Un método simple y eficaz para aislar los macrófagos de la Mezcla de cultivos primarios de células de hígado en adultos

El objetivo general del siguiente experimento es obtener múltiples cultivos de macrófagos a partir de cultivos primarios mixtos de células de hígado de rata sin la necesidad de equipos o habilidades complejas. Esto se logra primero a través de la disociación de células hepáticas de rata adultas por perfusión de colagenasa, seguida del aislamiento de la fracción de células hepatocitarias parenquimatosas. A continuación, las células se incuban en matraces de cultivo de tejidos T 75 con medio de crecimiento para establecer cultivos primarios mixtos de células hepáticas.

Luego, después de 10 a 12 días de cultivo, los matraces de cultivo se agitan para facilitar la transferencia de los macrófagos a platos de plástico de los que luego se recolectan por adhesión selectiva después de un corto período de incubación. Finalmente, más de 10 de las seis células se pueden recolectar repetidamente de los mismos matraces de cultivo de tejidos T 75 a intervalos de dos a tres días durante más de dos semanas. Los métodos de aislamiento de los macrófagos hepáticos han sido bien descritos.

Sin embargo, la mayoría de los métodos anteriores requieren equipos sofisticados, como un ilustrador centrífugo y habilidades técnicas refinadas. Aquí presentamos un método simple y novedoso para obtener macrófagos hepáticos en número y pureza suficientes a partir de cultivos primarios mixtos de células hepáticas adultas envueltas que no requieren equipo especial ni habilidades de laboratorio avanzadas. La disección animal, la perfusión del hígado y la preparación de los citos serán demostradas por los doctores Norco, Yamanaka y Miko Yoshioka en el Instituto Nacional de Salud Animal.

Luego, el aislamiento y la purificación de macrófagos hepáticos de riesgos culturales serán mostrados por el Dr. Taketo Takeno en el Instituto Nacional de Ciencias Agrobiológicas. Así que comencemos. Para prepararse para la profusión del hígado de rata, comience por precalentar una botella de solución de lavado y una botella de solución de colagenasa.

Luego, después de confirmar la sedación por pellizco cutáneo, coloque una rata macho adulta anestesiada en una sartén de acero inoxidable y rocíe etanol al 70% en su abdomen y tórax. A continuación, haz un pequeño corte en el centro del abdomen con unas tijeras de disección y retira la piel. A continuación, abra el abdomen con las tijeras y confirme la ubicación de la vena porta.

A continuación, pase el hilo quirúrgico por debajo de la vena porta y apriete el hilo sin apretar. A continuación, pinzar la parte distal de la cava vanoc inferior y la vena mesentérica con una pinza antimosquitos para evitar el reflujo sanguíneo al hígado. Abra la cavidad torácica cortando el diafragma con unas tijeras y exponga el corazón después de hacer una pequeña incisión en la vena porta con unas tijeras oftálmicas, inserte un catéter de plástico de dos milímetros en la vena y apriete firmemente el hilo alrededor del catéter.

Cargue un sistema de perfusión con la solución de lavado precalentada y luego conéctelo al catéter. Iniciar la perfusión en C dos a razón de 10 mililitros por minuto. Al mismo tiempo, haga un corte en la pared de la aurícula derecha con unas tijeras de disección.

Continúe la profusión durante 10 minutos, luego cambie la solución de profusión por la solución de colagenasa y perfunda durante 10 a 20 minutos. A una velocidad de 10 mililitros por minuto, llene un vaso de precipitados estéril con 25 mililitros de solución de colagenasa. A continuación, retire y coloque con cuidado el hígado de perfusión en el vaso de precipitados.

Pica el hígado en trozos pequeños con unas tijeras. Agregue 75 mililitros de MEM frío a la suspensión celular resultante. Después de un pipeteo suave, filtre la suspensión a través de un filtro de celdas de 100 micrómetros.

