Name: Mosaico de Análisis de la función de genes en el desarrollo postnatal del cerebro del ratón mediante el uso de virus basada en la recombinación Cre (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Aprende a manipular la función génica en el desarrollo cerebral postnatal de ratones mediante virus AAV recombinantes. Este método permite el etiquetado neuronal y el análisis de circuitos neuronales.

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Este trabajo es apoyado por una subvención del NIH RO1 (NINDS).

1. Los virus de la preparación para la inyección <ol><li> rAAVs fueron adquiridos por el proveedor recomienda comerciales, pero también pueden ser producidos en un laboratorio de propio (véase más adelante). La solución del virus se produce normalmente a un título de 1x10 ~ 12 copias del genoma por mililitro (GC / ml) y se puede utilizar en título completo de manipular un gran número de células. Alternativamente, pueden ser diluidos para producir el nivel deseado de etiquetado escasa. La dilución apropiada debe ser determinada por el usuario, pero una dilución 1:10 se recomienda para empezar. </li><li> Descongele los virus en el hielo inmediatamente antes del uso. La transferencia de la deseada pre-dilución de una solución de virus en un pequeño (250μl) del tubo de PCR. Diluir la solución de virus con un volumen adecuado de DPBS estériles en una campana de cultivo de tejidos. Guarde la solución virus diluido en hielo hasta que se necesite. </li></ol> NOTA: El manejo de todos los virus debe llevarse a cabo de acuerdo con un protocolo de bioseguridad aprobadas por su institución 2. Jeringa de carga y montaje de equipos <ol><li> Conecte la aguja de carga a la jeringa de vidrio y elaborar la solución de virus del tubo de PCR tirando suavemente del émbolo. Tire del émbolo hasta que una burbuja muy pequeña de aire se puede ver en la jeringa, lo que indica que toda la solución está en la jeringa y no se queda en la aguja de carga. Por otra parte, una pequeña cantidad de tinte inerte se puede agregar a la solución para que sea visible. NOTA: Un pequeño tubo de PCR debe utilizarse como la aguja de carga no suele ser lo suficientemente largo para llegar al fondo de la mayoría de los otros tubos. </li><li> Retire la aguja de carga y coloque la jeringa en el bloque de la jeringa de una bomba de inyección, asegurando que con el retén de la jeringa. </li><li> Introduzca suavemente un extremo del tubo conectivo en la jeringa, inserte el otro extremo en el soporte de la aguja. Insertar la aguja de inyección en el porta-agujas. El final de la aguja de inyección debe comunicarse directamente con el final de la tubería en el interior conectivo del titular de la aguja. </li><li> Lentamente el émbolo para empujar manualmente la solución a través del tubo conectivo. Presione hasta que una pequeña gota de solución es visible en la punta de la aguja de inyección. </li><li> Coloque con cuidado el émbolo junto al bloque de empuje y seguro en su lugar con el soporte de bloques de empuje. </li><li> Establezca los parámetros de inyección: la tasa de inyección debe ser de aproximadamente 8μl/min (~ 130nl / s), volumen de inyección es típicamente 1-2UL, seleccionar el diámetro de la jeringa apropiada para el tamaño de la jeringa que está utilizando (consulte el manual de la bomba de jeringa para obtener consejo). </li><li> Ajuste la placa de ~ 38 ° C y se cubre con una toalla de papel o delgada barrera para proteger a otros de los cachorros durante la fase de recuperación. </li></ol> 3. Inyección de procedimiento y la recuperación de las crías <ol><li> Prepare P0 o P1 crías de ratón para la inyección, sometiéndolos a la anestesia en frío después de un protocolo de IACUC aprobado. Humedezca una toalla de papel algunas con agua y colocar sobre el hielo. Coloque el número deseado de las crías (4-5) en la toalla de papel (mantenerlos bien separados) y tapa con cuidado las toallas de papel sobre las crías por lo que están cubiertos por una toalla de papel húmeda. Con cuidado, coloque una pequeña cantidad de hielo picado en la parte superior de las toallas de papel y se incuban las crías durante aproximadamente 5 minutos. Las crías pueden ser mantenidas en hielo durante 15 minutos y se recuperan bien después. </li><li> Después de que el cachorro es lo suficientemente anestesiado, colóquelo en un bloque de montaje (se utiliza un bloque de poliestireno que normalmente tiene 15 ml tubos) y la posición de mejor acceso al sitio de la inyección. De la corteza es más fácil de acostar a la de los animales en su vientre, mientras que para el cerebelo