Mosaico de Análisis de la función de genes en el desarrollo postnatal del cerebro del ratón mediante el uso de virus basada en la recombinación Cre

El objetivo general de este procedimiento es manipular la función de los genes durante el período postnatal del desarrollo cerebral. Esto se logra seleccionando y preparando primero los virus apropiados, cargándolos en la jeringa y preparando el equipo de inyección. Luego, el virus se inyecta en el cerebro de las crías de ratón recién nacidas, y el paso final es sacrificar a los animales y obtener imágenes de las regiones inyectadas.

En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran el marcaje diferencial de las células control y knockout a través de la microscopía de inmunofluorescencia. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurociencia, como cómo se regula genéticamente el período de desarrollo postnatal. Para la inyección, se puede usar una solución de virus adenoasociado disponible comercialmente a título completo, generalmente de 10 a 12, copias del genoma por mililitro para manipular un gran número de células.

Si se desea escaso o etiquetado, comience con una dilución de uno a 10. Después de descongelar el virus en hielo, transfiera inmediatamente el volumen de predilución a un tubo de PCR estéril de 250 microlitros. Mantenga la dilución en hielo. Ahora.

Prepare la bomba de inyección seleccionando una jeringa adecuada y conectándola a una aguja de carga. A continuación, extraiga suavemente la solución de virus hasta que se vea una burbuja de aire muy pequeña en la jeringa y se puede usar un tinte de carga inerte para facilitar este paso. Ahora asegure la jeringa a la bomba con un retenedor.

A continuación, conecte suavemente el tubo conectivo entre la jeringa y el soporte de la aguja. Asegúrese de que la aguja de inyección esté en contacto directo con el tubo conectivo dentro del soporte de la aguja. Ahora, mueva lentamente la solución a través del tubo conectivo hasta que se vea una pequeña gota de solución en la punta de la aguja.

Asegure con cuidado el émbolo junto al bloque de empuje con un soporte en la bomba. Ajuste la velocidad de inyección a ocho microlitros por minuto y ajuste el volumen de inyección entre uno y dos microlitros. A continuación, ajuste el ajuste del diámetro de la jeringa de la bomba para que coincida con el diámetro de la jeringa que está utilizando.

Por último, para proteger a los cachorros durante la fase de recuperación, ajuste la placa calefactora a 38 grados centígrados y cúbrala con una toalla de papel. Usando un protocolo aprobado por la IACUC, prepare a los cachorros de ratón P zero o P one para la inyección sometiéndolos a anestesia fría. Humedece unas toallas de papel con agua y colócalas sobre hielo.

Luego coloque cuatro o cinco cachorros en la toalla de papel bien separados. Dobla las toallas de papel sobre los cachorros, coloca suavemente una pequeña cantidad de hielo picado encima de las toallas de papel e incuba a los cachorros durante unos cinco minutos. Los cachorros se pueden mantener de forma segura en el hielo hasta por 15 minutos y aún así tener una buena recuperación.

Ahora coloque un cachorro anestesiado en un bloque de montaje para un mejor acceso al sitio de la inyección. La corteza terrestre, por ejemplo, es más fácil de acceder colocando al animal boca abajo. El cachorro puede asegurarse en su lugar con una curita, estabilizar manualmente la cabeza del cachorro y tirar de la piel para evitar que se mueva.

A continuación, recorra los puntos de referencia anatómicos del cráneo, como la sutura lambda, y seleccione un punto de inyección reproducible con la otra mano, inserte suavemente la aguja a través del cráneo. No empuje con fuerza si la aguja no penetra fácilmente en el cráneo. En su lugar, vuelva a colocar la aguja y vuelva a intentarlo suavemente.

La profundidad de inyección varía ligeramente entre los animales individuales y las cepas para la corteza, una profundidad de medio a un milímetro generalmente funciona. Ahora, inyecte la solución antivirus, haciendo que un colega active la bomba para minimizar los movimientos de la mano. Idealmente, se podría usar un pedal para arrancar la bomba después de la inyección.

Mantenga la aguja en su lugar durante unos segundos, luego mantenga la cabeza del cachorro quieta suavemente. Desliza la aguja hacia afuera. Ahora, permita que el cachorro se recupere durante cinco a 10 minutos en la placa caliente tapada.

Durante este tiempo, continúe inyectando a otros cachorros. Cuando todos los cachorros hayan recuperado su color rosado y se muevan, frótelos suavemente con una parte de la ropa de cama de su casa. Solo entonces pueden ser devueltos a su madre.

De lo contrario, podrían ser tratados como cachorros desconocidos, que la madre probablemente mataría después de que los cachorros hayan sido devueltos a su madre. Limpie la configuración de inyección cargando completamente la jeringa con acetona o etanol al 70%. Si se utilizan componentes sensibles a la acetona, como sano, acurato, adhesivos, enjuague la solución a través de la configuración de inyección varias veces con una solución nueva cada vez.

Esto eliminará cualquier solución viral restante y los disolventes precipitados se evaporarán. Después de enjuagar la instalación, desinfecta el área de trabajo de la lejía para dejarla lista para el próximo experimentador. Mentor. Una técnica exitosa produce una infección neuronal robusta en el lugar de la inyección.

Las inyecciones en regiones específicas, como la corteza y el colículo superior, suelen generar infecciones locales con una propagación mínima a las regiones adyacentes. El uso de una solución viral de alto título hace que la infección de áreas adyacentes como el hipocampo, sea más probable la inyección con una solución de virus de título bajo. Da lugar a una infección dispersa, normalmente cerca del lugar de la inyección, como la inyección cerebelosa en la línea media, el número de células infectadas debe correlacionarse con un título de la solución viral inyectada.

Por ejemplo, la inyección de una mezcla de soluciones de alto título de dos virus R AAV ocho que expresan diferentes proteínas fluorescentes en el cerebelo, infecta muchas células kinji que están marcadas diferencialmente. Por el contrario, la inyección de una solución viral de título bajo puede resultar en una infección escasa para ayudar a visualizar células individuales. Las neuronas marcadas con fluorescencia se pueden observar directamente en tejido vivo recién cortado, o se pueden someter a inmunotinción.

Esto mejora las señales fluorescentes endógenas para la posterior adquisición de imágenes mediante microscopía fluorescente confocal o de campo amplio. Por último, RAAV eight es capaz de infectar una variedad de tipos de neuronas en la corteza con un fuerte etiquetado de procesos finos Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en aproximadamente 30 minutos si se realiza correctamente.