La detección de Inter-Aberraciones cromosómicas estables por fluorescencia múltiple In Situ La hibridación (mFISH) y cariotipo espectral (SKY) en ratones irradiados

El objetivo general de este método citogénico molecular es observar las aberraciones estables intercromosómicas en las células de la médula ósea de ratones expuestos a la irradiación corporal total. Este método puede ayudar a responder a la pregunta clave en el campo de la biología de la radiación, como el riesgo de inducir aberraciones cromosómicas estables en las células de la médula ósea de ratones expuestos a la radiación corporal total. La principal ventaja de esta técnica es que permite la visualización guiada de los daños genéticos estables inducidos por la radiación en las células de la médula ósea de ratones que pueden propagarse a través de muchas generaciones celulares.

Después de aislar la médula ósea de los huesos del fémur y la tibia del ratón y hacer una suspensión de una sola célula de acuerdo con el protocolo de texto, superponga cuidadosamente la suspensión celular en un volumen igual de medio de separación de células mononucleares de médula ósea. Centrifugar el gradiente a 400 veces G a temperatura ambiente durante 30 minutos. Luego, recoja con cuidado la capa leucocitaria sin alterar las capas restantes y transfiera la solución a un nuevo tubo de centrífuga de 15 mililitros.

Para preparar la propagación de células en metafase, agregue 10 mililitros de PBS al tubo que contiene la capa leucocitaria. A continuación, centrifugar el tubo a 400 veces G a temperatura ambiente durante cinco minutos. A continuación, retire con cuidado el sobrenadante y golpee suavemente el tubo para romper la pelletza de celda.

A continuación, añade 10 mililitros de PBS y vuelve a centrifugar la suspensión. Retire el sobrenadante sin alterar la célula granulable. Rompa el pellet y agregue gota a gota cuatro mililitros de solución de cloruro de potasio 0,075 molar hipotónico precalentado con una agitación suave y constante.

Incubar la suspensión celular a 37 grados centígrados durante 20 minutos en un baño de agua. A continuación, añada un volumen igual de fijador al tubo y mezcle suavemente invirtiendo el tubo. Centrifuga el tubo y retira el sobrenadante.

A continuación, rompa el pellet de la célula y añada un fijador nuevo. Repita el centrifugado y la adición de fijador cinco veces más. Después de resuspender las células en 400 a 600 microlitros de fijador, deje caer 30 microlitros de células fijas en portaobjetos prelimpios y húmedos inclinados en un ángulo de 45 grados y deje que los portaobjetos se sequen al aire por completo durante la noche.

Para llevar a cabo la pintura de cromosomas de ratón con mFISH, coloque el portaobjetos que contiene las propagaciones celulares de la metafase en SSC 2X durante dos minutos a temperatura ambiente. Luego, deshidrate el portaobjetos mediante un lavado en serie con etanol al 70%80% y 100% de etanol durante dos minutos en cada lavado. Precaliente 40 mililitros de solución de desnaturalización en un frasco de vidrio a 70 grados centígrados durante 30 minutos.

Luego transfiera el portaobjetos a la solución precalentada e incube la muestra durante uno a 1 1/2 minutos para desnaturalizar los cromosomas. Use inmediatamente etanol al 70% frío como hielo para enfriar el portaobjetos durante dos minutos para detener el proceso de desnaturalización y evitar que los cromosomas desnaturalizados se vuelvan a reformular. A continuación, deshidrate el portaobjetos utilizando una serie de etanol que comience con etanol al 80% durante dos minutos.

A continuación, coloque la diapositiva en etanol al 100% durante dos minutos. A continuación, seque completamente el portaobjetos a temperatura ambiente. Para desnaturalizar la sonda, centrifugar brevemente la mezcla de la sonda suministrada por el fabricante, luego transfiera 10 microlitros a un tubo centrífugo de tapa a presión de 500 microlitros e incube el tubo en un baño de agua a 80 grados Celsius durante siete minutos.