es útil a la posición del perrito de la cabeza sobre el borde del bloque para mejorar el acceso a la parte posterior del cráneo. El cachorro se puede asegurar en su lugar con una banda de ayuda, si así lo desea. </li><li> Sostenga la cabeza del cachorro en su lugar con una mano mientras la aguja se inserta manualmente a través del cráneo en el sitio deseado con la otra mano. Es útil para tirar de la piel tirante para evitar que se mueva durante la inyección. De la corteza es útil para que las inyecciones con respecto a un punto de referencia anatómicos bien definidos, tales como la sutura lambda del cráneo, ya que esto ayuda en forma de inyecciones en el futuro. El cerebelo se puede ver a través del cráneo con una tira delgada de tejido que se encuentra directamente al colículo caudal. La profundidad a la que se debe insertar la aguja varía ligeramente entre los distintos animales y las tensiones y se puede medir por los marcadores predeterminados en la aguja, sin embargo, por la corteza y el cerebelo nos encontramos con que una profundidad de ~ 0,5 - 1 mm de la superficie es generalmente adecuado. La profundidad de inserción de otros sitios deben ser determinados experimentalmente por el usuario final. NOTA: La aguja debe penetrar fácilmente el cráneo, y si no, no empuje demasiado duro, ya que puede lastimar al animal. Vuelva a colocar la aguja y trate de nuevo. </li><li> Inyectar la solución de virus. La inyección es empezared pulsando el botón START en la bomba o presionando un pedal de pie, según el modelo de la presión de inyección utilizada. En ausencia de un pedal de pie, se recomienda contar con un colega ayudar con pulsar el botón para reducir al mínimo los movimientos innecesarios que pueden afectar a la mano de la inyección. </li><li> Después de que el volumen seleccionado se ha inyectado, mantener la aguja en su lugar durante unos segundos y luego retire con cuidado la aguja deslizándola a cabo sin problemas. Asegúrese de sostener la cabeza del cachorro en su lugar para reducir al mínimo los movimientos extraños. Desde el equipo de inyección se limpia y esteriliza entre los experimentos con etanol y la herida es pequeña, el uso de antisépticos no es necesario. </li><li> Colocar al cachorro sobre la placa cubierta con el conjunto de la temperatura a ~ 38 ° C para que se caliente para la recuperación, normalmente, un 5-10 minutos. Durante este tiempo usted podrá seguir inyectando otros cachorros. </li><li> Después de que todos los cachorros se han recuperado (deben ser de color rosa y en movimiento) tomar una parte de la ropa de cama de su casa y frote suavemente a los cachorros de la misma. Volver a los cachorros a la madre como un grupo. </li></ol> NOTA: Es muy importante asegurarse de que los cachorros son cálidos y expuestos a la ropa de cama de su casa antes de devolverlos a la madre y su devolución como un grupo. El no hacerlo puede dar lugar a la madre hiriendo o matando a los cachorros. 4. Equipo de limpieza <ol><li> Después de la inyección se ha completado y los cachorros han sido devueltos a su madre, limpia la configuración de la inyección mediante la plena carga de la jeringa con acetona o etanol al 70%. Enjuague la solución a través de los tiempos de inyección de configuración de varios, con una solución fresca cada vez. Esto quitará cualquier solución de virus restantes y se precipita. La acetona o etanol luego se evapora. NOTA: La acetona es preferido para la limpieza, pero si utiliza la configuración de los componentes de acetona-sensibles, tales como los adhesivos de cianoacrilato, a continuación, utilizar etanol al 70% de estos pasos. </li><li> Desinfectar el área de trabajo con los residuos de lejía y deseche en un contenedor de riesgo biológico correspondiente. </li></ol> 5. Análisis <ol><li> Sacrificio de los animales a la edad deseada usando un método aprobado IACUC la eutanasia. Fijación por perfusión se recomienda para ayudar en la visualización posterior de las neuronas infectadas, en particular en los animales adultos. </li><li> Procedimientos estándar de tinción puede ser usado para amplificar la señal fluorescente. En pocas palabras, 100 micras flotante secciones vibratome se permeabilized con PBS 1% Triton X-100 y se bloquean en PBS 1% Triton X-100 en suero normal de cabra 10%. Las secciones se incuban en solución de bloqueo con anticuerpos primarios noche a 4 ° C, seguido por lavado y bloqueo adicional. Las secciones se incuban en solución de bloqueo con anticuerpos secundarios durante 2 horas a temperatura ambiente, se lavan a fondo, montados en portaobjetos y cubreobjetos con