Name: PGS elastomérico andamios en ingeniería de tejidos arteriales (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-08T11:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Aprende a fabricar andamios tubulares porosos de elastómeros biodegradables para ingeniería de tejidos arteriales. Este método utiliza células musculares lisas vasculares en un biorreactor de flujo pulsátil para producir matriz extracelular nativa.

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El autor agradece a la Dra. Gao Jin para la síntesis de PGS, el Dr. Peter Crapo para el debate profundo de biorreactor de configuración, los Dres. Mohamed Ezzelarab y Wei Wu de explante babuino arterias carótidas. Este estudio fue apoyado por una beca de los Institutos Nacionales de Salud (R01 HL089658).

1. Andamio tubular de fabricación <ol><li> Preparar un tubo de vidrio (longitud = 70 mm, diámetro externo = 9,0 mm, espesor de pared = 1,0 mm, piezas pequeñas, Miramar, FL) como molde para andamio. </li><li> Prepare 1,0 wt / vol% de ácido hialurónico (HA) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) mediante la disolución de 100 mg de HA en 10 ml de agua destilada. Mezclar con un rotor de la noche hasta que no queden burbujas de aire en la solución. </li><li> Vierta 1,0% solución de alta en la parte superior del tubo de vidrio. Deja que fluya lentamente a lo largo de la pared interior del molde. Dé la vuelta a la tubería cuando la solución alcanza el fondo del molde con el rotador y repetir este paso hasta que la pared interior del molde es uniformemente recubiertos por la solución. </li><li> Después del recubrimiento, en seco todos los tubos de vidrio en el horno al vacío a 37 ° C durante 24 h. </li><li> Molienda y las partículas de sal tamiz (size = 25-32 micras), utilizado como porogens. </li><li> Montar un tubo de vidrio (en el interior recubierto con HA 1,0% solución), el mandril (de acero inoxidable recubierto por un tubo de PTFE), termorretráctiles manga (SA), y el anillo de PTFE como se describió anteriormente 8. </li><li> Añadir las partículas de sal del tamaño deseado para el molde de vidrio con una espátula a través del embudo de caucho de silicona. Toque en el molde con cuidado para garantizar una distribución uniforme de partículas de sal. Raspar las partículas de sal en exceso en la parte superior del molde con el lado de la espátula. </li><li> A su vez en la hibridación incubadora durante 30 minutos antes de transferir el molde lleno de sal. Apague la hibridación incubadora y poner la sal llena de moho en la hibridación incubadora para la fusión de la sal. </li><li> Retire los moldes de la hibridación incubadora y secarlos en el horno de vacío a 37 ° C durante 24 h. </li><li> Retire el molde lleno de sal de la estufa de vacío y permita que se enfríen a temperatura ambiente. Retire el mandril de acero inoxidable, presionando hacia abajo con la celebración del anillo de PTFE. Si el mandril es demasiado estrecho para el molde, utilice el alicates para tirar de él hacia fuera. Retire el anillo de PTFE desde el fondo del molde. </li><li> Ponga el molde en el horno a 120 ° C durante 5 minutos para reducir la manga SA. Comprobar si la manga del SA, se está reduciendo. Retire la funda del SA de los moldes lleno de sal y deje que se enfríen a temperatura ambiente. Mantener los moldes en el desecador hasta su utilización. </li><li> Prepare la solución de PGS mediante la disolución de 3 g de la DGP en 15 ml de tetrahidrofurano (THF) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) para formar un peso de 20 / solución vol%. </li><li> Añadir la solución de PGS a la luz de la sal lleno de moldes dejándolo caer con un spoid en la campana de Hume. Incline el molde de vidrio de unos 45 ° y dejar la solución de PGS en la cavidad interna con rotación del molde lentamente. Compruebe si la solución PGS fluye hacia abajo a lo largo de la pared del molde. Si la mancha seca se observa, añadir más solución. </li><li> Después de añadir la solución de PGS, coloque los moldes en la campana de Hume por lo menos durante 30 minutos para evaporar THF. </li><li> Ponga el molde en el horno de vacío para el tiempo de curado pre-determinado (por ejemplo, 24 / 36 / 48 h) a 100 mTorr y 150 ° C para curar PGS. </li><li> Después de curar, sacar los moldes y ponerlos a la temperatura ambiente se enfríe. Sumerja cada molde en el agua destilada con la posición vertical lentamente. No sumerja ellos en el ayuno de agua debido a las burbujas de aire pueden causar desgarro del andamio. </li><li> La transferencia de los moldes para el baño de agua con cuidado y colocarlos en un ángulo de 1 h con tubo de silicona para disolver HA fácilmente. Compruebe si HA se disuelve en el molde. Si no se libera HA del molde, empuje el extremo del andamio lentamente con una espátula para que la liberación del molde. Repita este paso en el otro extremo del andamio y sacudir el molde de un lado a otro lentamente en el baño de agua. Revise si el andamio se mueve dentro del molde. </li><li> Transferir el andamio a otro baño de agua con un agitador con cuidado. No tomar el andamio con firmeza, lo que podría romper el andamio. Coloque el armazón en el baño de agua durante al menos 3 días con el cambio de agua para lixiviar las partículas de sal. </li><li> Después de la lixiviación de las partículas de sal, la transferencia de cada uno de andamios para el tubo de centrífuga de 15 ml llena de agua destilada y colocarlos en la caja de hielo