (GHMT2m) junto con la inhibición de la señalización de TGF-β. Nuestro protocolo genera cardiomiocitos paliza tan pronto como transducción después de 7 días con hasta un 60% eficiencia.

Supresión de la señalización Pro-fibróticos potencia Factor-mediada la reprogramación de fibroblastos embrionarios de ratón en cardiomiocitos inducida

Aquí presentamos un protocolo para la formación de una población celular mediante estímulos eléctricos y mecánicos, emulando la fisiología cardiaca. Esta estimulación electromecánica realza el potencial cardiomiogenético de las células tratadas y es una estrategia prometedora para la terapia celular más, modelado de la enfermedad y drogas.

Simultánea estimulación eléctrica y mecánica para mejorar el potencial de las células cardiomiogenético

En este protocolo, demostramos y profundizamos en cómo utilizar células madre pluripotentes inducidas por el hombre para la diferenciación y purificación de cardiomiocitos, y más adelante, sobre cómo mejorar su eficiencia de trasplante con inhibidor de la proteína quinasa asociada a Rho pretratamiento en un modelo de infarto de miocardio de ratón.

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Describimos aquí, el establecimiento y la aplicación de una línea de reportero de ratón Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (denominada αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 a continuación) para la evaluación de reprogramación cardíaca. Los fibroblastos cardíacos neonatales (NCF) aislados de la cepa del ratón se convierten en cardiomiocitos inducidos (iCM), lo que permite una evaluación conveniente y eficiente de la eficiencia de reprogramación y la maduración funcional de...

Evaluación in vitro de la reprogramación cardíaca mediante la medición del flujo de calcio específico cardíaco con un informador GCaMP3

La administración de células guiadas por ultrasonido alrededor del sitio del infarto de miocardio en ratones es una forma segura, efectiva y conveniente de trasplante de células.

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La combinación de poración láser y matrices de microelectrodos (MEA) permite registros similares al potencial de acción de cardiomiocitos primarios y derivados de células madre cultivados. La forma de onda proporciona una visión superior del modo de acción de los compuestos de prueba que las grabaciones estándar. Vincula patch-clamp y lectura MEA para optimizar aún más la investigación de seguridad cardiovascular en el futuro.

Mediciones similares a un potencial de acción inducida por láser de cardiomiocitos en matrices de microelectrodos para una mayor predictividad de la farmacología de seguridad

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Un enfoque eficiente de transgénesis para la entrega de genes en el corazón embrionario de ratón

Este protocolo mide cuantitativamente la estabilidad y la vida media de ARN potenciadores intergénicos e intragénicos en células madre embrionarias de ratón mediante tratamiento con Actinomicina D, RT-qPCR y análisis de regresión no lineal. Se incorporan estrategias de normalización específicas por posición para modelar con precisión la dinámica de desintegración del ARNe de manera dependiente del contexto.

Evaluación cuantitativa optimizada de la estabilidad del ARN potenciador en células madre embrionarias de ratón

Aprende a identificar ventanas temporales críticas en la cardiogénesis mediante un ensayo estandarizado con células madre embrionarias de ratón. Este método cuantifica la eficiencia de inducción cardíaca mediante cuerpos embrionarios en placa de 96 pocillos.

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