anti-fade medios de montaje. Cryosections también se puede utilizar para visualizar neuronas marcadas, sin embargo, la fluorescencia endógena podría perderse. </li></ol> 6. Los resultados representativos: Un procedimiento de inyección se produce con éxito la infección robusta de las neuronas en la región del sitio de la inyección, sin dañar el tejido observables u otros efectos dañinos sobre el animal. Como se ilustra en la Figura 1, la propagación de la infección puede ser observado en ratones Cre-periodista (ROSA26R) 12 inyectados con rAAV8-Cre en sitios anatómicos diferentes. Las inyecciones en regiones específicas, tales como la corteza y el colículo superior, por lo general generan infecciones locales con la extensión mínima de las regiones adyacentes (Fig. 1A-B). El uso de solución de alto título de virus hace que la infección de las áreas adyacentes, como el hipocampo, lo más probable (Fig. 1A). Inyección con resultados bajos títulos del virus en la solución de la infección escaso, que normalmente permanece cerca del sitio de la inyección, como se muestra en la inyección del cerebelo de rAAV8-Cre en la línea media de los ratones reportero ROSA26R (fig. 1C-D). Hemos observado la recombinación en los ratones reportero ROSA26R dentro de 2 días después de la inyección de rAAV8-Cre, lo que sugiere que la infección, la recombinación y la expresión de genes reportero todo puede ocurrir relativamente rápido. Además, se han utilizado con éxito esta técnica para estudiar los efectos de la deleción del gen en un locus no ROSA con un alelo condicional floxed, cuyos resultados serán publicados en otros lugares. El número de células infectadas debe correlacionarse con el título de la solución viral inyectada. Por ejemplo, la inyección de una mezcla de soluciones de alto título de dos rAAV8 virus expresando diferentes proteínas fluorescentes en el cerebelo infecta a muchas células de Purkinje que son diferencialmente etiquetados (Fig. 2A). Por el contrario, la inyección de una solución de bajo título de virus puede ocasionar infección escasa para ayudar en la visualización de las células individuales (Fig. 2B). Neuronas marcados con fluorescencia se puede observar directamente en el nuevo corte, tejido vivo (Fig. 2B), o pueden ser objeto de inmunotinción para mejorar las señales endógenas fluorescentes para la adquisición de la imagen más tarde por todo el campo o co-microscopía fluorescente nfocal (Fig. 2A, la figura. 3A-C). Por último, rAAV8 es capaz de infectar una gran variedad de tipos de neuronas en la corteza con el etiquetado de los procesos de fuerte multa (Fig. 3A-C). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/2823/2823fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1: tinción LacZ en el cerebro de los ratones reportero ROSA26R que fueron inyectados con rAAV8 Cre-P0 demuestra en la actividad Cre y la localización de la infección. <ol type="A"><li> Amplio campo de visión sagital del cerebro de un P14 que muestra título elevado (1x10 12 GC / ml) inyecciones en la corteza y el colículo superior. El uso de virus de alto título, es más probable que las áreas adyacentes también estarán infectados. </li><li> Corte sagital de la corteza P14 inyectados con menor título (1x10 11 GC / ml) del virus demuestra una infección local con menos difusión. </li><li> Un punto de vista de un cerebelo wholemount P28 inyecta en la línea media con título bajo (1x10 9 GC / ml) del virus muestra que la infección es escasa y por lo general se mantiene cerca del punto de inyección. </li><li> Sagital de la línea media del cerebelo en la C). Tenga en cuenta que las células de Purkinje en general, sólo están infectadas por rAAV8. </li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/2823/2823fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2: etiquetado cerebelosa por inyección con títulos altos y bajos de rAAV8 expresan proteínas fluorescentes. <ol type="A"><li> Un corte sagital de P21cerebellum infectadas con una mezcla de dos virus que expresan EGFP (verde) y DsRed (rojo). Una mezcla de alto título de virus se utilizó para infectar un gran número de células de Purkinje. </li><li> Una célula de Purkinje del cerebelo en vivo P14 de la infección viral muy baja título imágenes inmediatamente después de la disección. </li></ol><img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/2823/2823fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3: etiquetado cortical por rAAV8-DsRed. Ejemplos de la variedad de tipos de neuronas corticales en las secciones coronal de una corteza P21 que estaba infectada por rAAV8-DsRed en P0.

