Name: La detección de Inter-Aberraciones cromosómicas estables por fluorescencia múltiple In Situ La hibridación (mFISH) y cariotipo espectral (SKY) en ratones irradiados (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: Aprende a detectar aberraciones cromosómicas estables intercromosómicas mediante mFISH y cariotipo espectral (SKY) en células de médula ósea de ratones irradiados. Esta técnica permite visualizar daños genéticos inducidos por radiación.

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Este estudio fue apoyado por Arkansas Consorcio de Becas Espaciales y el Instituto Nacional de Investigación Biomédica Espacial a través de Aeronáutica y del Espacio Nacional, otorga NNX15AK32A (RP) y RE03701 (MH-J), y P20 GM109005 (MH-J), y la Administración de Veteranos de los Estados Unidos ( MH-J). Agradecemos a Christopher Fettes, Coordinador del Programa para el Departamento de Medio Ambiente y Salud Ocupacional de la Universidad de Arkansas para las Ciencias Médicas, por su asistencia editorial en la preparación del manuscrito.

Todos los estudios con animales se llevaron a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud. El protocolo animal fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Arkansas para las Ciencias Médicas. Todos los animales fueron alojados bajo animalario climatizado estándar a 20 ± 2 ° C con 10 - 15 ciclos por hora de aire fresco y libre acceso al alimento estándar para roedores y agua. A su llegada, los ratones se mantuvieron en cuarentena durante 1 semana y siempre con comida para roedores certificado. La exposición 1.Radiation e in vivo detención de las células en metafase <ol><li> exponer los ratones anestesiados un-a 2 Gy de radiación en todo el cuerpo en una cámara de irradiación. Durante la irradiación, los ratones lugar en una cámara de retención con buena ventilación para asegurarse de que no se mueven libremente y recibir una dosis uniforme. </li><li> Se inyectan 100 l de solución de colchicina 0,05% (cpolvo olchicine disuelto en calcio y magnesio libre de PBS) por vía intraperitoneal usando una aguja de 25 G adjunto con jeringa de 1 ml desechable. Evitar la inyección directamente en cualquier órgano. </li><li> Dejar al animal en la jaula durante 2 h antes de la cosecha de células de médula ósea. Observar el animal para detectar cualquier signo de dolor o angustia. </li></ol> 2. Médula Ósea de la célula de la cosecha y Aislamiento de células mononucleares de médula ósea por centrifugación en gradiente de densidad <ol><li> La eutanasia a los ratones por asfixia con CO2. </li><li> Pulverizar 70% de etanol en el dorsal y el lado ventral. </li><li> Hacer una incisión de 2 cm en la piel abdominal con unas tijeras afiladas. Agarre la piel en cada lado de la incisión con pinzas romas y tire suavemente abrir los músculos abdominales. </li><li> Cortar dos de las patas traseras con las tijeras y de inmediato colocarlos en PBS enfriado previamente con 4% de FBS. </li><li> Limpiar cuidadosamente todos los músculos que se unen a la extremidad posterior con una hoja de afeitar y gasa de algodón vendaje agudo. </li><li> Se separa la tibia del fémur. Recorte ambas puntas de cada hueso con una hoja de afeitar. </li><li> Enjuague el contenido de la médula ósea con 3 ml de PBS (con 4% de FBS) utilizando una aguja de 23 G unida a una jeringa de 3 ml y recoger el contenido en un tubo de centrífuga de 15 mL. Pasar la suspensión de células al menos 10 veces a través de la aguja para hacer una suspensión de células individuales. </li><li> superponer cuidadosamente la suspensión de células en un volumen igual de medio de separación de linfocitos (3 ml) sin perturbar la interfaz entre la suspensión de células y medio de separación de linfocitos. Centrifugar a 400 xg durante 30 min a temperatura ambiente. </li><li> Recoger cuidadosamente la capa leucocitaria sin molestar a las otras capas y la transferencia en un nuevo tubo de centrífuga de 15 ml. </li></ol> 3. Preparación de las propagaciones de metafases celulares <ol><li> Añadir 10 ml de PBS al tubo que contiene la capa leucocitaria. </li><li> Centrifugar a 400 xg durante 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Retirar con