seco durante 1 h para congelar. Poner tubos de centrífuga en el liofilizador (todas las cabinas del tubo debe estar abierto) y liofilizar ellos por 2 días. </li><li> Ponga todos los andamios en el desecador antes hasta su utilización. </li></ol> 2. Andamio Preparación para la siembra de células <ol><li> Saque de andamios en el desecador y se cortan en un 25-30mm de longitud. </li><li> Prepare dos tapones de goma de silicona (diámetro = 20 mm, espesor de pared = 6,35 mm, diámetro medio = 3 mm) y conectar dos tubos de PTFE (diámetro externo = 3,97 mm, diámetro interior = 2,38 mm, espesor de pared = 0,79 mm, longitud = 60 mm y 40 mm) a través de los orificios de centro de cada tapón. </li><li> Cortar un anillo de SA como de 1,5 mm de longitud y lo puso en la cima de uno de los extremos del andamio. Impulsar un tubo de PTFE (conectado tapón de goma de silicona) en el extremo de un andamio en pequeña parte se superponen como sea posible. </li><li> Coloque el tubo de andamio y PTFE en el horno a 120 ° C durante 10 minutos para reducir el tamaño del anillo SA. Comprobar si el anillo SA es reducido y los andamios están conectados a un tubo de PTFE con firmeza. </li><li> Saque el tubo de andamio y PTFE y ponerlos a la temperatura ambiente se enfríe. Monte el conjunto de tubos de andamio-PTFE en el tubo de policarbonato (diámetro externo = 15,5 mm, diámetro interior = 9 mm, longitud = 50 mm), como una cámara de biorreactor. </li><li> Conecte el otro extremo del tubo de PTFE al patíbulo como pasos 2.3) y 2.4). </li><li> Ajustar dos tapones de goma de silicona para fijar sus superficies interiores de los dos extremos del tubo de policarbonato. Coloque las dos superficies exteriores de los tapones de goma de silicona para dos placas de aleación de aluminio (superior e inferior, ancho = 20 mm, longitud = 70 mm, espesor = 6,35 mm). Poner dos varillas roscadas en el orificio lateral de la placa y fijar el tubo de policarbonato (incluido el interior de andamios) a las placas apretando la tuerca de tornillo en la placa. </li><li> Medir la longitud de cada seedable andamio (una longitud de entre dos anillos SA) y calcular el área de la superficie interna (π x diámetro interno x longitud seedable) de cada andamio para la siembra de células. </li><li> Envuelva un biorreactor unidad de cámara con papel de aluminio y esterilizar en autoclave a 120 ° C durante 30 min. Esterilizar a cada parte (depósito medio, tubo de la bomba, intercambiador de gas, colectores, y la válvula de aguja) del biorreactor en autoclave a 120 ° C durante 30 minutos y ensamblarlas dentro de la campana de cultivos celulares. </li><li> Pre-tratar y aclarar los andamios con una serie de infusiones (70, 50, y 25% de etanol durante 1 h, tampón fosfato salino (PBS; Mediatech, Herndon, VA) durante 2 horas y media SMC cultivo durante 24 h mediante el uso de una bomba peristáltica a 1,0 ml / min en el circuito de flujo. </li></ol> 3. La siembra de células y Cultura <ol><li> Aislar las células primarias del músculo liso arterial (SMC) de las arterias carótidas de menores babuinos machos (Papio anubis) y caracterizarlos en dos dimensiones (2D) la cultura antes de pases y la siembra, como se describió anteriormente 9. </li><li> Ampliar las CML con el MCDB 131 medianas (Mediatech, Herndon, VA) con un 10% de suero fetal bovino (Lonza, Walkersville, MD), 1% de L-glutamina (Mediatech), 50 mg / ml de ácido ascórbico (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ), y una solución de antibiótico-antimicótico (10.000 UI / ml de penicilina, 10000 mg / ml de estreptomicina y 25 mg / ml de anfotericina B; Mediatech). </li><li> Separe cada cámara biorreactor desde el circuito de flujo en el biorreactor. SMC semillas (paso 4-6) al cadalso con una densidad de 2x10 6 células / cm 2 mediante la inyección de la suspensión con una jeringa de 5 ml en la luz de los andamios después de cortar dos abluminal (entrada) y los flujos de luminal (salida). </li><li> Ponga todas las cámaras de biorreactor en la hibridación incubadora a 37 ° C y girarlas a 2 rpm durante 4 horas para permitir que las células se repartirán uniformemente en el andamio. </li><li> Saque cámaras biorreactor de la hibridación incubadora de volver a conectar a flujo de circuito del biorreactor en el capó. La transferencia de todo el sistema de biorreactores en cultivo celular incubadora. </li><li> Conecte el tubo de la bomba (diámetro interno = 1,6 mm) en el cartílago de la bomba peristáltica y la carga de medio de cultivo fresco en el depósito. Iniciar la perfusión a través de la pared (luminal de abluminal) a 1,0 ml / min durante 15 minutos seguido por el flujo luminal solamente. </li><li> Aumentar el caudal y la presión poco a poco a partir de 1,0 ml / min (estrés luminal de corte: 1,1 dinas / cm 2) y 20 mmHg en el día de 1 a 14,2 ml / min (15,3 dinas / cm 2) y 120 mmHg en el día 21, respectivamente. Cambiar el tubo de la bomba (diámetro interno = 3,2 mm) en el día 4 y el medio de una vez por semana. </li></ol> 4. Tejido de cosecha y preparación de muestras para el análisis <ol><li> Después de 21 días de la cultura, la parada de la bomba y los tubos de sujeción (entrada y salida) del yacimiento medio. Separe el tubo de la bomba del cartílago de la bomba peristáltica y un sistema de biorreactor de transferencia en el capó. </li><li> Abrazadera de entrada y salida de tubos de cada cámara de bioreactor y sáquelo del circuito de flujo. Abra el tubo de entrada y preparar un plato de