Para eliminar el tejido conectivo en los fragmentos de tejido no digeridos, recoja el filtrado en tubos cónicos de 50 mililitros. Transfiera el filtrado a tubos cónicos de 50 mililitros y lave las celdas cuatro veces girando primero las celdas a 50 G durante un minuto a cuatro grados centígrados. Una vez retirado el descanso, deseche con cuidado el sobrenadante y luego vuelva a suspender el pellet en MEM frío y vuelva a girar las células después del último lavado.

Resuspender las células hepáticas en el medio de crecimiento. Ahora siembre las células en cinco a 10 matraces de cultivo de tejidos T 75 a una densidad de 6,7 veces 10 a la cuarta celda por centímetro cuadrado. Coloque los matraces de cultivo en una incubadora y reemplace el medio de crecimiento cada dos o tres días.

Después de un día de cultivo, los hepatocitos parenquimatosos se diseminan en la superficie del matraz y muestran una morfología típica de piedra poligonal de copal con uno o dos núcleos redondos. A los pocos días de cultivo, los hepatocitos parenquimatosos pierden su morfología de células epiteliales y se transforman en células fibroblásticas más aplanadas. Alrededor del sexto día, contraste de fases, las células redondas brillantes como macrófagos comienzan a proliferar en la lámina celular fibroblástica. El crecimiento de las células similares a los macrófagos alcanza niveles máximos alrededor del día 12.

El número de células similares a macrófagos disminuye alrededor del día 19, cuando la capa de células fibroblásticas comienza a degenerarse. Por lo tanto, alrededor de siete a 10 días de cultivo, suspendemos los macrófagos que han proliferado en la lámina celular en el medio de cultivo mediante la agitación recíproca de los matraces de cultivo durante 30 minutos después de que los macrófagos se hayan resuspendido. Toque cada uno de los platos de plástico de 100 milímetros que no son de cultivo de tejidos con el medio de dos matraces T 75.

Vuelva a llenar los matraces de cultivo con medio de crecimiento y devuélvalos a la incubadora. Incube los platos de plástico durante 30 minutos después del período de incubación, lave los platos tres veces aspirando el medio y enjuague suavemente el plato de plástico con PBS como se ve aquí tan pronto como 10 minutos después de colocar las células similares a macrófagos adheridas a la superficie del plato mientras otras células fibroblásticas contaminantes permanecen suspendidas. Después del enjuague de PBS, se obtiene una población de macrófagos altamente purificada.

Como se ve en esta figura, las células adquieren la morfología típica de los macrófagos después de 40 minutos de cultivo y las células mitóticas se observan con frecuencia como lo indican las flechas. Para recolectar esta nueva población de macrófagos altamente purificada, se envió la solución LE Express a las células lavadas y se colocaron las placas nuevamente en la incubadora durante 10 minutos adicionales. Después de este período de incubación, agregue nueve mililitros de medio de crecimiento y luego raspe suavemente los macrófagos adheridos con el raspador de células y transfiéralo a una centrífuga de tubo cónico de 15 mililitros y deseche el sobrenadante.

Agregue un mililitro del medio de crecimiento, disocie los grupos de células resuspendidas en células individuales mediante un pipeteo vigoroso, enumere el número de células mediante hemocitómetro como se muestra en este gráfico, más de 10 de las seis células se pueden recolectar de un matraz de cultivo T 75 repetidamente a intervalos de dos a tres días durante más de dos semanas, lo que permite un rendimiento total de celdas de 10 a siete por matraz de cultivo T 75. Como se muestra en estas imágenes, las células aisladas están inmunoteñidas con anticuerpos monoclonales contra antígenos de macrófagos de rata como CD 68 o ED one y CD 1 72 A u OX 41. Estas células poseían propiedades funcionales de los macrófagos, como la fagocitosis activa de las microesferas marcadas con FITC.

En este video, presentamos un método simple y eficiente para obtener macrófagos a partir de cultivos primarios mixtos de glóbulos rojos adultos. Nuestro procedimiento no requiere equipos o habilidades complejas, pero proporciona un número suficiente de macrófagos puros que se pueden recolectar repetidamente del mismo cultivo de latón. Este método se puede aplicar a otras especies de mamíferos.

Gracias por ver el video y buena suerte en tus futuros experimentos. Bien.