Dirigido a agregados de alfa sinucleína en fibras nerviosas periféricas cutáneas por el ensayo de inmunofluorescencia de flotación libre

El diagnóstico de la enfermedad de Parkinson todavía se basa en signos clínicos de afectación motora que aparecen más adelante en el curso de la enfermedad, cuando la mayoría de las neuronas de la sustancia nigra ya están perdidas. Este protocolo permite que el análisis de los nervios dérmicos mediante biopsia de piel, que representa un posible nuevo biomarcador de la enfermedad, se utilice en ensayos clínicos. La biopsia de piel es un procedimiento fácilmente evaluable y no invasivo que permite el análisis del tejido nervioso periférico que es propenso a la patología.

La detección de agregados de alfa sinucleína mediante biopsia de piel se puede utilizar con fines de diagnóstico, posiblemente en fases tempranas, cuando la cura potencial es más eficaz. Las biopsias cutáneas de seguimiento en el mismo paciente permiten un análisis de tiempo y curso especial de la propagación agregada de sinucleína alfa en el sistema nervioso cutáneo humano. Estos pueden arrojar luz sobre la patogénesis de la enfermedad.

Para comenzar este procedimiento, prepare una nueva solución fijativa plP como se describe en la Tabla Uno del protocolo de texto. Inmediatamente después de recoger la biopsia de piel, sumerja en un tubo que contenga 10 mililitros de la solución fijadora. Incubar durante la noche a cuatro grados centígrados.

Al día siguiente, en una campana de humos, retire suavemente el fijador PLP. En el mismo tubo, lave la biopsia tres veces durante cinco minutos cada una, utilizando cinco mililitros de solución de Sorensen molar 0.1 para cada lavado. Deseche la solución de Sorensen y añada cinco mililitros de solución crioprotectora.

Incubar durante la noche a cuatro grados centígrados. Al día siguiente, guarde la biopsia a cuatro grados centígrados si el corte con un criotomo se va a realizar dentro de una semana. Primero, pon el criotomo a menos 20 grados centígrados.

Toma una lloron y llénala con un medio de crio-embedding. Usando pinzas, sumerja la biopsia en el medio crio-embedding, con el eje longitudinal paralelo a la parte inferior de la crioomold. Enganche la muestra con nitrógeno líquido, para obtener un cubo sólido de medio crio-embedding que contiene la biopsia en la orientación correcta.

Ponga la muestra en el criostato y espere 30 minutos para permitir que la biopsia se aclimate. A continuación, fije la muestra en el criostato y corte en secciones de 50 micrómetros. Con un cepillo pequeño, transfiera las secciones criosquetas a una placa de 96 pozos que contenga 200 microlitros de solución anticongelante en cada pozo.

Después de esto, guarde la placa a menos 20 grados centígrados. Para empezar, llene algunos de los pozos de una placa fresca de 96 pozos con 100 microlitros de solución de lavado. Transfiera las secciones a analizar desde la placa de almacenamiento a la que contiene la solución de lavado.

Dejar las secciones en la solución de lavado durante 10 minutos a temperatura ambiente. A continuación, transfiera cada sección a un pozo vacío que contenga la misma solución de lavado y repita el lavado. A continuación, agregue la solución de lavado a las secciones y transfiéralas a nuevos pozos que contengan 100 microlitros de solución de bloqueo.

Incubar a temperatura ambiente durante al menos 90 minutos, y un máximo de cuatro horas. Diluir los anticuerpos primarios, anti-PGP9.5 y anti-5G4, en la solución de trabajo. Transfiera las secciones a nuevos pozos que contengan 100 microlitros de la solución de trabajo de los anticuerpos primarios, e incubar durante la noche a temperatura ambiente.

Al día siguiente, lave las secciones en pozos que contengan solución de lavado como se describió anteriormente. Diluir los anticuerpos secundarios, Cabra anti-Conejo para detectar PGP9.5, y Cabra anti-Ratón para detectar 5G4, en la solución de trabajo. Transfiera las secciones lavadas a nuevos pozos que contengan 100 microlitros de la solución de trabajo de los anticuerpos secundarios.

Cubra la placa con papel de aluminio para evitar el blanqueo de fluoróforos conjugados con anticuerpos secundarios, e incubar a temperatura ambiente durante 90 minutos. Después de esto, lave las secciones dos veces en la solución de lavado como se describió anteriormente. Transfiera las secciones lavadas a nuevos pozos que contengan 100 microlitros de DAPI durante cinco minutos a temperatura ambiente.

Lave las secciones dos veces en la solución de lavado como se describió anteriormente. A continuación, monte las secciones en una diapositiva en la posición correcta, evitando el mal deslizamiento. Agregue unas gotas de medio de montaje a la corredera y cubra la sección con un resbalón de cubierta.

Deje que los portaobjetos se sequen durante la noche. Al día siguiente, guarde los portaobjetos en una caja apropiada a cuatro grados centígrados, asegurándose de evitar la exposición a la luz. Con un microscopio de fluorescencia invertido o un microscopio confocal, vea las secciones.

Adquiera las imágenes mediante una cámara conectada al microscopio. A continuación, utilice un microscopio de fluorescencia o un microscopio confocal para analizar señales positivas en secciones en términos de distribución espacial e intensidad de la señal como se describe en el protocolo de texto. Siguiendo el método descrito, los agregados de alfa sinucleina etiquetados con anticuerpos 5G4 se detectan en las estructuras autonómicas de los pacientes con DP de fascículos del nervio dérmico.

La morfología de los depósitos de alfa sinucleína aparece como una señal punteada a lo largo de los axones de los nervios dérmicos. El uso representativo de este protocolo en 19 pacientes con DP y 17 controles en biopsias de piel en tres sitios anatómicos muestra que 5G4 tiene una sensibilidad del 81% y una especificidad del 86% en comparación con controles saludables. La sinucleína alfa fosforilada tiene una sensibilidad del 56% y una especificidad de 100%5G4 y los depósitos fosforilados alfa sinucleína positivos se encuentran principalmente alrededor de las glándulas sudoríparas, pero también se encuentran en el pili arrector muscular, vasos pequeños, y el plexo subepidérmico y dérmico, pero nunca en las fibras nerviosas intraepidérmicas.

Generalmente, dentro de las glándulas sudoríparas lumen, es posible observar una señal no específica que podría ser malinterpretada como 5G4 o positividad de la sinucleína alfa fosforilada. Este tipo de señal es punteada, esférica, y lo más probable es que se deba al material autofluorescente intraluminal como se demuestra en controles técnicos sin anticuerpos primarios y secundarios. La colocación con PGP9.5 que marca las fibras nerviosas, que morfológicamente son filamentosas y alargadas, ayuda a identificar la señal correcta.

Por lo tanto, la especificidad de la señal 5G4 se incrementa en gran medida por una doble inmunosumanidad con un marcador axonal. Una fijación precisa de la biopsia es necesaria para producir una tinción inmunofluorescente de buena calidad y para la interpretación confiable de las señales fluorescentes. Si el fijador no está preparado correctamente, o si se ha producido una sobre-fijación, el resultado será una alta autofluorescencia que enmascarará la señal de las fibras nerviosas que cruzan la unión dérmica-epidérmica, o invadirá las estructuras dérmicas principales.

El paso más crítico de este procedimiento es la fijación del tejido. Preste atención al pH de la solución fijadora PLP, y el momento de la incubación, para evitar la autofluorescencia y una señal específica.