Petri-en la tubería de salida para recoger el medio de cultivo en el interior del tubo de policarbonato. Abrir el tubo de salida lentamente y se elimina el medio de la cámara. </li><li> Separe aguja abluminal y tubo de silicona luminal de la cámara y retire las placas de aluminio por la liberación de tornillos. Retire el tubo de policarbonato y separar uno de los extremos del tejido construcción de la tubería de PTFE. </li><li> Preparar un petri plato lleno con 10 ml de PBS y separar al otro lado de la construcción de la tubería de PTFE. Ponga en la construcción de la PBS y enjuáguese la boca tres veces. </li><li> Cortar la construcción con una cuchilla de afeitar como de 5 mm de longitud. Congelarlo a -80 ° C congelador para análisis bioquímico o transferirla a 15 ml tubo de centrífuga llena con 5 ml de medio fresco para ensayos mecánicos o congelamiento rápido en el Tissue-Tek compuesto óptimo de temperatura de corte (Sakura Finetek Inc., Torrance, CA ) para el estudio histológico / inmunofluorescenciatinción orescence. </li></ol> 5. Los resultados representativos: Los andamios tubulares PGS fueron fabricados utilizando elastómeros biodegradables por el método de la sal de fusión (Fig. 1A). Cada cámara biorreactor siempre andamios con los flujos tanto luminal y abluminal y podría ser separada como una unidad separada de un circuito de corriente principal (Fig. 1B). Biorreactor sistema fue diseñado para el cultivo de cuatro andamios a la vez, controlar y supervisar el flujo, así como la presión (Fig. 1C y D). Esquemática de la cultura biorreactor se muestra en la figura. 2. Después de la siembra SMC, cada cámara biorreactor fue girado a 37 ° C durante 4 horas para distribuir uniformemente las células en el lumen del andamio. Y entonces, el flujo pulsátil se aplicó a los andamios hasta el día 14 con el caudal aumenta gradualmente (Fig. 2A) y presión (Fig. 2B). Después de 14 días, el flujo y la presión se mantiene constante hasta el final de la cultura (día 21). Morfología de la superficie del andamio PGS fue examinado por microscopía electrónica de barrido (SEM). Micrografías electrónicas de barrido mostró que el andamio había pared grosor consistente (539 ± 18 micras) (Fig. 3A) y distribuidas al azar de macro y micro-poros en la superficie luminal (Fig. 3B). Parámetros morfométricos del andamio se midió desde microcomputed tomografía computarizada (micro-CT) y análisis de imágenes. Tamaño de poro promedio es de 23,3 ± 3,9 micras y la interconectividad de los poros es del 99,4 ± 0,62%, lo que significa que todos los poros están totalmente interconectados en andamios. La porosidad medida por el desplazamiento de etanol es de 75,6 ± 2,7%. Morfología de las células de la construcción de PGS fue examinada por SEM (Fig. 4). SMC completamente cubierta de varias capas de la superficie luminal y fueron orientadas perpendicularmente a la dirección del flujo. Estos resultados muestran que el condicionamiento mecánico de biorreactor de flujo pulsátil compatible con la orientación de SMC en el andamio. La presencia de la matriz extracelular (MEC) y las fibras elásticas fueron examinadas por tinción H &amp; E y la elastina autofluorescencia (Fig. 5). Tinción H &amp; E demostrado que las células y las proteínas ECM completamente cubierto de la luz del PGS construir. Elastina autofluorescencia también mostró circunferencialmente organizado fibras elásticas en la superficie luminal de la construcción. Producción de proteínas ECM en los constructores de PGS fueron medidos a partir de los análisis bioquímicos. La elastina insoluble y el contenido de colágeno fueron 20,2 ± 9,1 mg / mg de tejido y 6,3 ± 1,9 mg / mg de tejido, respectivamente. <img src="/files/ftp_upload/2691/2691fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Andamio de fabricación y sistema de biorreactores. (A) Esquema de andamio tubular de fabricación. (B) la cámara de biorreactor. Los andamios se conecta a un tubo de PTFE, se coloca en el tubo de policarbonato, y se fija con tapones de goma de silicona y las placas de aleación de aluminio. Cada cámara tiene dos vías de flujo: flujo luminal (por tubo de silicona) y abluminal (por aguja). (C) biorreactor sistema que dentro de la incubadora. Incluye depósito de medio módulo de la bomba peristáltica, el intercambiador de gas, transductores de presión, dos colectores (superior e inferior), y la válvula de aguja. (D) sistema de biorreactor de colocarse fuera de la incubadora. Incluye monitor de la presión, la unidad de control de flujo, sistema de adquisición de datos, y el ordenador. <img src="/files/ftp_upload/2691/2691fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Esquema de la cultura biorreactor. (A) protocolo de cultivo. (B) aplicado perfiles de presión en cada momento (día 1, 4, 7 y 14). <img src="/files/ftp_upload/2691/2691fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Morfología superficial del andamio PGS. (A) Sección transversal. (B) Lumen. <img src="/files/ftp_upload/2691/2691fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Morfología celular de la construcción de PGS. (A) Lumen. (B) Sección de corte de 45 °. Las flechas en ambas cifras representan la dirección del flujo. <img src="/files/ftp_upload/2691/2691fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. Histología y elastina autofluorescencia de los PGS construir. (A) H &amp; E tinción. (B) autofluorescencia elastina correspondiente. L: lumen. Aumentos: 40X. Barra de escala: 50 micras.

