Ingeniería penetran en las células de proteínas

La manipulación de la función celular se puede lograr a través de los enfoques clásicos de transfección de ADN o transducción viral en los últimos 15 años. Otro método evolucionó. La proteína activa biológica de transducción de proteínas se puede administrar directamente en las células de mamíferos utilizando pequeños péptidos fusionados con la proteína de interés, lo que promueve la absorción celular.

Al no utilizar ADN, se evita el riesgo de agenesia por esfuerzo. En contraste con los métodos clásicos antes mencionados. La transducción de proteínas permite la entrega de proteínas de una manera titulable.

Además, se pueden modular las poblaciones de células pequeñas, así como las células que no se dividen, como las neuronas postmitóticas. Para expresar la proteína recombinante de manera eficiente, recomendamos el uso del sistema vectorial Paciz. Es un sistema vectorial modular que consta de una variante de terminal final y una variante de terminal C.

Ambos vectores permiten la fácil inserción de su gen de interés para los medios de purificación. Se integra una etiqueta de histidina, así como un dominio de transducción de proteínas. En nuestro caso, el tacto del virus HI promueve la captación celular para la distribución celular.

Una señal de localización nuclear completa el vector por razones de control: las etiquetas de fusión pueden eliminarse fácilmente. Además, la disposición de esas etiquetas puede tener una gran influencia en las propiedades de las proteínas de fusión. La influencia sobre el rendimiento y la pureza, así como sobre la vendibilidad y la función biológica, no es predecible.

Hola, mi nombre es Bernard Mus y trabajo en el grupo de Ingeniería de Células Madre en el Instituto de Neurobiología Reconstructiva en Bond, Alemania. Hola, mi nombre es Christoph P y también soy miembro del Laboratorio Hoover. Nuestro grupo de trabajo explota intensamente la técnica de transducción de proteínas para administrar directamente proteínas activas biológicas en varias células de mamíferos, y hoy queremos guiarlo a través del proceso de expresión y purificación en y desde E. coli.

A partir de entonces, nos gustaría mostrarle cómo aplicar la proteína de fusión permanente celular en cultivo celular para ejemplificar todo el procedimiento de expresión, purificación y aplicación. Hacemos uso de la recombinación específica del sitio Cree para modificar genéticamente las células madre ónicas de ratón. Está bien.Está bien. Empecemos.

Para inocular el cultivo durante la noche, utilizamos bacterias ya transformadas almacenadas en un depósito de glicerol a menos 80 grados centígrados. Estas bacterias ya contienen el vector que codifica para la recombinación decre. Con una punta de piper, rascamos una pequeña cantidad de las bacterias en la punta de piper y la dejamos caer en el vaso de precipitados que contiene el cultivo durante la noche.

El cultivo nocturno consiste en medios LB suplementados con glucosa a una concentración final de 0,5% y 50 microgramos de insulina carbónica por ml. A continuación, el vaso de precipitados se coloca en una incubadora que funciona a 37 grados centígrados para la expresión del Cree recombinante específico del sitio. Estamos utilizando los medios de comunicación de la tuberculosis de antes de la guerra para nuestra cultura de expresión a gran escala.

Para acelerar la expresión, se recomienda el uso de medios de TB calentados hasta 37 grados centígrados, que representan la temperatura durante la expresión de la proteína recombinante. A continuación, añadimos glucosa al medio de TB a una concentración final de oh 0,5%La glucosa evita un aumento de la expresión basal de la proteína de fusión durante el crecimiento del cultivo de expresión antes de la inducción. Finalmente, la ampicilina se añade al cultivo de expresión a una concentración final de 100 microgramos por ml para asegurar un cultivo puro que sólo contenga las bacterias que aún albergan el plásmido que codifica para la proteína decreto.

Ahora podemos obtener nuestra cultura de la noche a la mañana e inocular la cultura de la expresión en una proporción de uno a 50. Luego, los vasos de precipitados se transfieren a una incubadora que funciona a una temperatura de 37 grados centígrados. Debe tomar muestras para medir la densidad óptica de forma regular a lo largo de la expresión.