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<li>Tong, C., Li, P., Wu, N. L., Yan, Y., Ying, Q. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+p53+gene+knockout+rats+by+homologous+recombination+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Production of p53 gene knockout rats by homologous recombination in embryonic stem cells.</a> Nature. 467, 211-213 (2010).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

El método de inyección neonatal viral que aquí se presenta ofrece una forma sencilla y rápida para generar mosaicos en vivo para el estudio del desarrollo del cerebro postnatal. El método tiene la ventaja de los alelos floxed que están actualmente disponibles, así como aquellos que se están realizando a través de los genes de alto rendimiento focalización del proyecto 6. En comparación con el uso de la expresión transgénica de la CRE, este método proporciona una forma rápida para probar la función de...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios (opcional) </th></tr><tr><td> rAAV8-Cre,-GFP, DsRed-, </td><td> Vector Biolabs </td><td> # 7060, # 7061, la orden de encargo </td><td> http://www.vectorbiolabs.com </td></tr><tr><td> Harvard bomba 11 Plus </td><td> Harvard Apparatus </td><td> # 702208 </td><td> (No hay puerto de pedal) </td></tr><tr><td> El epitelio pigmentario de la retina de inyección Kit </td><td> Mundial de Instrumentos de Precisión </td><td> RPE-KIT </td><td> Contiene conectivo tubos, agujas de inyección (36G), y soporte de la aguja </td></tr><tr><td> NanoFil jeringa, 100μl </td><td> Mundial de Instrumentos de Precisión </td><td> NANOFIL-100 </td><td> Incluye aguja de carga reutilizables </td></tr><tr><td> D-PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14040-117 </td><td></td></tr><tr><td> GFP de anticuerpos </td><td> Aves </td><td> GFP-1020 </td><td></td></tr><tr><td> Anticuerpos DsRed </td><td> Clontech </td><td> 632496 </td><td></td></tr><tr><td> El bloque de calentamiento </td><td> VWR </td><td> 97042-610 </td><td></td></tr><tr><td> ROSA26R ratón </td><td> Jackson Laboratory </td><td> 003309 </td><td></td></tr></tbody></table>

mosaico de análisis de la función de genes en el desarrollo postnatal del cerebro del ratón mediante el uso de virus basada en la recombinación cre

