Cribado de muerte celular mediante tinción DAPI: un método para el cribado rápido de la muerte celular clonogénica inducida por IR en líneas celulares cancerosas

La exposición a radiaciones ionizantes como los rayos X puede causar daños en el ADN y, finalmente, provocar la muerte celular. Para detectar el efecto de las radiaciones ionizantes en los perfiles de muerte celular, comience tomando una placa de cultivo que contenga células cancerosas adherentes colocadas sobre la superficie de un cubreobjetos.

Irradie la placa de cultivo con rayos X durante el tiempo deseado. Este tratamiento causa daño en el ADN dentro de las células. A continuación, aspire los medios gastados de la placa de cultivo y agregue un fijador adecuado. Esta solución impregna las células y bloquea los componentes celulares en su lugar durante los pasos de tinción posteriores.

Deseche la solución fijadora. Retire el cubreobjetos que contiene células tratadas con rayos X de la placa de cultivo. Voltee el cubreobjetos y colóquelo sobre la superficie de un portaobjetos de vidrio que lleve una gota de tinción DAPI sobre él, de modo que las células estén en contacto directo con DAPI.

Las moléculas DAPI ingresan a los núcleos y se unen a los sitios ricos en A-T del ADN. Ahora, visualice las células bajo un microscopio de fluorescencia. Los núcleos aparecen azules y exhiben morfologías distintas.

Las células que muestran núcleos condensados y fragmentados son indicativas de apoptosis, muerte celular programada. Otros que muestran núcleos de múltiples lóbulos representan que las células están experimentando una catástrofe mitótica. Aquellos con núcleos aplanados que muestran múltiples puntos brillantes sugieren que las células experimentan senescencia.

Tome las células de la incubadora y aspire el medio de cultivo de la placa de cultivo. Corte la punta de una punta de micropipeta de 1,000 microlitros a unos 5 milímetros del extremo con unas tijeras y utilícela para agregar 1 mililitro de solución de fijación a la placa de cultivo.

Aplique la solución de fijación a lo largo de las paredes de la placa de cultivo para minimizar el daño a las células. Luego, transfiera esta placa de cultivo a una placa de cultivo cuadrada y agítela suavemente para distribuir uniformemente la solución de fijación sobre el cubreobjetos. Después de eso, incube el plato durante 10 minutos a temperatura ambiente.

Aspira la solución de fijación del plato. Ahora, agregue 2 mililitros de PBS a lo largo de las paredes del plato y luego aspire el PBS. Para prepararse para la tinción DAPI, agregue 5 microlitros de reactivo de tinción DAPI en un portaobjetos de vidrio. Luego, retire el cubreobjetos del plato con un bisturí y escurra el exceso de PBS en el cubreobjetos tocando el borde del cubreobjetos con una toalla de papel.

Ahora, monte el cubreobjetos boca abajo sobre la gota de reactivo de tinción DAPI en el portaobjetos de vidrio para que las células queden expuestas al reactivo de tinción DAPI. Finalmente, examine las células teñidas bajo un microscopio de fluorescencia equipado con un filtro DAPI.