Tan pronto como el cultivo ha alcanzado una densidad óptica de 1,5, las bacterias son inducidas con una concentración final de 0,5 milimolares de IPTG. Después de una hora de inducción, el cultivo de expresión se transfiere a tubos y posteriormente se cosecha mediante centrifugación. Para ello, estamos utilizando un rotor SLA 3000.

La centrífuga funciona a una velocidad de 5.000 rondas por minuto durante 10 minutos a cuatro grados anterógrados. Luego, el snat se desecha y la pastilla de bacterias se puede almacenar indefinidamente a menos 20 grados centígrados. Los pellets congelados se resuspenden en lizza buffer, una denominación correspondiente a un litro de cultivo de expresión.

Utilizamos 10 mls de tampón lizza, esperamos aproximadamente 15 minutos hasta que la solución se vuelva homogénea. A continuación, se añade un miligramo de lisozima por cada ML de suspensión. La solución se mezcla durante 20 minutos para permitir que la enzima rompa las bacterias.

Posteriormente, se agrega Benson Nase en una dilución de uno a 1000 durante 15 minutos adicionales, lo que cortará el ADN y dará como resultado una solución no viscosa. Por último, se utiliza un sonador para asegurar la lisis de las células. El programa está funcionando durante un minuto y medio con una potencia del 45% después de la finalización de la certificación.

Recuerde tomar una muestra de cada paso aquí, el lisado crudo o el análisis de la página SDS de la purificación. Ahora es muy importante añadir un ml de tampón TSB helado por ML de suspensión, ya que la proteína de decreto tenderá a precipitar dentro de las existencias de glicerol. Si va a omitir este paso, la solución se mezcla en breve y el crudo ya está listo para la centrifugación.

Para ello, utilizamos un rotor SS 34. La centrífuga funciona a 17.000 rpm durante 30 minutos a cuatro grados centígrados. Al terminar, centrifuge Inc transfirió cuidadosamente el sobrenadante S a tubos Falcon frescos de 50 ml.

Ahora agregue una suspensión de níquel anti A al níquel sobrenadante. Anti A es un reactivo crucial para la correcta purificación de las proteínas de fusión de la tecnología de histidina. La histidina forma un complejo con los iones de níquel, lo que permite la purificación por afinidad, ahora agite suavemente los tubos de estacionamiento durante 60 minutos a 40 grados centígrados.

Después de una hora, ahora puede aplicar la suspensión en columnas de 20 ML y permitir que la solución corra por gravedad. Para producciones a gran escala, es factible dividir la suspensión en varias columnas. A continuación, lavamos la columna dos veces con un tampón que contiene 15 milimolares de plantilla.

La cantidad de tampón aplicado depende del volumen de resina. Dos MLS de níquel NTA corresponden a un ml de resina para medios de lavado. Ponemos cinco volúmenes de resina de tampón de lavado en la columna después del lavado, ahora estamos listos para eludir nuestra proteína.

Por lo tanto, utilizamos un tampón de elución con una concentración de 250 milimolares de inmuno. Así que fíjate en cómo el color de la resina cambia hacia el verde. Debido a las altas concentraciones de la proteína CRE, la fracción OID a veces se convierte en excremento.

Para evitar esto, mezcle la solución y agregue tampón de lisis adicional, todas las fracciones ahora se agrupan y posteriormente se transfieren a un tubo de lisis. La lisis eliminará el primer paso del dializador se realiza contra el tampón que contiene una alta concentración de sal. Después de una hora, se cambia el tampón con alto contenido de sal y se aplica el procedimiento de diálisis durante la noche.

Al día siguiente, el tubo de diálisis se retira del tampón con alto contenido de sal y se transfiere a un tampón de glicerol. Después de tres a cinco horas, se cambia el tampón de glicerol y se vuelve a realizar la diálisis durante la noche. La lisis contra el tampón de glicerol dará como resultado una solución madre concentrada de al menos tres veces.

