Preparación de líneas celulares de Derribo condicional de la expresión génica y la medición de los efectos desmontables en la muerte celular inducida por E4orf4

El objetivo general del siguiente experimento es observar el efecto de la caída de ACF uno o SNF dos H sobre la muerte celular inducida por E, cuatro o cuatro. Esto se logra mediante la generación de líneas celulares en las que la expresión de ARN ACF uno o SNF dos H se activa condicionalmente mediante la adición de doxiciclina, lo que resulta en niveles reducidos de la proteína ACF uno o SNF dos H como segundo paso. Las células de las líneas celulares que se han obtenido se tratan con doxiciclina para reducir la expresión de ACF uno o SNF dos H o se dejan sin tratar.

A continuación, se expresa E, cuatro o cuatro en las celdas con o sin S-H-R-N-A resistente a ACF one o SNF dos H.In investigar el efecto de ACF uno o SNF dos H sobre E, se obtienen cuatro o cuatro resultados de muerte celular inducida que muestran el impacto de los niveles de ACF uno o SNF, dos H sobre E, cuatro o cuatro en la toxicidad de E, cuatro o cuatro a partir del recuento de nucleo con morfología apoptótica mediante el ensayo JY. La principal ventaja de esta técnica frente a otros métodos como la transfección transitoria de RNAs, es que todas las células expresan el S-H-R-N-A y el porcentaje de células que se coexpresan junto con el plásmido tradicional es mayor. Este método proporciona información sobre los mecanismos subyacentes a la muerte celular inducida por 4 0 4, pero también se puede aplicar al estudio de otras proteínas próticas.

Además de Ana Lafe, una investigadora de mi laboratorio estará demostrando partes de este procedimiento: Para comenzar el procedimiento de generación de líneas celulares inducibles placa T-Rex 2 9 3 células a una densidad de alrededor de cinco veces 10 a las seis células por placa de 10 centímetros en ocho mililitros de DMEM que contiene suero sin tetraciclina y con cinco microgramos de mililitro de blaster a un lado en incubar las placas durante la noche a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono al día siguiente. Reemplace el medio con ocho mililitros de medio fresco antes de la transfección. El plásmido para la transfección es el plásmido P superior neo plus GFP que codifica ACF uno o SNF dos H-S-H-R-N-A, impulsado por un promotor H one inducible por tetraciclina, así como el gen de resistencia a neomicina fusionado con GFP e impulsado por un promotor PGK constitutivo.

Agregue 10 microgramos de ADN plasmídico a 500 microlitros de cloruro de sodio de 150 milimolares y vórtice. A continuación, añada el reactivo jet PY a dos microlitros por microgramo de ADN a otro tubo con 500 microlitros de cloruro de sodio de 150 milimolares y vórtice. Agregue la solución de pastel de chorro al ADN y mezcle bien mediante vórtice.

Incuba a temperatura ambiente durante 15 minutos. Después de 15 minutos, pipetee suavemente los complejos de ADN en las placas de 10 centímetros que contienen entre un 70 y un 80% de confluencia. T-Rex 2 9 3 células una mezcla al día siguiente.

Reemplace el medio con un medio selectivo en este ejemplo DMEM como antes, que contiene 500 microgramos por mililitro de G 4 18. Durante las próximas dos semanas, monitoree las células. Reemplace el medio selectivo con un medio fresco similar cada tres o cuatro días hasta que aparezcan las colonias.

Identifique las colonias a simple vista y marque su ubicación en la parte inferior del plato con un marcador de color. Verifica bajo el microscopio que las colonias estén bien separadas. Las colonias se pueden aislar una vez que son lo suficientemente grandes como para ser visualizadas sin un microscopio.

Para el éxito de este procedimiento, es importante elegir colonias bien separadas durante el aislamiento de la colonia. En una campana estéril, aspire el medio de la placa. Enjuague suavemente con PBS y aspire bien todo el líquido restante.

