Un método simple y eficaz para aislar los macrófagos de la Mezcla de cultivos primarios de células de hígado en adultos

El objetivo general del siguiente experimento es obtener múltiples cultivos de macrófagos a partir de cultivos primarios mixtos de células de hígado de rata sin necesidad de equipo complejo ni habilidades especializadas. Esto se logra primero mediante la disociación de células hepáticas de rata adulta por perfusión con colagenasa, seguida por el aislamiento de la fracción celular parenquimatosa de hepatocitos. A continuación, las células se incuban en matraces para cultivo de tejidos de 75 cm² (T 75) con medio de crecimiento para establecer cultivos primarios mixtos de células hepáticas.

Luego, tras 10 a 12 días de cultivo, los frascos de cultivo se agitan para facilitar la transferencia de los macrófagos a placas de plástico, desde donde se obtienen mediante adhesión selectiva tras un breve período de incubación. Finalmente, más de 10 de las seis células pueden obtenerse repetidamente del mismo frasco de cultivo de tejidos T 75 a intervalos de dos a tres días durante más de dos semanas. Los métodos de aislamiento de macrófagos hepáticos han sido ampliamente descritos.

Sin embargo, la mayoría de los métodos anteriores requieren equipos sofisticados, como un ilustrador centrífugo, y habilidades técnicas refinadas. Aquí presentamos un método sencillo y novedoso para obtener macrófagos hepáticos en número y pureza suficientes a partir de cultivos primarios mixtos de células hepáticas adultas envueltas, que no requiere equipo especial ni habilidades avanzadas de laboratorio. La disección del animal, la perfusión del hígado y la preparación de los citos serán demostradas por los doctores Norco, Yamanaka y Miko Yoshioka en el Instituto Nacional de Salud Animal.

A continuación, el aislamiento y la purificación de macrófagos hepáticos a partir de riesgos culturales serán mostrados por el Dr. Taketo Takeno en el Instituto Nacional de Ciencias Agrobiológicas. Comencemos. Para preparar la perfusión del hígado de rata, comience precalentando una botella de solución de lavado y una botella de solución de colagenasa.

Luego, tras confirmar la sedación mediante un pellizco en la piel, coloque una rata macho adulta anestesiada en una bandeja de acero inoxidable y rocíe etanol al 70 % sobre su abdomen y tórax. A continuación, realice un pequeño corte en la parte media del abdomen con tijeras de disección y retire la piel hacia atrás. Luego, abra el abdomen con las tijeras y confirme la ubicación de la vena porta.

A continuación, pase el hilo quirúrgico por debajo de la vena porta y apriete ligeramente el hilo. Luego, sujete la parte distal de la vena cava inferior y la vena mesentérica con una pinza mosquito para evitar el reflujo sanguíneo hacia el hígado. Abra la cavidad torácica cortando el diafragma con tijeras y exponga el corazón tras realizar una pequeña incisión en la vena porta con tijeras oftálmicas; inserte un catéter plástico de dos milímetros en la vena y apriete firmemente el hilo alrededor del catéter.

Cargue un sistema de perfusión con la solución de lavado precalentada y luego conéctelo al catéter. Inicie la perfusión en C dos a una velocidad de 10 mililitros por minuto. Al mismo tiempo, realice un corte en la pared del atrio derecho con tijeras de disección.

Continúe la perfusión durante 10 minutos, luego cambie la solución de perfusión por la solución de colagenasa y perfunda durante 10 a 20 minutos. A una velocidad de 10 mililitros por minuto, llene un vaso de precipitados estéril con 25 mililitros de solución de colagenasa. A continuación, retire y coloque cuidadosamente el hígado perfundido en el vaso de precipitados.

Picar el hígado en trozos pequeños con tijeras. Añadir 75 mililitros de MEM frío a la suspensión celular resultante. Después de pipetear suavemente, filtrar la suspensión a través de un colador celular de 100 micrómetros.

Para eliminar el tejido conectivo en los fragmentos de tejido no digeridos, recoger el filtrado en tubos cónicos de 50 mililitros. Transferir el filtrado a tubos cónicos de 50 mililitros y lavar las células cuatro veces, primero centrifugando las células a 50 G durante un minuto a cuatro grados Celsius. Tras la centrifugación, desechar cuidadosamente el sobrenadante y luego resuspender el botón celular en MEM frío y centrifugar nuevamente las células después del último lavado.

