Aislamiento funcionalizado de células diana basadas en alambres: una técnica ex vivo para aislar células cancerosas de sangre periférica enriquecida

Las moléculas de adhesión de células epiteliales, o EpCAM, son glicoproteínas transmembrana de superficie sobreexpresadas en células epiteliales de rápida proliferación en cánceres de próstata. Para aislar las células que expresan EpCAM, comience con un alambre de grado médico con una punta recubierta de oro funcionalizada. Capas de funcionalización de un gel polimérico que contiene anticuerpos específicos de EpCAM unidos covalentemente.

Sumerja el cable en una suspensión de sangre periférica que contenga células cancerosas marcadas con fluorescencia. Asegúrese de que la parte funcionalizada permanezca sumergida en la suspensión de sangre. Las EpCAM en las células cancerosas reconocen y se unen a sus anticuerpos específicos funcionalizados en el cable.

Lave con un tampón para eliminar las células no unidas de la superficie del alambre. Doble el cable y móntelo en un portaobjetos de vidrio que contenga tampón, con la parte funcionalizada sumergida en el tampón. Use un microscopio de fluorescencia para verificar la fluorescencia brillante del citoplasma y los núcleos celulares y confirmar la presencia de células capturadas en el cable.

Trate el alambre con un tampón de liberación. Las enzimas proteolíticas en el tampón escinden el gel polimérico, liberando los complejos anticuerpo-célula cancerosa en el tampón. Centrifugar el conjunto de alambre para recolectar los complejos anticuerpo-célula liberados en el gránulo. Retire el alambre y el sobrenadante que contiene enzimas. Vuelva a suspender el gránulo que contiene células objetivo en un medio adecuado.

En 5 mililitros de sangre periférica, agregue alrededor de 500 a 500,000 células y luego mezcle invirtiendo el tubo. Después de retirar el cable del compartimento de almacenamiento, retire la tapa de goma que sujeta el cable y lave el cable en 1x solución salina tamponada con fosfato y móntelo en la tapa del tubo. Luego, incube el tubo en un mezclador de rodillos inclinados a 5 rotaciones por minuto durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de la incubación, enjuague el alambre en una solución salina tamponada con fosfato 1x tres veces. Luego, guarde el cable en un tubo de 15 mililitros que contenga 1x solución salina tamponada con fosfato en la oscuridad.

Dibuje un área rectangular en un portaobjetos de vidrio con un bolígrafo de grasa y agregue 500 microlitros de solución salina tamponada con fosfato. Para sumergir la parte funcional del alambre en 1x solución salina tamponada con fosfato, doble la parte no funcional del alambre y colóquela en el portaobjetos de vidrio. Para contar el número de celdas capturadas, inspeccione visualmente ambos lados del cable. Después de inspeccionar, transfiera el cable nuevamente en el tubo de 15 mililitros con solución salina tamponada con fosfato 1x y manténgalo en la oscuridad.

En 1 mililitro de solución salina tamponada con fosfato, disuelva 4 miligramos del componente tampón de liberación. Luego, filtre la solución a través de un filtro estéril de 0,2 micrómetros para obtener el tampón listo para usar. A continuación, caliente el tampón de liberación a 37 grados centígrados durante 5 minutos. Una vez calentado, transfiera 1,6 mililitros de tampón de liberación para llenar completamente un tubo de reacción de 1,5 mililitros. A continuación, incube la parte funcional del alambre en el tampón de liberación a 37 grados centígrados en un baño de agua durante 20 minutos.

Después de la incubación, coloque el alambre en un agitador a 500 rotaciones por minuto durante 15 minutos. Luego, centrifuga el alambre a 300 x g durante 10 minutos. Una vez finalizada la centrifugación, desplace el cable del tubo, cierre la tapa y centrifugue el tubo nuevamente a 300 x g durante 10 minutos.