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</ol>

La técnica de fabricación con un elastómero biodegradable descrito aquí tiene varias características. (1) Utilizamos el ácido hialurónico (HA) como una liberación del molde. Desde HA es soluble en agua, andamios fue liberado fácilmente de los moldes de vidrio después de la inmersión en agua. En este informe, se utilizaron 1,0 wt / vol% de solución de alta ya que la concentración baja (&lt;0.5 wt / vol%) de la solución no es viscosa y fluye hacia abajo tan rápido cuando se vierte en la parte superior del tubo de vidrio. A la solución de capa de HA de manera uniforme, que se volcó el tubo de vidrio cuando la solución voló la parte inferior de la tubería y se repite este paso. Este recubrimiento de HA es una crítica a nuestro procedimiento de fabricación de andamios para la liberación de final. (2) Se utilizó termorretráctil (SA) de manga para retener las sales en el tubo de vidrio. Ya que las sales se densamente poblado en el espacio entre la pared interior del tubo de vidrio y la manga del SA, manga SA mantiene sales después de la eliminación del mandril y el anillo de PTFE en la parte inferior de la tubería. Podríamos eliminar manga SA fácilmente poniendo el molde en un horno a 120 ° C durante 5 minutos, y luego las plantillas tubular de sal. (3) Se utilizó el método de fusión de sal. Es bien sabido que el método de la sal de fusión puede mejorar la interconectividad de los poros y las propiedades mecánicas, variando el tiempo de fusión 10. Por otra parte, ya que utilizamos PGS, macroporos fueron producidas por las partículas de sal durante el proceso de lixiviación, mientras que los microporos se han generado probablemente por vapor de glicerol formados durante PGS curado como hemos descrito previamente 11. Por lo tanto, este método tiene un gran potencial para la fabricación de andamios tubulares poroso con diferentes macro y micro-estructuras mediante la variación de las partículas de sal, así como PGS curar enfermedad. El acondicionamiento mecánico del biorreactor ha proporcionado la perfusión flujo pulsátil (media máxima del flujo = 14 ml / min, esfuerzo cortante máximo = 15,3 dinas / cm 2, la frecuencia = 0,5 a 1,7 Hz) y fisiológicamente relevantes de presión con el andamio PGS, lo que llevó a SMC crecimiento y la orientación (Fig. 4). Estos resultados son consistentes con estudios previos de información que se extienden cíclico en esta frecuencia y tensión de corte aumenta la proliferación de SMC 12, y la producción de proteínas ECM 13,14. Además del crecimiento de SMC y la orientación, la construcción de PGS apoyo a la producción de proteínas ECM, especialmente circunferencialmente organizado fibras elásticas (Fig. 5) dentro de la cultura de 3 semanas en el biorreactor. Algunos estudios con un elastómero andamio como una construcción de pequeño diámetro arterial han demostrado resistencia mecánica y la presión de rotura comparables a las arterias nativas 15, y una rápida integración de SMC en los andamios cumplen con spinner frasco de 16,17, mientras que las fibras elásticas no se encuentran en estas construcciones. Nuestros resultados sugieren que la distensión cíclica radial desde el biorreactor mejorar la transducción de señales mecánicas con mayor eficacia a las CML en PGS andamio, lo que probablemente contribuyó a la síntesis de elastina y de la organización. Desde las CML vasculares fueron las únicas células que producen proteínas ECM en nuestro enfoque, el endotelio quiescente y mejorar la resistencia mecánica es necesaria para lograr un éxito clínico de pequeño diámetro construye arterial. Nos han informado de que las células endoteliales co-cultivadas con SMC genera una monocapa y la expresión de proteínas fenotipo apoyado en nuestras condiciones de cultivo y el acondicionamiento mecánico 9. Por lo tanto, sobre la base de nuestro método aquí descrito, la modificación de las condiciones del experimento de co-cultivo sería un siguiente paso para mejorar las funciones de las construcciones resultantes y generar sólidas nonthrombogenic, y conforme arterial construcción similar a las arterias nativas.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> El ácido hialurónico sal de sodio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H7630 </td></tr><tr><td> Tetrahidrofurano </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 401757 </td></tr><tr><td> MCDB 131 </td><td> Mediatech </td><td> 15 a 100 CV </td></tr><tr><td> De suero fetal bovino </td><td> Lonza </td><td> BW14-502F </td></tr><tr><td> L-glutamina </td><td> Mediatech </td><td> 25 a 005 CV </td></tr><tr><td> El ácido ascórbico </td><td> Fisher Scientific </td><td> A62-500 </td></tr><tr><td> Antibiótico-antimicótico solución </td><td> Mediatech </td><td> 30 a 004-CI </td></tr><tr><td> Tampón fosfato salino (PBS) </td><td> Mediatech </td><td> 21 a 031 CV </td></tr><tr><td> Tissue-Tek compuesto óptima temperatura de corte, 4583 </td><td> Sakura Finetek </td><td> 25608-930 </td></tr></tbody></table>