cuidado el sobrenadante. Luego romper tél célula de pellets, sacudiendo ligeramente y añadir 10 ml de PBS. </li><li> Centrifugar a 400 xg durante 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Eliminar el sobrenadante sin perturbar el sedimento celular, romper la pastilla, y añadir 4 ml de solución de cloruro de potasio 0,075 M hipotónica pre-calentado. Añadir gota a gota solución hipotónica con agitación constante suave. </li><li> Se incuban las células durante 20 min a 37 ° C en una baño de agua. </li><li> Después del tratamiento hipotónico añadir un volumen equivalente (4 ml) de fijador (metanol: ácido acético glacial, 3: 1 v / v) en el tubo de 15 ml y se mezcla suavemente invirtiendo el tubo. </li><li> Centrifugar a 400 xg durante 5 min a temperatura ambiente y descartar el sobrenadante. </li><li> Romper el sedimento celular de la función tocar seguido de vórtice suave durante unos segundos y añadir 3 ml de solución de fijación gota a gota con agitación constante. </li><li> Incubar durante 30 min a temperatura ambiente y centrifugar a 400 xg durante 5 min. </li><li> Eliminar el sobrenadante, romper el sedimento celular con gentLe tapping, y añadir 3 ml de fijador. </li><li> Centrifugar a 400 g durante 5 min a temperatura ambiente, y se elimina el sobrenadante. Romper el sedimento celular con golpecitos suaves, frescos y añadir 3 ml de fijador. </li><li> Repita el paso 3.12 dos veces más. </li><li> Centrifugar a 400 xg durante 5 min a temperatura ambiente, y eliminar el sobrenadante sin alterar el sedimento celular. A continuación, añadir 400 a 600 l fijador y mezclar bien con la pipeta. </li><li> Caída de 30 l células fijadas sobre portaobjetos previamente limpiados y húmedas inclinadas en un ángulo de 45 ° y permitir que los portaobjetos se sequen al aire por completo durante la noche. </li></ol> 4. ratón cromosoma pintura de mFISH <ol><li> La desnaturalización de cromosomas <ol><li> Colocar la placa que contiene los diferenciales de células en metafase en 2x SSC durante 2 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Deshidratar la corredera por lavado de etanol de serie de 2 min cada uno en 70%, 80% y 100%. Incubar durante 60 minutos a 65 ° C. </li><li> solución de desnaturalización 40 ml de precalentamiento (70% formamida / 2x SSDO; pH 7,0) a 70 ° C (± 2 ° C) en un tarro Coplin vidrio para 30 min. Desnaturalizar cromosomas incubando el portaobjetos en solución de desnaturalización pre-calentado por 1 - 1,5 min. </li><li> Se detiene inmediatamente deslice en helado de etanol al 70% durante 2 min para detener el proceso de desnaturalización, así como para evitar que los cromosomas desnaturalizados de re-recocido. Entonces deshidratar por lavado con 80% de etanol durante 2 min. Repetir el lavado con etanol con etanol al 100% durante 2 min. Completamente seco el portaobjetos a temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Desnaturalización e hibridación de la sonda de mezcla <ol><li> Centrifugar brevemente la mezcla de sonda suministrado por el fabricante, la transferencia de 10 l de mezcla de sonda en un 500 l complemento tubo de centrífuga de casquillo, y desnaturalizar por incubación a 80 ° C (± 2 ° C) en un baño de agua durante 7 minutos. </li><li> Coloque el tubo de centrífuga con la mezcla de sonda en un baño de agua a 37 ° C durante 10 minutos. </li><li> Aplicar la mezcla de sonda desnaturalizada en el portaobjetos con chromoso desnaturalizadaMES. </li><li> cubrir cuidadosamente el área con una x 18 mm cubreobjetos de vidrio de 18 mm y eliminar las burbujas de aire visibles presionando suavemente la hoja de la cubierta se deslice. Sellar los cuatro lados de la hoja de la cubierta con cemento de goma y se incuba durante 12 h a 16 h en la oscuridad a 37 ° C en una cámara húmeda para la hibridación. </li></ol></li><li> Lavado post hibridación y detección <ol><li> Retirar con cuidado el cemento de caucho y la hoja de la cubierta. </li><li> Colocar el portaobjetos en SSC 0,4x previamente calentada a 74 ° C (± 2 ° C) durante 5 min. </li><li> diapositiva de lavado en solución de lavado II (4x SSC / 0,1% de Tween-20) durante 2 min. </li><li> Colocar 20 l de anti-fade medio de montaje con DAPI