Mosaic Analysis of Gene Function in Postnatal Mouse Brain Development by Using Virus-based Cre Recombination

Función normal del cerebro se basa no sólo en el desarrollo embrionario, cuando las principales vías neuronales se establecen, sino también sobre el desarrollo postnatal cuando los circuitos neuronales son maduros y refinados. Regulación deficiente en esta etapa puede conducir a trastornos neurológicos y psiquiátricos como el autismo y la esquizofrenia 1,2. Muchos genes han sido estudiados en el cerebro prenatal y se encontró crucial para muchos procesos de desarrollo 3.5. Sin embargo, su función en el cerebro postnatal se desconoce, en parte debido a su eliminación en ratones conduce a menudo a mortalidad durante el desarrollo neonatal, y en parte porque sus requerimientos en el desarrollo temprano dificulta el análisis post-natal. Para superar estos obstáculos, los alelos floxed de estos genes se están generando en los 6 ratones. Cuando se combina con alelos transgénicos que expresan la recombinasa Cre en tipos celulares específicos, la supresión condicional se puede lograr para estudiar la función génica en el cerebro postnatal. Sin embargo, este método requiere alelos adicionales y el tiempo extra (3-6 meses) para generar los ratones con genotipos apropiados, lo que limita la expansión del análisis genético a gran escala en el cerebro del ratón. Aquí se demuestra un enfoque complementario que utiliza de forma viral, expresa Cre para estudiar estos alelos floxed rápida y sistemáticamente en el desarrollo cerebral postnatal. Mediante la inyección de recombinante virus adeno-asociados (rAAVs) 7,8 codificación Cre en el cerebro neonatal, que son capaces de eliminar el gen de interés en las diferentes regiones del cerebro. Al controlar el título viral y coexpressing un marcador de la proteína fluorescente, que al mismo tiempo se puede lograr la inactivación de genes mosaico y etiquetado neuronal escaso. Este método evita la necesidad de muchos genes en el desarrollo temprano, y nos permite estudiar la función de las células autónomas en muchos procesos críticos en el desarrollo cerebral postnatal, incluyendo el crecimiento axonal y dendrítico, ramas, y los azulejos, así como la formación de sinapsis y refinamiento. Este método ha sido utilizado con éxito en nuestro propio laboratorio (resultados no publicados) y otros 8,9, y se puede ampliar a otros virus, como lentivirus 9, así como a la expresión de shRNA o dominante proteínas activas 10. Por otra parte, mediante la combinación de esta técnica con la electrofisiología, así como de reciente desarrollo de herramientas de imagen óptica 11, este método ofrece una nueva estrategia para estudiar cómo las vías genéticas influyen en el desarrollo de circuitos neuronales y la función en ratones y ratas.

Un<em&gt; In vivo</emMétodo&gt; para poner a prueba la función del gen en el cerebro postnatal se describe. AAV recombinantes que expresan Cre y / o una proteína fluorescente se inyectan en el cerebro de ratones recién nacidos. Inactivación del gen de mosaico y el etiquetado neuronales dispersos se logra, permitiendo un análisis rápido de la función de genes en los procesos críticos para el desarrollo de circuitos neuronales.

Mosaico de Análisis de la función de genes en el desarrollo postnatal del cerebro del ratón mediante el uso de virus basada en la recombinación Cre

El funcionamiento cerebral normal depende no solo del desarrollo embrionario, momento en el que se establecen las principales vías neuronales, sino también del desarrollo posnatal, cuando...