pgs elastomérico andamios en ingeniería de tejidos arteriales

Elastomeric PGS Scaffolds in Arterial Tissue Engineering

La enfermedad cardiovascular es una de las principales causas de mortalidad en los EE.UU. y, sobre todo, la enfermedad coronaria aumenta con envejecimiento de la población y aumento de la obesidad 1. En la actualidad, la cirugía de bypass utilizando vasos autólogos, los aloinjertos, injertos sintéticos y que se conoce como un uso común de los sucedáneos de 2 arterial. Sin embargo, estos injertos tienen aplicaciones limitadas cuando un diámetro interior de las arterias es inferior a 6 mm, debido a la escasa disponibilidad, las complicaciones trombóticas, el desajuste de cumplimiento, y la hiperplasia de la íntima finales de 3,4. Para superar estas limitaciones, la ingeniería de tejidos ha sido aplicado con éxito como una alternativa prometedora para el desarrollo de pequeño diámetro que se construye arterial nonthrombogenic, robusto y compatible. Varios estudios previos han desarrollado estructuras de pequeño diámetro arterial con tri-laminar estructura, excelentes propiedades mecánicas y la presión de rotura comparables a las arterias nativas 5,6. Mientras que la fuerza de alta resistencia y presión de ruptura mediante el aumento de la producción de colágeno a partir de un material rígido o células hoja de andamio, estas construcciones aún tenía bajo la producción de elastina y el cumplimiento, que es un problema importante para causar el fracaso del injerto después de la implantación. Teniendo en cuenta estas cuestiones, la hipótesis de que un biomaterial elastoméricas combinadas con acondicionamiento mecánico que proporcionan elasticidad y llevar a cabo las señales mecánicas de manera más eficiente a las células vasculares, que aumentan la producción de matriz extracelular y apoyar la orientación celular. El objetivo de este informe es presentar una técnica de fabricación de andamios tubulares porosa y un condicionamiento mecánico dinámico para su aplicación a la ingeniería de tejido arterial. Se utilizó un elastómero biodegradables poli (sebacato de glicerol) (PGS) 7 para la fabricación de andamios tubulares porosa del método de fusión de sal. Células adultas de la primaria babuino del músculo liso (SMC) se sembraron en el lumen de los andamios, que se cultivan en nuestro biorreactor diseñado flujo pulsátil durante 3 semanas. Andamios PGS había espesor constante y una distribución aleatoria de macro y micro-poros. Acondicionamiento mecánico del bioreactor de flujo pulsátil SMC apoya la orientación y la mayor producción de MEC en los andamios. Estos resultados sugieren que los andamios de elastómero y el acondicionamiento mecánico de la cultura biorreactor puede ser un método prometedor para la ingeniería de tejidos arteriales.

