Modificado madre embrionarias de ratón basado en células para la cuantificación de la eficiencia de inducción cardiogénico

El objetivo general del siguiente experimento es identificar la regulación temporal crucial necesaria para la diferenciación de cardiomiocitos en células madre embrionarias de ratón. Esto se logra primero formando cuerpos embrionarios en una placa de fondo redondo de 96 pocillos para estandarizar la formación de EBs como un segundo paso. Se añaden moduladores proteicos o químicos a los EBs durante un curso temporal predeterminado, lo que permitirá el control temporal de las vías bajo estudio.

A continuación, los EBS latientes se cuantifican manualmente para determinar la eficiencia de inducción de diversos esquemas de modulación de señales. Se obtienen resultados que muestran los requisitos temporales de las vías de señalización esenciales para la diferenciación de cardiomiocitos, basados en el porcentaje de EBS latientes formados y la confirmación mediante el método de gota colgante. La ventaja principal de esta técnica frente a métodos existentes como las gotas colgantes es que estandariza y simplifica un procedimiento intensivo en mano de obra y permite una lectura directa para la cuantificación.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología de células madre, como la identificación de la coagulación esencial de señales que dirige la diferenciación hacia el tipo celular deseado. Para comenzar este procedimiento, cultive células madre embrionarias de ratón en placas de cultivo celular de 10 centímetros con medio para células madre de ratón suplementado con factor inhibidor de la leucemia. Cuando las células madre estén en un 50 a 70 % de confluencia, estarán listas para su uso.

Retire el medio ES y lave las células una vez con cinco mililitros de PBS estéril. Añada dos mililitros de tripsina-EDTA al 0,05% a cada placa e incube las placas a 37 grados Celsius durante tres a cinco minutos. A continuación, detenga la acción de la tripsina con EDTA añadiendo tres mililitros de medio ES por placa y transfiera las células a un tubo cónico de 50 mililitros.

Centrifugar a 1000 rotaciones por minuto durante tres minutos. Después de la centrifugación, eliminar el sobrenadante y resuspender el botón celular con la cantidad deseada de medio EB. Contar el número de células y luego diluir las células hasta cinco veces 10 a la tres células por mililitro.

En medio EB, utilizando una pipeta multicanal, agregue 100 microlitros de medio EB que contenga células en cada pocillo de una placa de microtitulación de 96 pocillos con fondo redondo. La cantidad de placas de 96 pocillos necesarias dependerá del número de condiciones y puntos temporales del experimento. Coloque las placas de microtitulación de 96 pocillos con fondo redondo en un incubador humedecido a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono para identificar ventanas temporales críticas de las vías de señalización clave para la cardiogénesis.

Se añaden moduladores de vías de señalización específicas a las células ES. En las placas de 96 pocillos con fondo redondo, agregue el modulador de señalización, que se diluye en medio, en cada pocillo en distintos puntos temporales. La mitad de los pocillos en cada placa de 96 pocillos se utiliza para cada punto temporal inicial del tratamiento.

Se añade un control de vehículo a las otras 48 pocillos para cada punto temporal. En diferentes momentos de parada, vamos a eliminar los moduladores de señalización de cada pocillo cambiando el medio, y se debe tener mucho cuidado al hacerlo para evitar alterar los cuerpos embrionarios en diferentes puntos temporales de parada. Elimine los moduladores cambiando el medio de los cuerpos embrionarios (EB) en los pocillos. Incline la placa de 96 pocillos aproximadamente 10 grados y retire suavemente el medio del pocillo utilizando una pipeta multicanal.

Luego, agregue nuevamente medio EB sin modulador a cada pocillo para cualquier tratamiento que dure más de 48 horas. Cambie el medio EB suplementado con moduladores frescos cada dos días hasta el momento deseado de finalización. Siete días después de que se indujeron los EB mediante la transferencia de células ES a placas de 96 pocillos, examine la contracción de los EB bajo un microscopio.

Califique como positivos los pozos con EBS que presenten contracción para obtener los porcentajes de EBS contráctiles para cada curso temporal de tratamiento diferente. Las ventanas temporales de señalización para la cardiogénesis identificadas mediante los experimentos en placas de 96 pozos pueden verificarse en EBS elaborados a partir de gotas colgantes, creando así gotas de EBS suspendidas. Primero prepare las placas de Petri añadiendo tres a cuatro mililitros de PBS para prevenir posteriormente la aberración de las gotas.

A continuación, se vierte una suspensión de células ES preparada con una densidad final de 2,5 × 10⁴ células por mililitro en una placa bacteriológica para facilitar el acceso. Mediante un pipeta multicanal, agregue gotas de 20 µL de células ES sobre las tapas invertidas de las placas de Petri. No permita que las gotas individuales se toquen entre sí.

Por lo general, una tapa puede contener hasta 80 gotas. Luego, invierta la tapa sobre la placa de Petri que contiene PBS e incube durante 48 horas en un incubador con 5% de dióxido de carbono a 37 grados Celsius para permitir la formación de EB. Después de 48 horas, lave los EB formados a partir de las gotas colgantes de cada tapa con tres mililitros de medio EB.

Coloque dos tapas de EBS en una nueva placa de Petri. Incube la placa de Petri durante cuatro días en un incubador con 5% de dióxido de carbono a 37 grados Celsius. En el día cuatro, transfiera los EBS en suspensión a placas de seis pocillos recubiertas con gelatina al 0,2%, en general. Se transfieren 30 EBS a cada pocillo e incube con moduladores de señalización durante el período de tiempo determinado a partir de los experimentos en placas de 96 pocillos, siete días después de haberse formado las gotas colgantes.

Observe el EBS bajo el microscopio para detectar la contracción de los EB. Las células ES cultivadas en pozos redondos de una placa de 96 pozos formarán EBS, como se muestra en esta imagen representativa de un EB formado al día cuatro. Los puntos temporales críticos para la cardiogénesis de las ES son las ventanas temporales que contienen el mayor porcentaje de EBS contráctiles tratados con moduladores de señales en comparación con el control de vehículo. Aquí se muestra un foco de contracción espontánea de cardiomiocitos formado a partir de células ES tratadas con morfina dorsal al día 10 de diferenciación en una placa de microtitulación de 96 pozos.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo identificar de manera eficiente la regulación temporal crítica y las ventanas temporales de las vías de señalización clave en la cardiogénesis de las células madre embrionarias.