de contraste (1,5 mg / ml) y cubrir con un cubreobjetos de vidrio. Presione suavemente el cubreobjetos con el tejido de laboratorio para eliminar las burbujas de aire y solución de montaje exceso. Sellar los bordes del cubreobjetos con esmalte de uñas. </li><li> Ver diapositivas utilizando un microscopio de fluorescencia equipado con filtros adecuados. </li></ol></li&gt; </ol> 5. El cariotipo espectral (SKY) de cromosomas de ratón <ol><li> La desnaturalización de la sonda y el cromosoma <ol><li> Equilibrar diapositiva en 2x SSC a temperatura ambiente durante 2 minutos, sin agitar. </li><li> Deshidratar diapositivas en una serie de etanol (70%, 80% y 100% de etanol) durante 2 min cada uno a temperatura ambiente. El aire seco de la corredera para eliminar el etanol por completo. </li><li> solución caliente 40 ml de desnaturalización (70% de formamida / SSC 2x; pH 7,0) en un tarro Coplin vidrio para 30 min. </li><li> Incubar portaobjetos en solución de desnaturalización pre-calentado por 1 a 1,5 min. </li><li> Inmediatamente sumerja la diapositiva en helado de etanol 70% durante 2 min para detener el proceso de desnaturalización, así como para evitar que los cromosomas desnaturalizados de re-recocido. </li><li> Deshidratar la diapositiva colocándolo en 80% de etanol durante 2 min y luego en 100% de etanol durante 2 min a temperatura ambiente. </li><li> Desnaturalizar la sonda SKY (vial # 1, suministrado por el fabricante) en un baño de agua a 80 ° C (± 2 ºC)durante 7 minutos y, a continuación, colocar inmediatamente en un baño de agua diferentes establecido en 37 ° C durante 10 minutos. </li></ol></li><li> sonda de hibridación <ol><li> Añadir 10 l de sonda desnaturalizada SKY en los cromosomas desnaturalizados. </li><li> Con cuidado, coloque un joven de 18 mm x 18 mm cubreobjetos de vidrio en la sonda cielo para que no queden burbujas de aire atrapadas bajo el cubreobjetos. </li><li> Sellar los bordes del cubreobjetos con cemento de goma. </li><li> Colocar el portaobjetos en una cámara a prueba de luz húmeda y se incuba en la oscuridad a 37 ° C durante 24 h a 36 h. </li></ol></li><li> Post-hibridación de lavado y detección por fluorescencia <ol><li> Retire el cemento de goma con mucho cuidado sin perturbar el cubreobjetos. </li><li> Colocar el portaobjetos en la solución de lavado rápido precalentado (SSC 0,4x) a 72 ° C (± 2 ° C) durante 5 minutos con agitación constante. Sumergir diapositiva en solución de lavado III (4x SSC / 0,1% de Tween 20) y se incuba durante 1 min con agitación. </li><li> Opcional: Añadir 80 l de reactivo de bloqueo(Vial # 2 suministrada por el fabricante) a la zona de la hibridación, coloque una 24 mm x 60 mm cubreobjetos de plástico, y se incuba en la oscuridad a 37 ° C durante 30 min en una cámara humidificada. </li><li> Retire con cuidado el cubreobjetos de plástico y lavar el portaobjetos con (45 ºC) solución de lavado precalentado durante 5 minutos III. </li><li> Aplique 80 l de reactivo de tinción Cy5 (vial nº 3 suministrado por el fabricante), coloque una de 24 mm x 60 mm cubreobjetos de plástico, y se incuba a 37 ° C en la oscuridad durante 40 minutos en una cámara húmeda. </li><li> Sumergir el portaobjetos en una jarra Coplin de vidrio que contiene precalentado (45 ° C) solución de lavado III (4x SSC / 0,1% de Tween 20) y se incuba a 45 ° C en un baño de agua durante 2 minutos con agitación. Repita este paso de lavado 3 veces. </li><li> Aplique 80 l de reactivo de tinción Cy5.5 (vial # 4 suministrado por el fabricante), coloque una de 24 mm x 60 mm cubreobjetos de plástico, y se incuba a 37 ° C en la oscuridad durante 40 minutos en una cámara húmeda. </li><li> Lavar el portaobjetos 3 veces con pre-calentado (45 ºC) solución de lavado III. </li><li> Mantenga la corredera en una posición inclinada contra una toalla de papel para drenar el exceso de líquido. Añadir 20 l de reactivo anti-fade DAPI (vial # 5 suministrado por el fabricante) y coloque un 24 mm x 60 mm cubreobjetos de vidrio sin introducir burbujas de aire. Sellar los bordes del cubreobjetos con esmalte de uñas y observar con un microscopio de epifluorescencia equipado para la captura de imágenes del cielo. </li></ol></li></ol>