PGS elastomérico andamios con células musculares lisas vasculares cultivadas en un biorreactor de flujo pulsátil puede llevar a prometedores de pequeño diámetro arterial construye con la producción de ECM nativa en un período de cultivo relativamente corto.

PGS elastomérico andamios en ingeniería de tejidos arteriales

Las enfermedades cardiovasculares son una de las principales causas de mortalidad en los EE. UU. y, especialmente, la enfermedad de las arterias coronarias aumenta a medida que la población envejece y...

Este video muestra cómo fabricar andamios tubulares porosos y someterlos a un acondicionamiento mecánico dinámico para la ingeniería de tejidos arteriales. Esto se logra primero fabricando los andamios mediante un elastómero biodegradable y el método de fusión por aspersión. Luego, los andamios se preparan para la siembra celular y se ensamblan en un sistema de biorreactor.En el biorreactor, las células musculares lisas vasculares siembran los andamios y se cultivan. Semanas después, se recoge el tejido y se analiza mediante microscopía electrónica de barrido, tinción con hematoxilina y eosina y autofluorescencia de elastina. El músculo liso resultante es tanto multicapa como de orientación perpendicular.La principal ventaja de esta técnica en comparación con métodos existentes como el blanqueo de partículas consiste en utilizar un molde de vidrio para fabricar una estructura tubular porosa con ácido hialurónico. A medida que el molde se elimina, el andamiaje se prepara a partir de un trozo de tubo de vidrio. Coloque el tubo en un soporte y vierta en el interior la solución de ácido hialurónico preparada el día anterior. El ácido hialurónico fluye lentamente hacia abajo a lo largo de la pared interna. Cuando llegue al fondo del molde, invierta el molde. Repita este paso hasta que la pared interna del molde esté uniformemente recubierta por la solución.Después del recubrimiento, seque todos los moldes de vidrio preparados en una estufa al vacío a 37 grados Celsius durante 24 horas. Normalmente, se preparan cuatro moldes simultáneamente mientras los moldes de vidrio se secan. Prepare las vertidas de partículas de sal, muela y tamice las partículas de sal SVE a entre 25 y 32 micrómetros.Al día siguiente, ensamble el mandril de molde de vidrio preparado, el tubo de PTFE, la funda termorretráctil y el anillo de PTFE. Primero, coloque el mandril en segmentos de 65 milímetros de longitud de tubo de PTFE y colóquelos a horno durante cinco minutos a 120 grados Celsius. Mientras espera, para encoger el PTFE, precaliente un incubador de hibridación a 37 grados Celsius durante al menos 30 minutos.Una vez que el tubo haya cubierto los mandriles, deslice el manguito termorretráctil sobre el mandril para que se mueva libremente. Luego coloque el mandril dentro del molde de vidrio y sujete el anillo de A-P-T-F-E en la parte inferior del mandril. Verifique que el anillo de PTFE quede firmemente ajustado en la parte inferior del molde de vidrio.A continuación, utilizando una espátula y un embudo de caucho de silicona, agregue papillas de partículas de sal al molde de vidrio. Luego, golpee suavemente el molde con la espátula para lograr una distribución uniforme de las partículas y retire el exceso de sal. Ahora apague el incubador calentado y coloque rápidamente los moldes rellenos de sal; la sal se fusionará durante los próximos 30 minutos, tras lo cual seque los moldes en un horno al vacío a 37 grados Celsius durante 24 horas.Al día siguiente después del enfriamiento, retire el mandril de acero inoxidable de los moldes empujándolo hacia afuera mientras sujeta el anillo de PTFE. Si es necesario, utilice pinzas de punta fina. Luego, retire el anillo de PTFE de la parte inferior del molde.A continuación, hornee los moldes para encoger la funda y retire las fundas encogidas de los moldes. Deje enfriar los moldes hasta que se utilicen y guárdelos en un desecador dentro de una campana. Utilizando un gotero, coloque los moldes de vidrio en un ángulo de 45 grados e introduzca gotas de solución de PGS en su luz interna mientras gira lentamente el molde.Verifique si la solución de PGS fluye hacia abajo por la pared del molde. Si hay un punto seco, agregue más PGS. Ahora permita que el THF se evapore en la campana durante al menos 30 minutos. Una vez que el THF haya desaparecido, cure los moldes en un horno al vacío.Después de curar durante un día, enfríe los moldes a temperatura ambiente y sumérjalos lentamente, en forma vertical, en agua desionizada a 24 grados Celsius. Inclinarlos demasiado rápido crea burbujas de aire, que rompen el andamio. Transfiera cuidadosamente los moldes al baño de agua.Colóquelos en un ángulo utilizando un tubo de silicona y deje que el ácido hialurónico se disuelva durante una hora. Si después de una hora el ácido hialurónico no se ha liberado del molde, con