Dominio transmembrana Oligomerización propensión determinada por el ensayo toxR

El objetivo general del siguiente experimento es investigar las propensiones a la ligamentización de proteínas, dominios transmembrana o T MD en un entorno de membrana natural. Esto se logra expresando el dominio transmembrana de interés en E. coli como una proteína quimérica con proteína de unión a maltosa para su localización en el periplasma y tox. R como indicador transcripcional, la ligamentización inducida por el dominio transmembrana da lugar a la dimerización de la toxina R y a la activación de la transcripción LXi. Como segundo paso, las células se lisan y se tratan con ONPG, que es hidrolizado por beta galacto a la especie absorbente de luz O nitro folato u ONP.

Los niveles de ONP se cuantifican midiendo la absorbencia de luz a 405 nanómetros. Con el fin de determinar los niveles de dominio transmembrana, los resultados de ligamentización revelan la propensión a la ligamentización de los dominios transmembrana basándose en un ensayo reportero de toxina R. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos biofísicos existentes, como la página SDS o la fluorescencia, es que el comportamiento del dominio transmembrana se estudia en una bicapa de fosfolípidos naturales por expresión en e. coli en lugar de un sistema mimético de membrana como un detergente.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de las proteínas de membrana, como la elucidación de las características estructurales clave involucradas en la asociación de hélices transmembrana. Antes del inicio de este protocolo, se preparan siete plásmidos que expresan la proteína quimérica requerida a partir de oligonucleótidos sintetizados comercialmente, que representan el TDS de interés flanqueado por NHE uno y BMH uno. Sitios de restricción: después de que los plásmidos se hayan preparado, descongele suavemente las células competentes fhk 12 en hielo. Una vez descongeladas, se transfieren las células a tubos de cultivo de 15 mililitros a 200 nanogramos de cada ADN plasmático a un tubo separado y se incuban las células en hielo durante 30 minutos.

A continuación, se someten a un choque térmico de las células durante 90 segundos a 42 grados centígrados, seguido de una incubación en hielo durante dos minutos a 800 microlitros de medio SOC y se incuban las muestras a 37 grados centígrados con agitación durante una hora después de la incubación, se inoculan cinco mililitros de medios LB que contienen cloranfenicol y aose 50 microlitros de la mezcla de transformación utilizando tubos de cultivo de 15 mililitros por triplicado para cada muestra. Finalmente, incubar las muestras a 37 grados centígrados con agitación durante 20 horas. Para medir toda la ligamentización de TDS se determina la actividad de la beta galactotasa.

Primero, precaliente el lector de placas a 28 grados centígrados. Utilice el material tampón Z para preparar nuevas soluciones tampón Z como se describe en el protocolo escrito. Transfiera el cloroformo tampón Z del tubo al depósito, asegurándose de canalizar solo la capa acuosa superior del cloroformo tampón Z.

Coloque la placa de 96 pocillos en una hoja de papel con una cuadrícula dibujada para garantizar un pipeteo preciso, transfiera 100 microlitros de cloroformo tampón Z a cada pocillo de una placa de 96 pocillos, seguido de cinco microlitros de cada cultivo en cuádruple. Duplicar omitir el cultivo de los cuatro pocillos que servirán como espacios en blanco. Mida el diámetro exterior 5 95 de la placa para determinar la densidad de celdas.

Agregue 50 microlitros de SDS de tampón Z a todos los pocillos de la placa. A continuación, agite la placa en el lector de placas durante 10 minutos para retirar las células después de la lisis celular a 50 microlitros de ZPA para ONPG a todos los pocillos. Regrese la placa al lector de placas y mida el diámetro exterior 4 0 5 cada 30 segundos durante 20 minutos.

Determine el nivel de actividad de beta lacto sase a través de un cálculo de las unidades de Miller que se normalizan a la pieza en blanco. La Western blot se realiza para verificar la expresión de proteínas equivalentes entre constructos. Primero, combine 50 microlitros de los cultivos por triplicado y luego centrifugue las muestras con una microcentrífuga.

Retirar el sobrenadante mediante pipeteo y resus. Suspender el pellet residual en dos x carga tampón de carga de muestra de 7,5 microlitros de cada muestra en un gel estándar al 8% y realizar electroforesis a 125 voltios durante una hora y cinco minutos después de la transferencia. La incubación de la membrana con el anticuerpo conjugado anti M-V-P-H-R-P para visualizar la proteína quimérica se observa a aproximadamente 70 kilodaltons, con algunos productos de degradación que a veces se observan alrededor de 48 kilodaltons.

También se observa MVP endógeno a 45 kilodaltons. Con el fin de evaluar la inserción adecuada en la membrana de la construcción quimérica TMD, se utiliza la línea celular PD 28 deficiente en proteína de unión a maltosa cuando se cultiva en medios mínimos con maltosa como única fuente de carbono, solo pueden crecer células que expresan un producto de expresión integral de membrana con proteína de unión a maltosa correctamente ubicada en el periplasma. Transformar las células PD 28 como se describe para las células fhk 12 e inocular dos mililitros de medio LB.

Haga crecer las células a 37 grados centígrados agitándolas a 300 RPM durante la noche después de la incubación. Pellet las células por centrifugación y lavado por suspensión Resus en dos mililitros de PBS y pipeteo suave con una punta grande. Después de la granulación, las células se lavan nuevamente con PBS por segunda vez, luego realizan una centrifugación final y una suspensión de resus en un mililitro de PBS.

Utilice 25 microlitros de las células resuspendidas para inocular cinco mililitros de medio mínimo. Incubar las celdas a 37 grados centígrados con agitación a las 15 horas. Transfiera 200 microlitros de cada muestra a una placa de 96 pocillos y tome la lectura de OD 5 9 5 con el lector de placas.

Repite este proceso cada dos horas hasta las 25 horas. Se analizó la propensión a la ligamentización total de los dominios transmembrana individuales de la proteína integral de membrana multis y la proteína uno de membrana latente mediante el ensayo reportero transcripcional tox R. El dominio transmembrana cinco exhibe una fuerte propensión al aumento de liga, como lo demuestran las unidades de Miller altas, que es comparable a la secuencia de dimerización GPAA de control positivo bien establecida.

Una mutación deletérea en el dominio transmembrana cinco D uno 50 A reduce la capacidad de la secuencia para aumentar todo el liga, LMP uno, TM uno no aumenta significativamente todo el liga, y exhibe una señal unitaria de Miller muy baja justo por encima de la señal para blanco, que son las células FHK 12 no transformadas. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo determinar si una hélice transmembrana de interés tiene la capacidad de formar complejos de orden superior en un entorno de membrana natural Al intentar este procedimiento, es importante pipetear con mucho cuidado en la placa de 96 pocillos para evitar errores grandes y asegurarse de que no se introduzcan burbujas de aire.