La detección de Inter-Aberraciones cromosómicas estables por fluorescencia múltiple

El objetivo general de este método citogenético molecular consiste en observar aberraciones estables entre cromosomas en las células de médula ósea de ratones expuestos a irradiación corporal total. Este método puede ayudar a responder la pregunta clave en el campo de la biología de la radiación, como el riesgo de inducir aberraciones cromosómicas estables en las células de médula ósea de ratones expuestos a radiación corporal total. La principal ventaja de esta técnica es que permite la visualización dirigida de daños genéticos estables inducidos por la radiación en las células de médula ósea de ratones, los cuales pueden propagarse a través de muchas generaciones celulares.

Después de aislar la médula ósea de los huesos fémur y tibia de ratón y preparar una suspensión de células individuales según el protocolo descrito, superponga cuidadosamente la suspensión celular sobre un volumen igual de medio de separación de células mononucleares de médula ósea. Centrifugue el gradiente a 400 ×g durante 30 minutos a temperatura ambiente. Luego, recoja cuidadosamente la capa de células blancas (buffy coat) sin perturbar las capas restantes y transfiera la solución a un nuevo tubo cónico de 15 mililitros.

Para preparar extensiones de células en metafase, agregue 10 mililitros de PBS al tubo que contiene la capa leucocitaria. Luego, centrifugue el tubo a 400 × g a temperatura ambiente durante cinco minutos. A continuación, retire cuidadosamente el sobrenadante y golpee suavemente el tubo para deshacer el botón celular.

Luego, agregue 10 mililitros de PBS y centrifugue nuevamente la suspensión. Retire el sobrenadante sin perturbar el pellet celular. Desintegre el pellet y agregue gota a gota cuatro mililitros de solución hipotónica de cloruro de potasio 0,075 molar, previamente calentada, con agitación suave y constante.

Incube la suspensión celular a 37 grados Celsius durante 20 minutos en un baño de agua. Luego, agregue un volumen igual de fijador al tubo y mezcle suavemente invirtiendo el tubo. Centrifugue el tubo y elimine el sobrenadante.

Luego, desintegre el sedimento celular y agregue fijador fresco. Repita la centrifugación y la adición de fijador otras cinco veces. Después de resuspender las células en 400 a 600 microlitros de fijador, coloque 30 microlitros de células fijadas sobre portaobjetos previamente limpios y humedecidos, inclinados a un ángulo de 45 grados, y deje que los portaobjetos se sequen al aire por completo durante la noche.

Para realizar la pintura cromosómica en ratón mediante mFISH, coloque el portaobjetos que contiene las extensiones de células en metafase en SSC 2X durante dos minutos a temperatura ambiente. A continuación, deshidrate el portaobjetos mediante lavados sucesivos en etanol al 70 %, 80 % y 100 %, durante dos minutos en cada lavado. Precaliente 40 mililitros de solución de desnaturalización en un frasco de Coplin de vidrio a 70 grados Celsius durante 30 minutos.

Luego, transfiera el portaobjetos a la solución precalentada e incube la muestra durante uno a un minuto y medio para desnaturalizar los cromosomas. Inmediatamente, use etanol al 70 % frío con hielo para detener la desnaturalización durante dos minutos y evitar que los cromosomas desnaturalizados se reasocien. A continuación, deshidrate el portaobjetos utilizando una serie de etanol, comenzando con etanol al 80 % durante dos minutos.

A continuación, coloque el portaobjetos en etanol al 100 % durante dos minutos. Luego seque completamente el portaobjetos a temperatura ambiente. Para desnaturalizar la sonda, centrifugue brevemente la mezcla de sonda suministrada por el fabricante y transfiera 10 microlitros a un tubo de centrífuga de tapa de rosca de 500 microlitros e incube el tubo en un baño de agua a 80 grados Celsius durante siete minutos.