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<li>Braselmann, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SKY+and+FISH+analysis+of+radiation-induced+chromosome+aberrations%3A+a+comparison+of+whole+and+partial+genome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">SKY and FISH analysis of radiation-induced chromosome aberrations: a comparison of whole and partial genome analysis.</a> Mutat. Res. 578, 124-133 (2005).</li>
<li>Sokolova, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+a+multitarget%2C+multicolor+fluorescence+in+situ+hybridization+assay+for+the+detection+of+urothelial+carcinoma+in+urine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">The development of a multitarget, multicolor fluorescence in situ hybridization assay for the detection of urothelial carcinoma in urine.</a> J Mol Diagn. 2, 116-123 (2000).</li>
<li>Lindholm, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodosimetry+after+accidental+radiation+exposure+by+conventional+chromosome+analysis+and+FISH%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Radiat+Biol%22%5BJournal%5D)">Biodosimetry after accidental radiation exposure by conventional chromosome analysis and FISH.</a> Int J Radiat Biol. 70, 647-656 (1996).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Varios pasos críticos determinan el éxito de mFISH y SKY. El primero y más importante paso es optimizar el tratamiento con colchicina para la detención mitótica en vivo de las células mononucleares de médula ósea. El tiempo de concentración de la colchicina y el tratamiento de forma individual o en conjunto determinan el índice mitótico, así como el cromosoma condensación de dos requisitos importantes para la pintura cromosoma eficaz. Un tiempo de tratamiento alta concentración de colchicina o más largo conduce...

