PGS elastomérico andamios en ingeniería de tejidos arteriales

Este video muestra cómo fabricar andamios tubulares porosos y someterlos a acondicionamiento mecánico dinámico para la ingeniería de tejidos arteriales. Esto se logra fabricando primero los andamios utilizando un elastómero biodegradable y un método de fusión de asalto. A continuación, los andamios se preparan para la siembra de células y se ensamblan en un sistema de biorreactor.

En el biorreactor, las células de músculo liso vascular siembran los andamios y se cultivan. Semanas más tarde, se extrae tejido y se analiza mediante microscopía electrónica de barrido, tinción h y e y autofluorescencia de elastina. El músculo liso resultante es a la vez multicapa y orientado perpendicularmente.

La principal ventaja de esta técnica existente al igual que el blanqueo de partículas, es utilizar el molde de vidrio para fabricarlo: andamio tubular poroso y ácido hialurónico. A medida que un molde se elimina, el molde del andamio se prepara a partir de un trozo de tubo de vidrio. Coloque el tubo en un soporte y vierta la solución de ácido hialurónico preparada el día anterior en el tubo.

El ácido hialurónico fluye lentamente hacia abajo a lo largo de la pared interna. Cuando llegue al fondo del molde, dale la vuelta. Repita este paso hasta que la pared interna del molde esté cubierta uniformemente por la solución.

Después de recubrir, seque todos los moldes de vidrio preparados en un horno al vacío a 37 grados centígrados durante 24 horas. Por lo general, se preparan cuatro moldes al mismo tiempo que los moldes de vidrio se secan. Prepare los vertidos de partículas de sal, muela y SVE partículas de sal a 25 a 32 micrómetros.

Al día siguiente, ensamble el mandril del molde de vidrio preparado, el tubo de PTFE, el manguito termorretráctil y el anillo de PTFE. Primero, cargue el mandril en tubos de PTFE de 65 milímetros y hornéelos a 120 grados centígrados durante cinco minutos. Para reducir el PTFE mientras se esperaba antes de la guerra una incubadora de hibridación a 37 grados centígrados durante al menos 30 minutos.

Una vez que el tubo haya encajado los mandriles, empuje el manguito termorretráctil sobre el mandril para que se mueva libremente. Luego coloque el mandril dentro del molde de vidrio y fije el anillo A-P-T-F-E en la parte inferior del mandril. Compruebe que el anillo de PTFE esté perfectamente ajustado a la parte inferior del molde de vidrio.

A continuación, con una espátula y un embudo de goma de silicona, agregue gachas de partículas de sal al molde de vidrio. A continuación, golpee suavemente el molde con la espátula para que las partículas se distribuyan uniformemente y raspe el exceso de sal. Ahora apague la incubadora calentada y cárguela rápidamente con los moldes llenos de sal, la sal se fusionará durante los próximos 30 minutos, después de lo cual secará los moldes en un horno al vacío a 37 grados centígrados durante 24 horas.

Al día siguiente de enfriar, retire el mandril de acero inoxidable de los moldes empujándolo hacia afuera mientras asegura el anillo de PTFE. Si es necesario, use alicates de punta fina. A continuación, retire el anillo de PTFE del fondo del molde.

A continuación, hornee los moldes para encoger la funda y retire las mangas encogidas de los moldes. Deje que los moldes se enfríen hasta que se usen y guárdelos en un desecado en una campana. Usando un gotero de apo, inclinó los moldes de vidrio a 45 grados y dejó caer la solución de PGS en su lumen interno mientras giraba lentamente el molde.

Compruebe si la solución de PGS fluye hacia abajo a lo largo de la pared del molde. Si hay un punto seco, agregue más PGS Ahora deje que el THF se evapore en la campana durante al menos 30 minutos. Una vez que se haya ido el THD, cure los moldes en un horno al vacío.

Después de curar durante un día, enfríe los moldes a temperatura ambiente y sumérjalos lenta y verticalmente en agua desionizada a 24 grados centígrados. Inclinarlos demasiado rápido crea burbujas de aire, que desgarran el andamio. Transfiera con cuidado los moldes al baño de agua.