El objetivo general de este procedimiento es manipular la función génica durante el período posnatal del desarrollo cerebral. Esto se logra primero seleccionando y preparando los virus adecuados, cargándolos en la jeringa y preparando el equipo de inyección. Luego, se inyecta el virus en los cerebros de crías recién nacidas de ratón, y el paso final consiste en sacrificar a los animales e imaginar las regiones inyectadas.Finalmente, se pueden obtener resultados que muestran una marcación diferencial de células control y células knockout mediante microscopía de inmunofluorescencia. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurociencia, como cómo se regula genéticamente el período de desarrollo postnatal. Para la inyección, se puede utilizar una solución comercial de virus adenoasociado con un título completo, típicamente de 10 a la 12.ª copia genómica por mililitro, para manipular un gran número de células.Si se desea una etiquetado escaso o diluido, comience con una dilución de uno a diez. Después de descongelar el virus en hielo, transfiera inmediatamente el volumen de pre-dilución a un tubo estéril de PCR de 250 microlitros. Mantenga la dilución en hielo ahora.Prepare la bomba de inyección seleccionando una jeringa adecuada y conéctela a una aguja de carga. A continuación, aspire suavemente la solución vírica hasta que se observe una burbuja de aire muy pequeña en la jeringa; se puede utilizar un colorante inerte de carga para facilitar este paso. Ahora sujete la jeringa a la bomba con un sujetador.Luego, conecte suavemente el tubo de conexión entre la jeringa y el portaagujas. Asegúrese de que la aguja de inyección esté en contacto directo con el tubo de conexión dentro del portaagujas. Ahora, pase lentamente la solución a través del tubo de conexión hasta que una pequeña gota de solución sea visible en la punta de la aguja.Asegure cuidadosamente el émbolo junto al bloque empujador con un soporte en la bomba. Establezca la velocidad de inyección en ocho microlitros por minuto y ajuste el volumen de inyección entre uno y dos microlitros. Luego, regule el diámetro de la jeringa en la configuración de la bomba para que coincida con el diámetro de la jeringa que está utilizando.Por último, para proteger a las crías durante la fase de recuperación, ajuste la placa calefactora a 38 grados Celsius y cúbrala con una toalla de papel. Siguiendo un protocolo aprobado por el IACUC, prepare crías de ratón P cero o P uno para la inyección sometiéndolas a anestesia por frío. Humedezca algunas toallas de papel con agua y colóquelas sobre hielo.Luego, coloque cuatro o cinco crías sobre la toalla de papel bien separadas. Doble suavemente la toalla de papel sobre las crías, coloque una pequeña cantidad de hielo picado encima de la toalla y incube las crías durante aproximadamente cinco minutos. Las crías pueden mantenerse de forma segura sobre hielo hasta 15 minutos y aún así recuperarse adecuadamente.Ahora coloque un cachorro anestesiado sobre un bloque de sujeción para obtener el mejor acceso al sitio de inyección. Por ejemplo, la corteza se accede más fácilmente colocando al animal tumbado boca abajo. El cachorro puede fijarse en su lugar usando una tirita, estabilice manualmente la cabeza del cachorro y tense la piel para evitar que se mueva.Luego, siga los puntos de referencia anatómicos del cráneo, como la sutura lambda, y seleccione con la otra mano un punto de inyección reproducible; inserte suavemente la aguja a través del cráneo. No ejerza presión si la aguja no penetra fácilmente el cráneo. En cambio, reposicione la aguja e intente nuevamente con suavidad.La profundidad de inyección varía ligeramente entre animales y cepas individuales para la corteza; generalmente, funciona una profundidad de medio a un milímetro. A continuación, inyecte la solución viral haciendo que un colega active la bomba para minimizar los movimientos de la mano. Idealmente, se podría usar un pedal con el pie para encender la bomba después de la inyección.Mantenga la aguja en su lugar durante unos segundos, luego, manteniendo la cabeza del cachorro quieta, retire suavemente la aguja. Ahora, permita que el cachorro se recupere durante cinco a 10 minutos sobre la placa caliente cubierta.Durante este tiempo, continúe inyectando a las demás crías. Cuando todas las crías hayan recuperado su color rosado y estén moviéndose, frótelas suavemente con una porción de la cama de su hogar. Solo entonces pueden devolverse a su madre.De lo contrario, podrían ser tratados como crías desconocidas, las cuales la madre muy probablemente mataría después de que las crías hayan sido devueltas a ella. Limpie el equipo de inyección cargando completamente la jeringa con acetona o etanol al 70 %. Si se utilizan componentes sensibles a la acetona, como sano, acurate o adhesivos, pase la solución a través del equipo de inyección varias veces usando solución fresca cada vez.Esto eliminará cualquier solución de virus remanente y los precipitados, y los disolventes se evaporarán. Después de lavar el montaje, desinfecte el área de trabajo con lejía para dejarla lista para el próximo experimentador. Mentor. La técnica exitosa produce una infección neuronal robusta en el sitio de inyección.Las inyecciones en regiones específicas, como la corteza y el colículo superior, suelen generar infecciones locales con mínima diseminación a regiones adyacentes. El uso de una solución vírica de alto título hace más probable la infección de áreas adyacentes, como el hipocampo, en comparación con la inyección con una solución vírica de bajo título. Los resultados muestran una infección dispersa, típicamente cerca del sitio de inyección; por ejemplo, en la inyección cerebelosa en la línea media, el número de células infectadas debería correlacionarse con el título de la solución vírica inyectada.Por ejemplo, inyectar una mezcla de soluciones de alto título de dos virus AAV8 que expresan proteínas fluorescentes diferentes en el cerebelo infecta muchas células kinji que están marcadas diferencialmente. Por el contrario, inyectar una solución viral de bajo título puede resultar en una infección dispersa que facilita la visualización de células individuales. Las neuronas marcadas con fluorescencia se pueden observar directamente en tejido fresco recién cortado, o se pueden someter a inmunotinción.Esto potencia las señales fluorescentes endógenas para la adquisición posterior de imágenes mediante microscopía fluorescente de campo amplio o confocal. Por último, el RAAV ocho es capaz de infectar una variedad de tipos de neuronas en la corteza con una marcación intensa de los procesos finos. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en aproximadamente 30 minutos si se lleva a cabo adecuadamente.