Los dos métodos más fiables para identificar las aberraciones estables intercromosómicas inducidas por radiación son la hibridación in situ de fluorescencia múltiple (mFISH), que permite pintar dos o más cromosomas simultáneamente, y el cariotipo espectral (SKY), que imparte un color distinto a cada par de cromosomas homólogos en el genoma. A diferencia de las aberraciones inestables, las aberraciones estables son persistentes en la naturaleza y pueden propagarse durante varias generaciones en poblaciones irradiadas1, y se consideran "firmas" moleculares críticas de lesiones citogenéticas inducidas por radiación2. Los estudios realizados por varios grupos han demostrado que las aberraciones estables están asociadas con la patogénesis y el desarrollo de una serie de enfermedades, incluido el cáncer3. Antes de la era de la pintura cromosómica (también conocida como citogenética molecular), la técnica convencional de bandas G era el único método para detectar aberraciones cromosómicas estables. Sin embargo, el anillamiento cromosómico es un desafío para los citogenetistas porque la resolución es limitada, la reproducibilidad es incierta, es un procedimiento laborioso y requiere citogenetistas altamente capacitados y experimentados parauna interpretación confiable de los datos. Además, la técnica clásica de bandas no permite la detección de reordenamientos cromosómicos complejos, que implican la interacción de tres o más roturas distribuidas entre dos o más cromosomas, un resultado común del daño por radiación. Las aberraciones complejas pueden persistir en los individuos muchos años después de la exposición a la radiación, lo que las hace útiles para la biodosimetría retrospectiva5. Por lo tanto, se requería un enfoque alternativo para superar las limitaciones de las técnicas convencionales de bandas para detectar reordenamientos cromosómicos estables. 
A finales de la década de 1960, el trabajo pionero de Gall y Pardue (1969) sobre la hibridación molecular utilizando sondas de ácido nucleico marcadas con material radiactivo inició una nueva era en el campo de la citogenética, que permitió la detección de una secuencia específica de ADN en los cromosomas6. Sin embargo, el uso de sondas radiactivas para la hibridación molecular tenía varios inconvenientes: las sondas radiactivas son relativamente inestables, la actividad de la sonda depende de la desintegración radiactiva del isótopo utilizado, la hibridación lleva más tiempo, la resolución es limitada, las sondas son relativamente costosas y los materiales radiactivos son peligrosos para la salud. Por lo tanto, se hizo necesario desarrollar y diseñar sondas no radiactivas. La introducción de sondas de ácido nucleico marcadas con fluorescencia en las décadas de 1980 y 1990 superó las limitaciones de las sondas radiactivas y mejoró en gran medida la seguridad, la sensibilidad y la especificidad de la técnica de hibridación7-10. Las sondas fluorescentes dan lugar a señales extremadamente brillantes cuando se observan bajo microscopios de fluorescencia equipados con los filtros de excitación y emisión adecuados. Cualquier pérdida, ganancia o reordenamiento de los cromosomas marcados con fluorescencia o de una parte del cromosoma es fácilmente identificable con esta técnica FISH.
El análisis de las aberraciones cromosómicas mediante la pintura FISH ha llevado a un notable progreso en la investigación citogenética a lo largo de los años. El diseño de sondas marcadas con fluorescencia para aplicaciones específicas que van desde sondas específicas de locus hasta sondas de pintura de cromosomas completos ha avanzado significativamente en el campo; Esto también ha facilitado la detección de reordenamientos submicroscópicos ("crípticos"), que no eran posibles mediante el bandeo cromosómico convencional. La pintura cromosómica de mFISH y SKY ha demostrado ser una herramienta valiosa para la identificación de reordenamientos intercromosómicos simples y complejos. Los principios básicos de ambas técnicas son similares, pero el método de detección y discriminación de la señal fluorescente después de la hibridación in situ y el proceso de adquisición de imágenes son diferentes. En mFISH, se capturan imágenes separadas de cada uno de los cuatro fluorocromos mediante el uso de filtros de microscopio de paso de banda estrecha; A continuación, se utiliza un software dedicado para combinar las imágenes. Mientras que en SKY, la adquisición de imágenes se basa en una combinación de microscopía de epifluorescencia, imágenes de dispositivos de carga acoplada y espectroscopía de Fourier, que permite la medición de todo el espectro de emisión con una sola exposición en todos los puntos de la imagen. Tanto en mFISH como en SKY, las imágenes monocromáticas se capturan de forma independiente, luego se fusionan y, finalmente, se asignan pseudocolores únicos a los cromosomas en imágenes monocromáticas en función del tinte específico adjunto a cada sonda de fluorocromo.
La contribución del análisis mFISH y SKY en el campo de la biología de la radiación es notable, particularmente para la estimación retrospectiva de la dosis de exposición humana a IR (biodosimetría de radiación)11-14, la evaluación del riesgo de carcinogénesis por radiación15, así como la detección y estimación del riesgo de cáncer secundario relacionado con la radioterapia16. Un estudio reciente en ratones ha demostrado que una técnica de pintura cromosómica basada en FISH es también una herramienta importante para evaluar la eficacia de la contramedida de radiación17. En el presente estudio, se ha demostrado el efecto de la exposición total a la radiación corporal en la inducción de aberraciones cromosómicas estables en las células de la médula ósea de ratones utilizando técnicas mFISH y SKY.