Ahora coloque el tubo que contiene la sonda desnaturalizada en un baño de agua a 37 grados Celsius durante 10 minutos. A continuación, aplique la mezcla de sonda sobre un portaobjetos con cromosomas desnaturalizados. Cubra cuidadosamente el área con una cubeta de vidrio de 18 milímetros por 18 milímetros y elimine cualquier burbuja de aire visible presionando muy suavemente la cubeta contra el portaobjetos.

Utilice cemento de goma para sellar los cuatro lados del cubreobjetos. Incube la preparación en la oscuridad, en una cámara humidificada a 37 grados Celsius durante 12 a 16 horas. Tras la hibridación, retire cuidadosamente el cemento de goma y el cubreobjetos, y coloque la preparación en SSC 0,4X precalentado a 74 grados Celsius durante cinco minutos.

Luego transfiera el portaobjetos a la solución de lavado tres durante dos minutos. Añada 20 microlitros de medio de montaje antifade con contraste de DAPI sobre el portaobjetos y cúbralo con una laminilla de vidrio. Utilice papel de laboratorio para presionar suavemente la laminilla y eliminar cualquier burbuja de aire y exceso de medio de montaje.

Luego, utilice esmalte de uñas para sellar los bordes del portaobjetos. Observe las preparaciones utilizando un microscopio fluorescente equipado con los filtros adecuados. Para la cariotipificación espectral de cromosomas de ratón, después de que las sondas se hibriden sobre los cromosomas desnaturalizados y las muestras se laven según el protocolo descrito, aplique 80 microlitros del reactivo de tinción SY5 sobre la preparación.

Coloque un cubreobjetos de plástico de 24 por 60 milímetros encima de la muestra e incúbelo en la oscuridad en una cámara humidificada a 37 grados Celsius durante 40 minutos. Sumerja la laminilla en un frasco de vidrio tipo Coplin que contiene solución de lavado precalentada tres veces e incúbela en un baño de agua a 45 grados Celsius con agitación durante dos minutos. Repita el lavado tres veces.

Aplique 80 microlitros del reactivo de tinción SY5.5 a la muestra, cúbrala con una cubreobjetos plástica de 24 por 60 milímetros e incube en la oscuridad en una cámara humedecida a 37 grados Celsius durante 40 minutos. Use la solución de lavado precalentada tres para lavar el portaobjetos tres veces, luego mantenga el portaobjetos en posición inclinada contra una toalla de papel para drenar el exceso de líquido. Añada 20 microlitros del reactivo antifade DAPI a la muestra y coloque cuidadosamente una cubreobjetos de vidrio encima sin introducir burbujas de aire.

Utilice esmalte de uñas para sellar los bordes y observe la muestra con un microscopio de epifluorescencia equipado para capturar imágenes del cielo. Esta figura muestra extensiones representativas de células en metafase con pares normales y aberrantes de los cromosomas de ratón uno, dos y tres. Aquí se observa una aberración estable que involucra al cromosoma uno, en la que una parte del cromosoma uno se ha integrado en un cromosoma DAPI no teñido, mientras que otra parte ha formado un fragmento acéntrico.

En este ejemplo, una parte del cromosoma dos se ha integrado en un cromosoma no marcado. Esta aberración estable involucra al cromosoma tres. En esta extensión de metafase se observan aberraciones estables que involucran a los tres cromosomas marcados.

Se muestra aquí un ejemplo de cariotipificación espectral de un ratón hembra normal. Este panel representa una aberración estable que involucra los cromosomas cuatro y 12. Finalmente, la aberración cromosómica estable en este panel involucra los cromosomas siete y 10.

Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en un período de 48 a 72 horas si se lleva a cabo correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que solo deben usarse células en proliferación. Siguiendo este procedimiento y otros métodos como el de banda, se pueden responder preguntas adicionales, como si existen aberraciones estables intercromosómicas en las células irradiadas.

Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la citogenética molecular exploraran la asociación entre aberraciones genéticas y diversas enfermedades. Después de ver este video, debería tener una idea más clara sobre cómo determinar las aberraciones estables intercromosómicas. No olvide que trabajar con colchicina puede ser extremadamente peligroso porque es carcinógena, y siempre se deben tomar precauciones, como el uso de guantes, al realizar este experimento.