el molde aún sumergido, utilice una espátula para empujar lentamente el ácido hialurónico desde ambos extremos y luego agite suavemente el molde. Ahora, verifique que los andamios no se hayan movido dentro del molde de vidrio, y en caso afirmativo, tire lentamente del andamio con pinzas para liberarlo del molde.A continuación, elimine las partículas de sal lixiviándolas al transferir cuidadosamente los andamios delicados a un baño de agua desionizada con agitación suave. Este proceso tomará al menos tres días y requiere que el agua se cambie diariamente. Una vez que toda la sal haya sido eliminada, transfiera cada andamio a un tubo cónico de 15 mililitros lleno con agua desionizada y congélelos en una caja de hielo seco durante una hora. Coloque los tubos cónicos congelados en un liofilizador durante tres días con las tapas abiertas.Una vez liofilizados, almacene los andamios en un desecador hasta su uso. Comience cortando los andamios en longitudes de 25 a 30 milímetros. A continuación, prepare dos tapones de caucho de silicona pasando un tubo de PTFE a través de los orificios centrales de cada tapón.Luego, corte longitudes de un milímetro y medio del anillo HS y deslice un tramo sobre un extremo del andamio. Introduzca un tubo de PTFE unido al tapón en el mismo extremo del andamio, con suficiente superposición como para quedar debajo del anillo HS, asegurando así la conexión firme del andamio al tubo. Encojer el anillo HS en un horno y deje que el conjunto se enfríe hasta la temperatura ambiente. Ahora, un tubo de policarbonato de 50 milímetros, que funciona como la cámara del biorreactor, se desliza sobre el andamio y se fija en la superficie interna del tapón de caucho de silicona.Al igual que antes, se fija otro tubo de PTFE y un tapón en el otro extremo del andamio con un anillo hs para completar la cámara. El segundo tapón se une al otro extremo del tubo de policarbonato. A continuación, las superficies externas de los tapones se fijan a dos placas de aleación de aluminio.Introduzca dos varillas roscadas en el orificio lateral de cada placa y asegure las placas con tornillos de mariposa. Sujete el andamio al biorreactor. Ahora mida la longitud visible de cada andamio, que es la distancia entre los dos anillos hs, y calcule sus áreas superficiales internas.Para la siembra celular. En un autoclave, esterilice las cámaras envueltas individualmente en papel de aluminio junto con cada parte de la unidad del biorreactor. Una vez esterilizadas, arme el biorreactor dentro de una cabina de cultivo celular.Pretratamiento y enjuague del andamio con una serie de perfusiones utilizando una bomba peristáltica a un milímetro por minuto en el circuito de flujo. Comience enjuagando con etanol al 70 %, etanol al 50 % y luego etanol al 25 % durante una hora cada uno. Después de los tres enjuagues con etanol, realice un enjuague con PBS durante dos horas.Finalmente, perfundir el biorreactor con medio de cultivo para células musculares lisas durante 24 horas, tras lo cual quedará listo para la siembra celular y los experimentos. A continuación, siguiendo las instrucciones del manuscrito adjunto, sembrar el biorreactor con 2 millones de células por centímetro cuadrado y, durante los siguientes 21 días, cambiar el medio del tubo y realizar ajustes en la velocidad de la bomba. Gradualmente, la presión en el constructo aumentará de aproximadamente cuatro milímetros de mercurio el primer día de cultivo a más de 100 milímetros de mercurio después de dos semanas en cultivo; tras tres semanas en cultivo, cosechar las células y prepararlas para su análisis según se especifica en el manuscrito adjunto.Estos andamios tubulares de PGS fueron fabricados mediante el método de fusión con sal. Micrografías electrónicas de barrido demostraron que todos los andamios presentaban espesores de pared homogéneos y no se observaron defectos parciales en sus secciones transversales. Se observaron poros macro y micro distribuidos aleatoriamente en la superficie luminal de todos los andamios.Después del cultivo celular, las células musculares lisas multilaminares crecieron con una orientación perpendicular a la dirección del flujo. Además, las células y las proteínas de la matriz descelularizada cubrieron completamente la luz de todos los constructos de PGS. La autofluorescencia de la elastina también mostró fibras elásticas organizadas circunferencialmente en la superficie luminal del constructo.Después de ver este video, debería comprender cómo fabricar un andamio tubular poroso, observar las células y cultivar el andamio utilizando un biorreactor de diseño previo.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Nuestro grupo ha desarrollado un sistema de cultivo bio-reactor que imita el estrés pulsátil fisiológicos del sistema cardiovascular para regenerar implantables de pequeño diámetro injertos vasculares.