<table><tbody><tr><td>Formamida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221198-100ML</td><td></td></tr><tr><td>SSC Tampón 20&times; Reactivo de</td> laboratorio <td>concentrado Sigma-Aldrich</td><td>S6639-1L</td><td></td></tr><tr><td>SKY para</td><td>imágenes espectrales aplicadas</td> en ratones <td>FPRPR0030/M40</td><td></td></tr><tr><td>CAD - Kit de detección de anticuerpos concentrados</td><td>Imágenes espectrales aplicadas</td><td>FPRPR0033</td><td></td>pinturas</tr><tr><td>individuales personalizadas - 3 colores; Cromosoma 1 de ratón: Rojo, Cromosoma 2 de ratón: Verde, Cromosoma 3 de ratón: Aqua</td><td>Applied Spectral Imaging</td><td>FPRPR0182/10</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos de vidrio</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545B</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-100</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico, 37%, Acros Organics</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC45055-0025&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Platos de tinción de vidrio Fisherbrand&nbsp; con tapón de rosca</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-816</td><td></td></tr><tr><td>KaryoMAX Solución de cloruro de potasio&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>10575-090</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Superfrost Plus Portaobjetos de microscopio</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Colcemid en polvo</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-464-757&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Histopaco-1083&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10831</td><td></td></tr><tr><td>Shepherd Mark I, modelo 25 137Cs irradiador J</td><td>. L. Shepherd & Asociados</td><td>Jeringa Modelo 484B</td><td></td></tr><tr><td>1 mL</td><td>BD Biosciences</td><td>647911</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol Etílico, 200 Grados</td><td>Fisher Scientific</td><td>MEX02761</td><td></td></tr><tr><td>PBS, (1x PBS Liq.), sin Calcio y Magnesio</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN1860454</td><td></td></tr><tr><td>Suero Fetal Bovino</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-437-010</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A454SK-4</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético glacial</td><td></td><td></td> Microscopio Zeiss Zeiss de AC295320010 <td></td>Fisher Scientific</tr><tr><td>Zeiss</td><td>Zeiss</td><td>AXIO Imager.Z2</td><td></td></tr></tbody></table>