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Un método de rastreo de neuronas conectadas sinápticamente se describe. Usamos especificidad TVA de una célula de aguas arriba para probar si una población celular de interés recibe la entrada sináptica de tipos de células genéticamente definidos.

Trazado de Circuitos Viral genéticamente definidos Neural

Los vectores virales permiten la manipulación dirigida de genes. Se demuestra un método para la expresión génica condicional o ablación en la médula espinal de ratón, usando inyección estereotáxica de un vector viral en el asta dorsal, un sitio prominente de contacto sináptico entre las vías aferentes somatosensoriales y las neuronas del sistema nervioso central.

Inyección estereotáxica de un vector viral para la manipulación genética condicional en la médula espinal de ratón

Aquí demostramos una técnica para la transducción neuronal generalizada mediante inyección intraventricular de virus adenoasociados en el cerebro de ratón neonatal.  Este método proporciona una manera rápida y fácil de lograr la expresión de por vida de los transgenes administrados viralmente.

Inyección Viral Intracerebroventricular de Neonatología del ratón Cerebro de transducción neuronal persistente y generalizada

Aprovechando una estrategia genética binaria, proporcionamos un protocolo detallado para el rastreo de circuitos neuronales en ratones que expresan trazadores transsinápticos complementarios después de la recombinación mediada por Cre. Debido a que la producción de trazadores específicos de células está codificada genéticamente, nuestro enfoque experimental es adecuado para estudiar la formación y maduración de circuitos neuronales durante el desarrollo del cerebro embrionario murino a una...