Ahora coloque el tubo que contiene la sonda desnaturalizada en un baño de agua a 37 grados centígrados durante 10 minutos. A continuación, aplique la mezcla de la sonda en un portaobjetos con cromosomas desnaturalizados. Cubra cuidadosamente el área con un cubreobjetos de vidrio de 18 milímetros por 18 milímetros y elimine las burbujas de aire visibles presionando muy suavemente el cubreobjetos contra el portaobjetos.

Use cemento de caucho para sellar los cuatro lados del cubreobjetos. E incubar el portaobjetos en la oscuridad en una cámara humidificada a 37 grados centígrados durante 12 a 16 horas. Después de la hibridación, retire con cuidado el cemento de caucho y el cubreobjetos y coloque el portaobjetos en SSC 0.4X precalentado a 74 grados Celsius durante cinco minutos.

Luego transfiera el portaobjetos a la solución de lavado tres durante dos minutos. Agregue 20 microlitros de medio de montaje antidecoloración con contratinción DAPI en el portaobjetos y cúbralo con un cubreobjetos de vidrio. Use papel de seda de laboratorio para presionar suavemente el cubreobjetos para eliminar las burbujas de aire y el exceso de solución de montaje.

A continuación, utiliza un esmalte de uñas para sellar los bordes del cubreobjetos. Visualice los portaobjetos utilizando un microscopio fluorescente equipado con los filtros adecuados. Para el cariotipo espectral de los cromosomas de ratón, después de que las sondas se hibridan con los cromosomas desnaturalizados y las muestras se lavan de acuerdo con el protocolo de texto, aplique 80 microlitros de reactivo de tinción SY5 al portaobjetos.

Coloque un cubreobjetos de plástico de 24 por 60 milímetros encima de la muestra e incube en la oscuridad en una cámara humidificada a 37 grados centígrados durante 40 minutos. Sumerja el portaobjetos en un frasco de vidrio de coplin que contenga la solución de lavado precalentada tres e incube en un baño de agua a 45 grados centígrados agitando durante dos minutos. Repite el lavado tres veces.

Aplique 80 microlitros de reactivo de tinción SY5.5 a la muestra, cúbrala con un cubreobjetos de plástico de 24 por 60 milímetros e incube en la oscuridad en una cámara humidificada a 37 grados centígrados durante 40 minutos. Use la solución de lavado precalentada tres para lavar el portaobjetos tres veces, luego sostén el portaobjetos en una posición inclinada contra una toalla de papel para drenar el exceso de líquido. Añada 20 microlitros de reactivo DAPI antidecoloración a la muestra y coloque con cuidado un cubreobjetos de vidrio encima sin introducir burbujas de aire.

Use esmalte de uñas para sellar los bordes y observe la muestra con un microscopio de epifluorescencia equipado para capturar imágenes del cielo. Esta figura muestra diseminaciones representativas de células en metafase con pares de cromosomas de ratón normales y aberrantes uno, dos y tres. Aquí hay una aberración estable que involucra el cromosoma uno, donde una parte del cromosoma uno se ha integrado en un cromosoma DAPI no pintado, mientras que otra parte ha formado un fragmento acéntrico.

En este ejemplo, una parte del cromosoma dos se ha integrado en un cromosoma no pintado. Esta aberración estable involucra al cromosoma tres. En esta propagación de la metafase se observan aberraciones estables que afectan a los tres cromosomas pintados.

Aquí se muestra un ejemplo de cariotipo espectrospectral de un ratón hembra normal. Este panel representa una aberración estable que involucra a los cromosomas cuatro y 12. Finalmente, la aberración cromosómica estable en este panel involucra a los cromosomas siete y 10.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en un plazo de 48 a 72 horas si se hace correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que solo se deben usar células proliferantes. Seguir este procedimiento y otros métodos, como en banda, se pueden utilizar para responder preguntas adicionales, como si hay aberraciones estables intercromosómicas en las células irradiadas.

Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores del campo de la citogenética molecular exploraran la asociación entre las aberraciones genéticas y las diversas enfermedades. Después de ver este video, debería tener una idea más clara de cómo determinar las aberraciones estables intercromosómicas. No olvide que trabajar con colchicina puede ser extremadamente peligroso porque es cancerígeno y siempre se deben tomar precauciones como el uso de guantes mientras se realiza este experimento.