La ingeniería biológica basada en los injertos vasculares El uso de un biorreactor pulsátil

Este protocolo se centra en la utilización de la capacidad inherente de las células madre para tomar el ejemplo de su matriz extracelular circundante y ser inducidas a diferenciarse en múltiples fenotipos. Este manuscrito métodos extiende nuestra descripción y caracterización de un modelo utilizando un hidrogel bicapa, compuesto de PEG-fibrina y colágeno, a la vez co-diferenciar derivadas de tejido adiposo células...

Ingeniería de un hidrogel de dos capas para el control de la diferenciación ASC

Se informó de síntesis y fabricación de fibras electrohiladas largos que abarcan un área de depósito más grande a través de un colector de nuevo diseño de un nuevo polímero biodegradable llamado poli (glicerol-dodecanoato) (PGD). Las fibras fueron capaces de apoyar el crecimiento de células derivadas de células madre pluripotentes de ratón.

Electrospun fibroso Andamios de poli (glicerol-dodecanodioato) de Ingeniería Neural Los tejidos de las células madre embrionarias de ratón

A continuación, presentamos un protocolo para generar ingeniería tisular injertos de vasos que son funcionales para el injerto en ratones por doble siembra de células madre pluripotentes inducidas parcialmente (PIPSC) - deriva células musculares lisas y PIPSC - células endoteliales derivadas de un biorreactor andamio buque descelularizado.

Generación y Acrecentamiento de buques de ingeniería de tejidos en un modelo de ratón

Los andamios para la ingeniería de tejidos necesitan recapitular el complejo microambiente bioquímico y biofísico del nicho celular. Aquí, mostramos el uso de fibras de complejación de polielectrolitos interfaciales como plataforma para crear andamios poliméricos compuestos de múltiples componentes con liberación bioquímica sostenida.

Los andamios compuestos de fibras interfacial Polyelectrolyte para lanzamiento Temporalmente controlada de biomoléculas

Un andamio de la ingeniería de tejidos inyectable compuesto de poli (N-isopropilacrilamida) sulfato de condroitina-injertado (PNIPAAm-g-CS) que contienen micropartículas de alginato se preparó. La fuerza adhesiva, propiedades de hinchamiento y en la biocompatibilidad in vitro se analizaron en este estudio. Las técnicas de caracterización desarrolladas aquí pueden ser aplicables a otros sistemas de termogelificación.

Síntesis de termogelificante poli (N-isopropilacrilamida) compuestos de sulfato de condroitina-injertado con alginato micropartículas de Ingeniería de Tejidos

En este trabajo, se prepararon andamios de poli(ácido láctico)/polietilenglicol (PLA/PEG) mediante el uso de una combinación de mezcla de fusión y lixiviación selectiva. El método aquí discutido permitió desarrollar andamios de tres capas mediante un alto control tanto de la porosidad como del tamaño de los poros. También se evaluaron las propiedades mecánicas en un ambiente fisiológico.

Un Facile y respetuoso del medio ambiente de ruta para la fabricación de poli (ácido láctico) Los andamios con graduado Tamaño de poro

Un protocolo paso a paso para ensayos no destructivos y período largo supervisar el proceso de remodelado vascular y la degradación de andamio en cultura en tiempo real de biodegradables poliméricos basados en andamio tejido-dirigida vasos sanguíneos con el estímulo pulsátil usando la tomografía de coherencia óptica se describe aquí.

Monitoreo no destructivos del desarrollo Degradable andamio base ingeniería de tejido vascular mediante tomografía de coherencia óptica

Aquí se presenta una configuración de bioimpresión tridimensional, núcleo/cáscara, fácil de usar, para la fabricación en un solo paso de andamios huecos, adecuado para la ingeniería de tejidos de estructuras vasculares y otras estructuras tubulares.

Andamios de impresión de núcleo/concha para la ingeniería de tejidos de estructuras tubulares

La reconstrucción esofágica es un procedimiento desafiante, y el desarrollo de un esófago diseñado con tejido que permite la regeneración de la mucosa esofágica y el músculo y que se puede implantar como un injerto artificial es necesario. Aquí, presentamos nuestro protocolo para generar un esófago artificial, incluyendo la fabricación de andamios, el cultivo de biorreactores y diversas técnicas quirúrgicas.

Injerto con ingeniería de tejido para la reconstrucción esofágica circunferencial en ratas

El objetivo de este protocolo es ejecutar un cocultivo dinámico de macrófagos humanos y miofibroblastos en andamios electrospun tubulares para investigar la regeneración de tejidos impulsada por materiales, utilizando un biorreactor que permite el desacoplamiento del esfuerzo de cizallamiento y el estiramiento cíclico.

Un biorreactor multipíca para evaluar la capacidad inflamatoria y regenerativa de los biomateriales bajo flujo y estiramiento

Aprende a fabricar andamios tubulares porosos de elastómeros biodegradables para ingeniería de tejidos arteriales. Este método utiliza células musculares lisas vasculares en un biorreactor de flujo pulsátil para producir matriz extracelular nativa.

PGS elastomérico andamios en ingeniería de tejidos arteriales

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