Condicional transsynaptic genética Seguimiento en el cerebro de embriones de ratón

Aquí describimos un procedimiento basado en el uso de partículas lentivirales para la modificación genética a largo plazo de células madre neurales y/o sus células ependimarias adyacentes en el nicho neurogénico ventricular-subventricular adulto que permite el análisis por separado de los efectos autónomos y no autónomos, dependientes del nicho, sobre las células madre neurales.

Estable y eficiente modificación genética de células en el ratón adulto V-SVZ para el análisis de neural de células madre Autónoma y los efectos no autónomos

Este protocolo proporciona instrucciones para la observación directa de neuronas corticales que migran radialmente. La electroporación in utero , el cultivo de corte organotípico y la formación de imágenes confocales en intervalos de tiempo se combinan para estudiar directa y dinámicamente los efectos de la sobreexpresión o regulación negativa de genes de interés en las neuronas que migran y para analizar su diferenciación durante el desarrollo.

Time-lapse Imágenes confocales de las neuronas migratorias en la cultura organotípica en rebanadas de cerebro de ratón embrionario<em&gt; En Utero</em&gt; Electroporación

Funciones célula Autónoma de genes en el cerebro pueden ser estudiadas mediante la inducción de la pérdida o ganan de función en poblaciones dispersas de las células. Aquí, describimos en el útero la electroporación para entregar recombinase de Cre en poblaciones escasas de desarrollo de las neuronas corticales con genes floxed a causar la pérdida de función en vivo.

Inducción de la recombinación del Cre-lox en la corteza Cerebral de ratón a través de electroporación en el útero

Se describe un protocolo de cirugía estereotáctica con un dispositivo casero hecho de cabeza fija de reactivos microinjecting en el cuerpo estriado del cerebro de ratón neonatal. Esta técnica permite la manipulación genética en las células neuronales de regiones específicas del cerebro de ratón neonatal.

Cirugía estereotáctica para manipulación genética en las células estriatales de cerebro de ratón Neonatal

Se presenta un protocolo para realizar el rastreo de linajes y el análisis genético funcional de genes candidatos a un solo nivel de células utilizando el análisis de mosaico con marcadores dobles (MADM). El análisis clonal de MADM proporciona un marco cuantitativo para medir el comportamiento proliferativo, la producción celular y la relación de linaje de los progenitores individuales y sus células hijas.

Seguimiento de linaje y análisis clonal en el desarrollo de la corteza cerebral mediante el análisis de mosaico con marcadores dobles (MADM)

El papel de los genes recientemente descubiertos asociados a la enfermedad en la patogénesis de los trastornos neuropsiquiátricos sigue siendo oscuro. Una técnica bilateral modificada de electroporación de útero permite la transferencia de genes en grandes poblaciones de neuronas y el examen de los efectos causales de los cambios de expresión génica en el comportamiento social.

Un gasoducto que utiliza la electroporación bilateral en Utero para interrogar influencias genéticas en el comportamiento de los roedores

Durante el desarrollo de la corteza cerebral, las neuronas y las células gliales se originan en la zona ventricular que recubre el ventrículo y migran hacia la superficie cerebral. Muchos genes están involucrados en este proceso. Este protocolo introduce la técnica para la obtención de imágenes en time-lapse de las neuronas migratorias y los progenitores gliales.

Imágenes de lapso de tiempo de neuronas migratorias y progenitores gliales en cortes de cerebro de ratón embrionario

Aprende a manipular la función génica en el desarrollo cerebral postnatal de ratones mediante virus AAV recombinantes. Este método permite el etiquetado neuronal y el análisis de circuitos neuronales.

Mosaico de Análisis de la función de genes en el desarrollo postnatal del cerebro del ratón mediante el uso de virus basada en la recombinación Cre (Video) | JoVE Journal

Mosaico de Análisis de la función de genes en el desarrollo postnatal del cerebro del ratón mediante el uso de virus basada en la recombinación Cre

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