La cuantificación de la actividad de Cis Elementos reguladores en la retina del ratón por electroporación explante

Este protocolo describe un método simple y económico para cuantificar la actividad de los elementos reguladores cis (es decir, potenciador / promotores) que viven en la retina del ratón a través de electroporación explante. Preparación del análisis de ADN, la disección de la retina, la electroporación, la cultura de explantes de retina, y después de la fijación y cuantificación se describen.

El objetivo general de este procedimiento es electropurar implantes de retina de ratón con reporteros transcripcionales fluorescentes y cuantificar sus niveles de expresión. Esto se logra aislando primero el tejido de la retina de ratón neonatal mediante disección. El segundo paso del procedimiento es electro la retina con construcciones reporteras de ADN fluorescente.

El tercer paso del procedimiento es cultivar las retinas electroporadas como implantes durante ocho días. El paso final del procedimiento es recolectar la muestra de retina y cuantificar los niveles de expresión de los reporteros fluorescentes. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran los niveles relativos de expresión de diferentes construcciones de promotores reporteros en la retina del ratón en desarrollo a través de la electroporación x explan, seguida de un análisis de datos cuantitativos.

Mi nombre es Joe Corbo y soy miembro de la facultad en el Departamento de Patología e Inmunología de la Facultad de Medicina de la Universidad de Washington en St. Louis. Y hoy vamos a presentar un protocolo de video que demuestra la técnica de electroporación X explan en retinas de ratones recién nacidos con el propósito de cuantificar la actividad de los elementos reguladores de CYS específicos de fotorreceptores y demostrar este protocolo será una estudiante graduada de mi laboratorio, Cindy Montana. En primer lugar, esterilice la cámara de electroporación y todos los instrumentos con etanol al 70% en preparación para la recolección del ojo.

Desinfecte tanto los guantes como la mesa de trabajo con etanol y mantenga las condiciones estériles durante todo el procedimiento. A continuación, en una campana de cultivo de tejidos, pipetee seis mililitros de medio de disección en una placa de Petri estéril de 60 milímetros, y tres mililitros de medio en dos placas estériles de 35 milímetros. De vuelta en la mesa de trabajo, desinfecte la cabeza y el cuello de un cachorro de ratón recién nacido con etanol al 70%.

Después de decapitar rápidamente la cabeza con unas tijeras, transfiera la cabeza a un plato estéril de 100 milímetros, corte el cuero cabelludo con tijeras pequeñas para exponer los ojos bajo un microscopio de disección. Con pinzas curvas, saque suavemente el ojo de la órbita y luego colóquelo en un plato de 35 milímetros que contenga la disección. Medio. Continúe recolectando ojos de tal manera que haya de tres a cuatro ojos por alícuota de ADN para electroporar, manteniendo los ojos y el medio de disección a temperatura ambiente hasta que termine.

Desinfecte tanto una hoja de afeitar como el envoltorio de una pipeta de transferencia de plástico estéril con etanol al 70 % y, a continuación, utilice la hoja de afeitar para cortar la punta de la pipeta lo suficientemente alto como para poder pipetear un ojo completo. Con la pipeta ensanchada, transfiera un ojo de la antena de 35 milímetros a la antena de 60 milímetros bajo un microscopio de disección a alta potencia. Use pinzas finas para eliminar cualquier tejido, como los músculos extraoculares y la grasa, de la superficie del ojo.

A continuación, retira el nervio óptico pellizcándolo en la base. Para aislar la retina, haga un pequeño orificio en la esclerótica en el limbo, la esclerótica y el epitelio pigmentado de la retina aparecen brillantes en relación con el tejido de la retina, que es de color gris mate. Inserte una punta de ambos pares de pinzas en el orificio y abra suavemente la esclerótica y el EPR.

Asegúrese de dejar la lente en su lugar. Utilice la pipeta ensanchada para mover la retina diseccionada a la segunda placa de 35 milímetros que contiene medio. Recoja todas las retinas y guárdelas en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 grados centígrados.

Hasta la electroporación, trabajando en una campana de cultivo de tejidos para cada Eloqua de ADN a electroporar, llene una placa estéril de 35 milímetros con medio de disección y una segunda placa con medio de cultivo. Con una pipeta P 200, lave las cámaras de la placa de electroporación con XPB S3 estéril una vez. Llene las cámaras con las alícuotas de ADN de 60 microlitros y llene las cámaras no utilizadas con 60 microlitros de un XPBS.

Conecte los electrodos a la placa de electroporación e introduzca los ajustes adecuados en el electro. Utilice pinzas finas para agarrar las retinas por el cristalino y transferirlas a las cámaras de electroporación. Colocando hasta cuatro retinas en cada cámara.

Organice las retinas de manera que el cristalino se apoye contra la barra de metal unida al electrodo positivo. Limpie las pinzas entre cada cámara para evitar el arrastre de ADN de una cámara a la siguiente. Una vez que todas las retinas estén alineadas, presione iniciar en el electro.

Deben formarse pequeñas burbujas en la barra de metal unida al electrodo negativo. Desconecte los electrodos y apague el electro con pinzas. Aleje suavemente las retinas de las paredes de la cámara.

Transfiera las retinas de las cámaras a las placas de 35 milímetros que contienen el medio de disección. Con una pipeta de transferencia estéril, transfiera las retinas del medio de disección a las placas de 35 milímetros que contienen el medio de cultivo. Etiquete los pocillos de una placa de cultivo estéril de seis pocillos y llene cada pocillo con tres mililitros de cultivo. Medio.

Use pinzas estériles para flotar alrededor de los filtros de núcleo watman sobre el medio en cada pocillo con el lado brillante de los filtros hacia arriba. Con la ayuda de un endoscopio de disección, transfiera una sola retina al filtro con la lente de la pipeta de transferencia estéril hacia abajo. Si la retina aterriza con el cristalino hacia arriba, vuelva a subirla en la pipeta y vuelva a intentarlo.

No coloque más de cuatro retinas en cada pocillo y manténgalas en gotas separadas. Una vez que las retinas se hayan colocado en los pocillos, mueva la placa de cultivo a una incubadora de cultivo de tejidos a 37 grados Celsius y crezca durante la cantidad de tiempo deseada. Por lo general, la electroporación se ve con éxito y da como resultado la expresión de la construcción de ADN a través de un cuarto a un tercio de la superficie de la retina.

Los niveles de fluorescencia se cuantifican comparando regiones electroporadas uniformemente que expresan la construcción CRE con regiones fuera de la retina y luego se normalizan para controlar la expresión de GFP. Los fotorreceptores de bastones, en particular, se transducen de manera eficiente. Estos son los resultados de una electroporación en la que dos promotores específicos de varillas impulsan la expresión de GFP y DS rojo en la capa nuclear externa.

Al superponer los dos patrones de expresión con la tinción DPI que se muestra aquí en azul, la expresión específica del fotorreceptor es evidente. No se observa expresión ni en la capa interclear ni en la capa de células ganglionares. Después de ver este video, debería tener una buena idea de cómo diseccionar el electro y el cultivo de explantes de retina de ratón con el fin de cuantificar la actividad de los elementos reguladores de los quistes de retina.

Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.