la detección de inter-aberraciones cromosómicas estables por fluorescencia múltiple<em&gt; in situ</em&gt; la hibridación (mfish) y cariotipo espectral (sky) en ratones irradiados

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice

La radiación ionizante (IR) induce numerosas aberraciones cromosómicas estables e inestables. Las aberraciones inestables, en las que la morfología de los cromosomas se ve sustancialmente comprometida, pueden identificarse fácilmente mediante técnicas convencionales de tinción cromosómica. Sin embargo, la detección de aberraciones estables, que implican el intercambio o la translocación de materiales genéticos sin una modificación considerable en la morfología cromosómica, requiere sofisticadas técnicas de pintura cromosómica que se basan en la hibridación in situ de sondas de ADN marcadas con fluorescencia, una técnica de pintura cromosómica conocida popularmente como fluorescencia in situ hibridación (FISH). Las sondas FISH pueden ser específicas para cromosomas completos o subregiones precisas de cromosomas. El método no solo permite la visualización de aberraciones estables, sino que también puede permitir la detección de los cromosomas o secuencias específicas de ADN involucradas en la formación de una aberración en particular. Hay una variedad de técnicas de pintura cromosómica disponibles en citogenética; aquí se discuten dos métodos altamente sensibles, la hibridación in situ de fluorescencia múltiple (mFISH) y el cariotipo espectral (SKY), para identificar las aberraciones estables intercromosómicas que se forman en las células de la médula ósea de ratones después de la exposición a la irradiación corporal total. Aunque ambas técnicas se basan en sondas de ADN marcadas con fluorescencia, el método de detección y el proceso de adquisición de imágenes de las señales fluorescentes son diferentes. Estas dos técnicas se han utilizado en diversas áreas de investigación, como la biología de la radiación, la citogenética del cáncer, la biodosimetría de radiación retrospectiva, la citogenética clínica, la citogenética evolutiva y la citogenética comparativa.

la irradiación de todo el cuerpo causa una serie de aberraciones cromosómicas en las células de médula ósea de ratones irradiados. El protocolo actual está optimizado para detención de la mitosis in vivo de células de médula ósea después de exposición a la radiación, de la cosecha de células de médula ósea de las patas traseras de los ratones irradiados, el aislamiento de células mononucleares de médula ósea por centrifugación en gradiente de densidad, la preparación de los dife...

El presente protocolo describe la utilidad de la hibridación in situ de fluorescencia múltiple (mFISH) y el cariotipo espectral (SKY) en la identificación de aberraciones estables intercromosómicas en las células de la médula ósea de ratones después de la exposición a la irradiación corporal total.

La detección de Inter-Aberraciones cromosómicas estables por fluorescencia múltiple<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación (mFISH) y cariotipo espectral (SKY) en ratones irradiados

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially ...