Colócalos en ángulo con un tubo de silicona y deja que el ácido hialurónico se disuelva durante una hora. Si después de una hora el ácido hialurónico no se ha liberado del molde, con el molde aún sumergido, use una espátula para empujar lentamente el ácido hialurónico por ambos extremos y luego agite lentamente el molde. Ahora, verifique que los andamios no se hayan movido dentro del molde de vidrio y, si es así, tire del andamio lentamente con pinzas para liberarlo del molde.

A continuación, lixiviar las partículas de sal transfiriendo cuidadosamente los delicados andamios a un baño de agua desionizada con una agitación suave. Esto tomará al menos tres días y requiere que el agua se cambie diariamente Después de que se haya lixiviado toda la sal, transfiera cada andamio a un tubo de centrífuga de 15 mililitros lleno de agua desionizada y congélelos en una caja de hielo seco durante una hora. Coloque los tubos de centrífuga congelados en un liofilizador durante tres días con las tapas abiertas.

Una vez liofilizados, guarde los andamios en un desecado hasta que se utilicen. Comience cortando los andamios en longitudes de 25 a 30 milímetros. A continuación, prepare dos tapones de caucho de silicona introduciendo un tubo de PTFE a través de los orificios centrales de cada tapón.

A continuación, corte trozos de un milímetro y medio de anillo y deslice un trozo en un extremo del andamio. Empuje un tubo de PTFE conectado al tapón en el mismo extremo del andamio con la superposición suficiente para estar debajo del anillo HS para conectar firmemente el andamio al tubo, contraiga el anillo HS en un horno y permita que el conjunto se enfríe a temperatura ambiente. Ahora, un tubo de policarbonato de 50 milímetros, que funciona como la cámara del biorreactor, se desliza sobre el andamio y se asegura en la superficie interna del tapón de caucho de silicona.

Al igual que antes, otro tubo de PTFE y un tapón se aseguran en el otro extremo del andamio con un anillo hs para completar la cámara. El segundo tapón está unido al otro extremo del tubo de policarbonato. A continuación, las superficies exteriores de los tapones se unen a dos placas de aleación de aluminio.

Introduzca dos varillas roscadas en el orificio lateral de cada placa y asegure las placas con tornillos de mariposa. Conecte el andamio al biorreactor. Ahora mida la longitud visible de cada andamio, que es la distancia entre dos anillos hs, y calcule sus áreas de superficie interna.

Para la siembra de células. En un autoclave, esterilice las cámaras, cada una envuelta individualmente en papel de aluminio, junto con cada parte de la unidad del biorreactor. Una vez esterilizado, se ensambló el biorreactor dentro de una campana de cultivo celular.

Pretratar y enjuagar el andamio con una serie de perfusiones mediante el uso de una bomba peristáltica a un milímetro por minuto en el circuito de flujo. Comience enjuagando con 70% de etanol, 50% de etanol y luego 25% de etanol durante una hora cada uno. Siga los tres enjuagues de etanol con un enjuague de PBS de dos horas.

Finalmente, perfunda el biorreactor con medio de cultivo SMC durante 24 horas, después de lo cual está listo para la siembra celular y la experimentación. Ahora, siguiendo las instrucciones del manuscrito adjunto, siembre el biorreactor con 2 millones de células por centímetro cuadrado y, durante los próximos 21 días, cambie el medio de la tubería y realice ajustes en la velocidad de la bomba. Gradualmente, la presión en la construcción aumentará de aproximadamente cuatro milímetros de mercurio en el primer día de cultivo a más de 100 milímetros de mercurio después de dos semanas en cultivo, después de tres semanas en cultivo, recolectará las células y las preparará para el análisis como se especifica en el manuscrito adjunto.

Estos andamios tubulares de PGS se fabricaron mediante el método de fusión de sal. Las micrografías electrónicas de barrido demostraron que todos los andamios tenían espesores de pared homogéneos y no había defectos parciales en sus secciones transversales. Se observaron macro y microporos distribuidos aleatoriamente en la superficie luminal de todos los andamios.

Después del cultivo celular, las SMC multicapa crecieron con una orientación perpendicular a la dirección del flujo. Además, las células y las proteínas DCM cubrieron completamente el lumen de todas las construcciones de PGS. La autofluorescencia de elastina también mostró fibras elásticas organizadas circunferencialmente en la superficie luminal del constructo.

Después de ver este video, debe comprender cómo hacer andamios tubulares porosos, ver las células y cultivar andamios utilizando un biorreactor prediseñado.