Modificado madre embrionarias de ratón basado en células para la cuantificación de la eficiencia de inducción cardiogénico

El objetivo general del siguiente experimento es identificar la regulación temporal crucial requerida para la diferenciación de cardiomiocitos en células madre embrionarias de ratón. Esto se logra formando primero cuerpos embrionarios en una placa inferior redonda de 96 pocillos para estandarizar la formación de EB como segundo paso. Los moduladores de proteínas o químicos se añaden a EBS durante un curso de tiempo predeterminado, lo que permitirá el control temporal de las vías bajo examen.

A continuación, se cuantifican manualmente los EBS de batido para determinar la eficiencia de inducción de varios esquemas de modulación de señal. Se obtienen resultados que muestran los requerimientos temporales de las vías de señalización esenciales para la diferenciación de cardiomiocitos en función del porcentaje de EBS latente formado y la confirmación mediante el método de gota colgante. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como las gotas colgantes, es que estandariza y simplifica un procedimiento intensivo en mano de obra y permite una lectura sencilla para la cuantificación.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología de las células madre, como la identificación de la coagulación de señalización esencial que dirige la diferenciación hacia el tipo de célula deseado para comenzar este procedimiento. Células madre embrionarias de ratón Gro en placas de cultivo celular de 10 centímetros con medio de células madre embrionarias de ratón suplementado con factor inhibidor de la leucemia. Cuando las células madre embrionarias están entre el 50 y el 70 % de confluencia, están listas para su uso.

Retire el medio ES y enjuague las células una vez con cinco mililitros de PBS estéril. Agregue dos mililitros de 0.05% de EDTA a cada placa e incube las placas a 37 grados Celsius durante tres a cinco minutos. A continuación, enfríe los viajes en EDTA con tres mililitros de medio ES por placa y transfiera las celdas a un tubo de centrífuga de 50 mililitros.

Gira a 1000 rotaciones por minuto durante tres minutos. Después de la centrifugación, retire el supinato y vuelva a suspender el pellet de celda con la cantidad deseada de medio EB. Cuente el número de celdas y luego diluya las celdas a cinco veces 10 por tres celdas por mililitro.

En medios EB utilizando una pipeta multicanal, agregue 100 microlitros de medios EB que contengan celdas en cada pocillo de una placa de microtitulación de pocillos de fondo redondo de 96. El número de placas de 96 pocillos necesarias dependerá del número de condiciones y puntos de tiempo del experimento. Coloque las 96 placas de microtitulación de pozo de fondo redondo en una incubadora humidificada de dióxido de carbono al 5% a 37 grados Celsius para identificar ventanas de tiempo críticas de vías de señalización clave para la cardiogénesis.

Se añaden moduladores de vías de señalización específicas a las células madre embrionarias. En las 96 placas de pocillos de fondo redondo se agrega el modulador de señalización, que se diluye en medios en cada pocillo en varios puntos de tiempo. La mitad de los pocillos de cada placa de 96 pocillos se utilizan para cada punto de tiempo de inicio del tratamiento.

A los otros 48 pozos se les añade un control de vehículo para cada punto de tiempo En diferentes puntos de parada, vamos a lavar los moduladores de señalización de cada pozo cambiando los medios y se debe tener mucho cuidado al hacer esto para evitar la interrupción de los cuerpos embrionarios en diferentes puntos de tiempo de parada. Lave los moduladores cambiando los medios EB de los pozos. Incline la placa de 96 pocillos en un ángulo de aproximadamente 10 grados y retire suavemente el medio del pocillo con una pipeta multicanal.

A continuación, vuelva a añadir medios EB sin modulador a cada pocillo para cualquier tratamiento de más de 48 horas. Cambie los medios EB suplementados con moduladores nuevos cada dos días hasta la hora de parada deseada. Los puntos siete días después de que se indujera la EBS mediante la transferencia de células madre embrionarias a placas de 96 pocillos, examinaron la contracción de la EB bajo un microscopio.

Puntúe los pozos con EBS contratados como positivos para obtener porcentajes de EBS contratados para cada curso de tiempo de tratamiento diferente. Las ventanas de tiempo de señalización para la génesis cardiovascular identificadas por los experimentos de placa de 96 pocillos se pueden verificar en EBS hecho de gotas colgantes para hacer gotas de EB colgantes. Primero prepare placas de Petri agregando de tres a cuatro mililitros de PBS para prevenir la aberración de las gotitas más tarde.

A continuación, se vierte en una placa bacteriana una suspensión de células madre embrionarias preparada a una densidad final de 2,5 veces 10 a las cuatro células por mililitro para facilitar el acceso. Con una pipeta multicanal, agregue 20 gotas de microlitros de células madre embrionarias en las tapas invertidas de las placas de Petri. No permita que las gotas individuales se toquen entre sí.

Por lo general, en una tapa caben hasta 80 gotas. A continuación, vuelva a voltear la tapa sobre la placa de Petri que contiene PBS e incube durante 48 horas en una incubadora de dióxido de carbono al 5% a 37 grados centígrados para permitir la formación de EB. Después de 48 horas, lave el EBS formado por las gotas que cuelgan de cada tapa con tres mililitros de medio EB.

Coloque dos tapas de EBS en una nueva placa de Petri. Incubar la placa de Petri durante cuatro días en una incubadora de dióxido de carbono al 5% a 37 grados centígrados al cuarto día, transfiera el EBS en suspensión a placas de seis pocillos recubiertas de gelatina al 0,2% en general. Se transfieren 30 EBS a los moduladores de señalización de incubación de cada pocillo en el período de tiempo identificado a partir de los experimentos con placa de 96 pocillos, siete días después de que se hicieron las gotas colgantes.

Observe el EBS bajo el microscopio para detectar la contracción de EB: Las células madre embrionarias cultivadas en los pocillos de fondo redondo de una placa de 96 pocillos formarán EBS, como se muestra en esta imagen representativa de un EB formado en el cuarto día. Los puntos de tiempo críticos para la génesis de ES cardio son las ventanas de tiempo que contienen el mayor porcentaje de EBS en contracción tratado por moduladores de señalización en comparación con el control del vehículo. Aquí se muestra un foco de contracción espontánea de cardiomiocitos formado a partir de células madre embrionarias tratadas con morfina dorsal en el día 10 de diferenciación en una placa de microtitulación de 96 pocillos.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo identificar de manera eficiente la regulación temporal crítica, las ventanas de las vías de señalización clave en la cardiogénesis de la ES.