El objetivo general de este método citogenético molecular consiste en observar aberraciones estables entre cromosomas en las células de médula ósea de ratones expuestos a irradiación corporal total. Este método puede ayudar a responder la pregunta clave en el campo de la biología de la radiación, como el riesgo de inducir aberraciones cromosómicas estables en las células de médula ósea de ratones expuestos a radiación corporal total. La principal ventaja de esta técnica es que permite la visualización dirigida de daños genéticos estables inducidos por la radiación en las células de médula ósea de ratones, los cuales pueden propagarse a través de muchas generaciones celulares.Después de aislar la médula ósea de los huesos fémur y tibia de ratón y preparar una suspensión de células individuales según el protocolo descrito, superponga cuidadosamente la suspensión celular sobre un volumen igual de medio de separación de células mononucleares de médula ósea. Centrifugue el gradiente a 400 ×g durante 30 minutos a temperatura ambiente. Luego, recoja cuidadosamente la capa de células blancas (buffy coat) sin perturbar las capas restantes y transfiera la solución a un nuevo tubo cónico de 15 mililitros.Para preparar extensiones de células en metafase, agregue 10 mililitros de PBS al tubo que contiene la capa leucocitaria. Luego, centrifugue el tubo a 400 × g a temperatura ambiente durante cinco minutos. A continuación, retire cuidadosamente el sobrenadante y golpee suavemente el tubo para deshacer el botón celular.Luego, agregue 10 mililitros de PBS y centrifugue nuevamente la suspensión. Retire el sobrenadante sin perturbar el pellet celular. Desintegre el pellet y agregue gota a gota cuatro mililitros de solución hipotónica de cloruro de potasio 0,075 molar, previamente calentada, con agitación suave y constante.Incube la suspensión celular a 37 grados Celsius durante 20 minutos en un baño de agua. Luego, agregue un volumen igual de fijador al tubo y mezcle suavemente invirtiendo el tubo. Centrifugue el tubo y elimine el sobrenadante.Luego, desintegre el sedimento celular y agregue fijador fresco. Repita la centrifugación y la adición de fijador otras cinco veces. Después de resuspender las células en 400 a 600 microlitros de fijador, coloque 30 microlitros de células fijadas sobre portaobjetos previamente limpios y humedecidos, inclinados a un ángulo de 45 grados, y deje que los portaobjetos se sequen al aire por completo durante la noche.Para realizar la pintura cromosómica en ratón mediante mFISH, coloque el portaobjetos que contiene las extensiones de células en metafase en SSC 2X durante dos minutos a temperatura ambiente. A continuación, deshidrate el portaobjetos mediante lavados sucesivos en etanol al 70 %, 80 % y 100 %, durante dos minutos en cada lavado. Precaliente 40 mililitros de solución de desnaturalización en un frasco de Coplin de vidrio a 70 grados Celsius durante 30 minutos.Luego, transfiera el portaobjetos a la solución precalentada e incube la muestra durante uno a un minuto y medio para desnaturalizar los cromosomas. Inmediatamente, use etanol al 70 % frío con hielo para detener la desnaturalización durante dos minutos y evitar que los cromosomas desnaturalizados se reasocien. A continuación, deshidrate el portaobjetos utilizando una serie de etanol, comenzando con etanol al 80 % durante dos minutos.A continuación, coloque el portaobjetos en etanol al 100 % durante dos minutos. Luego seque completamente el portaobjetos a temperatura ambiente. Para desnaturalizar la sonda, centrifugue brevemente la mezcla de sonda suministrada por el fabricante y transfiera 10 microlitros a un tubo de centrífuga de tapa de rosca de 500 microlitros e incube el tubo en un baño de agua a 80 grados Celsius durante siete minutos.Ahora coloque el tubo que contiene la sonda desnaturalizada en un baño de agua a 37 grados Celsius durante 10 minutos. A continuación, aplique la mezcla de sonda sobre un portaobjetos con cromosomas desnaturalizados. Cubra cuidadosamente el área con una cubeta de vidrio de 18 milímetros por 18 milímetros y elimine cualquier burbuja de aire visible presionando muy suavemente la cubeta contra el portaobjetos.Utilice cemento de goma para sellar los cuatro lados del cubreobjetos. Incube la preparación en la oscuridad, en una cámara humidificada a 37 grados Celsius durante 12 a 16 horas. Tras la hibridación, retire cuidadosamente el cemento de goma y el cubreobjetos, y coloque la preparación en SSC 0,4X precalentado a 74 grados Celsius durante cinco minutos.Luego transfiera el portaobjetos a la solución de lavado tres durante dos minutos. Añada 20 microlitros de medio de montaje antifade con contraste de DAPI sobre el portaobjetos y cúbralo con una laminilla de vidrio. Utilice papel de laboratorio para presionar suavemente la laminilla y eliminar cualquier burbuja de aire y exceso de medio de montaje.Luego, utilice esmalte de uñas para sellar los bordes del portaobjetos. Observe las preparaciones utilizando un microscopio fluorescente equipado con los filtros adecuados. Para la cariotipificación espectral de cromosomas de ratón, después de que las sondas se hibriden sobre los cromosomas desnaturalizados y las muestras se laven según el protocolo descrito, aplique 80 microlitros del reactivo de tinción SY5 sobre la preparación.Coloque un cubreobjetos de plástico de 24 por 60 milímetros encima de la muestra e incúbelo en la oscuridad en una cámara humidificada a 37 grados Celsius durante 40 minutos. Sumerja la laminilla en un frasco de vidrio tipo Coplin que contiene solución de lavado precalentada tres veces e incúbela en un baño de agua a 45 grados Celsius con agitación durante dos minutos. Repita el lavado tres veces.Aplique 80 microlitros del reactivo de tinción SY5.5 a la muestra, cúbrala con una cubreobjetos plástica de 24 por 60 milímetros e incube en la oscuridad en una cámara humedecida a 37 grados Celsius durante 40 minutos. Use la solución de lavado precalentada tres para lavar el portaobjetos tres veces, luego mantenga el portaobjetos en posición inclinada contra una toalla de papel para drenar el exceso de líquido. Añada 20 microlitros del reactivo antifade DAPI a la muestra y coloque cuidadosamente una cubreobjetos de vidrio encima sin introducir burbujas de aire.Utilice esmalte de uñas para sellar los bordes y observe la muestra con un microscopio de epifluorescencia equipado para capturar imágenes del cielo. Esta figura muestra extensiones representativas de células en metafase con pares normales y aberrantes de los cromosomas de ratón uno, dos y tres. Aquí se observa una aberración estable que involucra al cromosoma uno, en la que una parte del cromosoma uno se ha integrado en un cromosoma DAPI no teñido, mientras que otra parte ha formado un fragmento acéntrico.En este ejemplo, una parte del cromosoma dos se ha integrado en un cromosoma no marcado. Esta aberración estable involucra al cromosoma tres. En esta extensión de metafase se observan aberraciones estables que involucran a los tres cromosomas marcados.Se muestra aquí un ejemplo de cariotipificación espectral de un ratón hembra normal. Este panel representa una aberración estable que involucra los cromosomas cuatro y 12. Finalmente, la aberración cromosómica estable en este panel involucra los cromosomas siete y 10.Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en un período de 48 a 72 horas si se lleva a cabo correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que solo deben usarse células en proliferación. Siguiendo este procedimiento y otros métodos como el de banda, se pueden responder preguntas adicionales, como si existen aberraciones estables intercromosómicas en las células irradiadas.Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la citogenética molecular exploraran la asociación entre aberraciones genéticas y diversas enfermedades. Después de ver este video, debería tener una idea más clara sobre cómo determinar las aberraciones estables intercromosómicas. No olvide que trabajar con colchicina puede ser extremadamente peligroso porque es carcinógena, y siempre se deben tomar precauciones, como el uso de guantes, al realizar este experimento.

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Investigación

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Genetics

Genética

En este artículo se describe la selección de sondas adecuadas para una sola célula FISH, las técnicas de difusión de los núcleos de blastómeros, y la hibridación in situ y la puntuación de la señal, aplicadas al diagnóstico genético preimplantacional (DGP) en un entorno clínico.

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Cariotipo espectral (SKY) es una técnica de citogenética avanzada para identificar aberraciones genómicas y cromosómicas. Esta técnica se aprovecha de las sondas de pintado cromosómico, lo que permite la clasificación de todos los cromosomas. Sky también puede identificar aberraciones cromosómicas y defectos complejos de segregación en ratones y seres humanos con diversas enfermedades, incluyendo enfermedad renal poliquística.

Cariotipo espectral para el Estudio de anomalías cromosómicas en humanos y ratones con la enfermedad renal poliquística

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La detección de Inter-Aberraciones cromosómicas estables por fluorescencia múltiple In Situ La hibridación (mFISH) y cariotipo espectral (SKY) en ratones irradiados (Video) | JoVE Journal

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