Re-suspender las células hepáticas en medio de crecimiento. A continuación, sembrar las células en cinco a diez frascos de cultivo de tejidos T 75 a una densidad de 6,7 × 10⁴ células por centímetro cuadrado. Colocar los frascos de cultivo en un incubador y cambiar el medio de crecimiento cada dos o tres días.

Después de un día de cultivo, los hepatocitos parenquimatosos se extienden sobre la superficie del frasco y muestran una morfología típica poligonal, semejante a piedras chatas, con uno o dos núcleos redondos. En unos pocos días de cultivo, los hepatocitos parenquimatosos pierden su morfología de célula epitelial y se transforman en células más aplanadas de tipo fibroblástico. Alrededor del día seis, comienzan a proliferar células brillantes redondas, semejantes a macrófagos, en la lámina de células fibroblásticas, observadas mediante contraste de fase. El crecimiento de las células semejantes a macrófagos alcanza niveles máximos alrededor del día 12.

El número de células similares a macrófagos disminuye alrededor del día 19, cuando la lámina de células fibroblásticas comienza a degenerar. Por lo tanto, alrededor de siete a 10 días de cultivo, suspendemos los macrófagos que han proliferado sobre la lámina celular en el medio de cultivo mediante agitación reciproca de los frascos de cultivo durante 30 minutos después de que los macrófagos hayan sido resuspendidos. Inocule cada una de las placas plásticas no destinadas al cultivo de tejidos de 100 milímetros con el medio procedente de dos frascos T-75.

Rellene los frascos de cultivo con medio de crecimiento y devuélvalos al incubador. Incube las placas de plástico durante 30 minutos después del período de incubación, lave las placas tres veces aspirando el medio y enjuagando suavemente la placa de plástico con PBS, como se observa aquí, tan pronto como 10 minutos después de sembrar las células similares a macrófagos, las cuales se adhieren a la superficie de la placa, mientras que otras células contaminantes de tipo fibroblástico permanecen en suspensión. Después del enjuague con PBS, se obtiene una población altamente purificada de macrófagos.

Como se observa en esta figura, las células adquieren una morfología típica de macrófago tras 40 minutos de cultivo, y con frecuencia se observan células mitóticas, indicadas por las flechas. Para recolectar esta nueva población de macrófagos altamente purificada, añada un mililitro de solución trip LE Express a las células lavadas y regrese las placas al incubador durante 10 minutos adicionales. Tras este período de incubación, agregue nueve mililitros de medio de crecimiento y luego desprenda suavemente los macrófagos adheridos con el raspador celular, transfiriéndolos a un tubo cónico de 15 mililitros, centrifugue y deseche el sobrenadante.

Añada un mililitro del medio de crecimiento, disocie los agregados celulares resuspendidos en células individuales mediante pipeteo vigoroso, determine el número de células mediante un hemocitómetro como se muestra en esta gráfica; más de 10 de las seis células pueden obtenerse de un frasco de cultivo T 75 repetidamente a intervalos de dos a tres días durante más de dos semanas, lo que permite un rendimiento celular total de 10 a la siete por frasco de cultivo T 75. Como se muestra en estas imágenes, las células aisladas están inmunomarcadas con anticuerpos monoclonales contra antígenos de macrófagos de rata, tales como CD 68 o ED uno y CD 1 72 A u OX 41. Estas células poseen propiedades funcionales de macrófagos, como la fagocitosis activa de microesferas marcadas con FITC.

En este video, presentamos un método sencillo y eficiente para obtener macrófagos a partir de cultivos primarios mixtos de células hepáticas rojas adultas. Nuestro procedimiento no requiere equipos ni habilidades complejas, pero proporciona cantidades suficientes de macrófagos puros que pueden obtenerse repetidamente del mismo cultivo de hígado. Este método puede aplicarse a otras especies de mamíferos.

Gracias por ver el video y mucha suerte en sus futuros experimentos. Saludos.