Agregue tres microlitros de 0.25%trips en EDTA a una colonia en la placa acariciando los viajes repetidamente hasta que las células se desprendan de la placa. Transfiera las células a un medio selectivo en un pocillo en una placa de 24 pocillos. Repita esto para varias otras colonias en el plato.

Haga crecer las células a 37 grados centígrados, 5% de dióxido de carbono hasta que llenen el pozo. Luego, divida las células de cada colonia original en tres pocillos, cada uno en una placa separada de 12 pocillos, e incube durante la noche del día siguiente. Reemplace el medio en un plato con un medio que contenga un microgramo por mililitro de doxiciclina de una solución madre preparada en agua bidestilada.

Reemplace el medio en una placa de control con medio sin doxiciclina. Incubar las células a 37 grados centígrados, 5% de dióxido de carbono durante 72 horas. A continuación, se recolectan células de un pozo tratado y de un pozo no tratado para el análisis de Western blot con el fin de determinar la eficiencia de ACF uno o SNF dos H derribados, aquí se muestra un resultado representativo.

Esta transferencia se tiñó con anticuerpos contra SNF dos H y alfa tubulina. Este último sirve como control de carga de dos de los clones. Los números cuatro y cinco mostraron una fuerte reducción en SNF dos H tras la inducción de doxiciclina y, por lo tanto, se eligen para su uso en el experimento de derribo, que se demostrará en el siguiente segmento.

Las células no tratadas de la tercera placa se utilizarán para expandir la línea celular seleccionada y las alícuotas de esas células se congelarán posteriormente. Para su uso posterior para inducir la eliminación de células de placa ACF uno o SNF dos H en medio selectivo en placas de 10 centímetros, agregue doxiciclina a un microgramo por mililitro a la mitad de las placas e incube a 37 grados Celsius, 5% de dióxido de carbono durante 48 a 72 horas. Cada grupo de placas debe proporcionar las celdas para 12 placas de seis centímetros, incluidos dos duplicados para el ensayo DPI para cada punto, así como una placa para el análisis de Western blot de cada muestra.

De 48 a 72 horas después de la inducción con tripsina, se olfatean las células de cada grupo de células y, después de contarlas, se colocan 1,5 veces 10 por seis células por cada seis centímetros en el mismo medio con o sin doxiciclina. Incubar las células a 37 grados centígrados, 5% de dióxido de carbono durante la noche del día siguiente, transfectar las células. Como se indica.

Tanto las células no tratadas como las tratadas con doxiciclina se transfectan por triplicado de cuatro maneras. Uno con un plásmido vacío y un plásmido que expresa GFP, dos con el plásmido vacío, así como un vector que expresa ACF resistente a SHRA, un GFP o SNF, dos HGFP, tres con un plásmido que codifica E, cuatro o cuatro y un plásmido que expresa GFP y con el plásmido que codifica E, cuatro, los cuatro. Y el vector que expresa resistencia a SHRA, ACF, un GFP o SNF, dos HGFP después de la transfección, incuba todas las placas a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono durante la noche.

Al día siguiente de la transfección de las células, se extraen proteínas de una placa por muestra para el análisis de Western blot con el fin de determinar que ACF uno o SNF dos H se han eliminado de manera eficiente y que E, cuatro o cuatro se expresaron por igual en las diferentes muestras. Las 16 placas restantes se utilizarán para el ensayo DPI. Aspire el medio de las placas destinadas al ensayo DPI y lave las células suavemente con PBS en una campana química.

Añadir un mililitro de formaldehído al 4%para, preparado en PBS, cubrir las células, incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente, sin agitar. Aspirar el para formaldehído y lavar con PBS agitando a temperatura ambiente durante cinco minutos. Repita el lavado dos veces más para un total de tres lavados después del tercer lavado PBS al 80%Etanol mantenido a menos 20 grados Celsius e incube a menos 20 grados Celsius durante al menos una hora.

Aspire el etanol y lave las celdas dos veces con PBS, agitando a temperatura ambiente durante cinco minutos cada vez, luego de eso, lave una vez durante cinco minutos a temperatura ambiente con PBS que contenga 0.5% BSA y 0.05% entre 20 o P-B-S-B-T. También con agitación para evitar la unión de anticuerpos inespecíficos. Bloquee las células en un mililitro de tampón P-B-S-B-T que contiene un 10% de suero de cabra durante 20 minutos mientras agita a temperatura ambiente.

A continuación, lave las celdas dos veces en P-B-S-B-T cinco minutos cada lavado. Incubar las células con el anticuerpo primario, un anticuerpo específico E 4 o 4 en este caso en un mililitro de P-B-S-B-T durante una hora mientras se agita a temperatura ambiente. A continuación, lavar dos veces en P-B-S-B-T y una vez en PBS que contiene 0,1%BSA durante cinco minutos cada lavado.

A continuación, agregue a las células un mililitro de PBS 0.1%BSA que contenga el anticuerpo secundario apropiado marcado con fluorescencia y 0.5 microgramos por mililitro. La concentración final de DPI se incuba durante 40 minutos mientras se agita a temperatura ambiente en la oscuridad. Por último, lavar con PBS durante cinco minutos.

Seque el pocillo por aspiración y mantenga las placas boca abajo durante una hora adicional o toda la noche para lograr un secado completo y cúbralo con portaobjetos de cubierta de montaje de papel de aluminio en las celdas con la solución flora Mount G. Mantenga los platos a cuatro grados centígrados en la oscuridad hasta que esté listo para contar. Las células del núcleo apoptótico que se sometieron a los diversos tratamientos descritos en el protocolo se fijaron y se tiñeron con E, cuatro o cuatro anticuerpos específicos y DPI para visualizar los núcleos de las células transfectadas.

Esta figura muestra un ejemplo de células que expresan E, cuatro o cuatro, y el panel GFP A muestra la expresión de la proteína GFP de control solamente, y el panel B muestra E, cuatro o cuatro núcleos de tinción de DAPI de expresión se muestran en el panel C y las imágenes fusionadas se muestran en el panel D. Las flechas blancas marcan, GFP y E.Cuatro o cuatro células transfectadas que contienen núcleos con morfología apoptótica. Las flechas rojas marcan núcleos con formas irregulares que no se cuentan como núcleos apoptóticos, el asterisco marca núcleos mitóticos o núcleos que acaban de dividir el número de núcleos condensados o fragmentados visualizados por DAPI. La tinción se contó para calcular el porcentaje de núcleos con morfología apoptótica dentro de la población celular transfectada para mantener la objetividad óptima de la prueba.

El recuento del núcleo apoptótico en las distintas muestras se realizó de forma ciega donde la persona que contaba no conocía la identidad de la muestra. Se observaron porcentajes más altos de anomalías nucleares en las células que expresan E, cuatro o cuatro, lo que confirma que las células T, cuatro o cuatro inducen la muerte celular. El porcentaje más alto de anomalías nucleares se observó en las células que expresan E, cuatro o cuatro, donde los niveles de ACF, uno, se redujeron con SHR, y un knockdown mediado, lo que indica que ACF, un knockdown aumenta E, cuatro o cuatro, la muerte celular de Inge mejoró la toxicidad de E, cuatro o cuatro en las células.

La expresión de niveles bajos de ACF uno no resultó de un aumento en los niveles de E, cuatro o cuatro como se observó en el Western blot. Durante la realización de este procedimiento, es importante recordar que se debe facilitar un recuento aconsejado del stent del núcleo apoptótico con DPI y aplicar criterios estrictos para la identificación de este núcleo. Además de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como los ensayos clongénicos, para validar los resultados de la DA pse siguiendo este procedimiento.

Se pueden realizar otros métodos, como los ensayos de coinmunoprecipitación, para responder a preguntas adicionales. Por ejemplo, si existe una interacción física entre las proteínas investigadas.