La solución madre ahora se puede almacenar a menos 20 grados centígrados durante varios años sin pérdida de actividad Para garantizar la calidad, puede cargar las muestras de página SDS recopiladas en un gel y teñirlas posteriormente. Para Kamasi, la proteína de fusión Cree es detectable como una banda prominente en la fracción OID. Para utilizar la concentración adecuada de recombinación de la tripulación, debe determinar la concentración mediante el ensayo Redford.

Cómo aplicar proteínas tan permanentes en células de mamíferos. En primer lugar, prepare sus células objetivo para lograr la máxima eficiencia en la transducción de proteínas. Vea las células monocapa a la densidad que da como resultado la capa de células de confluencia del 80 al 90% al día siguiente en caso de que sus células objetivo sean células sí, que se cultivan en colonias compactas.

Separe las células y somáticamente y véalas en una sola célula en suspensión con cinco horas de anticipación. Es importante hacer una suspensión de una sola célula antes de la transducción de proteínas porque, de lo contrario, solo se pueden transfundir las células de aire en la superficie de una colonia. Aspire los medios y observe brevemente las células de aire con PPS antes de intentar el tratamiento.

Retire los medios brutos restantes que contienen suero. Después de aspirar el PPS, superponga las células con goteo y déjelas incubar de tres a cinco minutos. Ahora verifique con el microscopio si todas las colonias se disuelven en células individuales.

Las razones que acabamos de mencionar, este es un paso crucial para la transducción de proteínas en células sí. Transfiera las células desprendidas a un tubo. Coloque el tubo en una mesa, centrifuga y haga girar las células hacia abajo, aspire el superagente y vuelva a suspender la célula.

El P en el medio de crecimiento diluye las células en un número de células apropiado. Eso, por supuesto, depende del tamaño del cultivo de tejidos. Plato incubar las celdas de aire durante cinco horas adicionales.

Esto le dará a las celdas de aire el tiempo suficiente para adherirse a la parte inferior y adherirse. Las hileras de tres clases se pueden almacenar a menos 20 grados durante más de dos años. Cuando se trabaja con proteínas de fusión permanente de células recombinantes, es muy beneficioso contar con una solución madre de este tipo que pueda utilizarse bajo demanda.

Mientras se espera que las células se adhieran a la placa, se puede preparar el medio de transducción C, simplemente diluyendo un volumen apropiado de proteína de arrastre permanente celular del caldo de colesterol en usted mismo. Medio. Dado que la solución madre de Clare aún no es estéril, los medios trans deben filtrarse estérilmente antes de su aplicación. Recomendamos usar una jeringa que se pueda enroscar en un filtro de unión a proteínas del lóbulo.

La concentración final del arroyo depende del tipo de célula o de los suplementos de medios. Por ejemplo, el suero tiene una fuerte influencia negativa en la eficiencia de la transducción. Esto se puede superar mediante el uso de medios libres de suero o mediante un aumento de la concentración de arroyo.

Encontramos la condición óptima que permite la máxima eficiencia de recombinación. Concentración de decreto de hidrato desde oh 0,5 hasta 10 micromolares. Recomendamos probar diferentes tiempos de incubación entre seis y 18 horas.

Después de cinco horas de incubación, extraiga las células objetivo y aspire los medios cruzados. Posteriormente, lo reemplazamos con un medio de transducción de proteínas, volvemos a colocar las células de aire en la incubadora después de la incubación nocturna. Se lavaron brevemente las células D con PPS y se cambió el medio de transducción de proteínas a un medio ES normal.

48 horas después de la incubación de la célula permanente, la expresión del gen del respiradero Cree se puede detectar a través de xul. Las células de tinción con fenotipo bega positivo han sido modificadas genéticamente con éxito mediante la recombinación específica del sitio. Cree en el informe.

Las células albergan CRE utilizan la construcción de Lae tras la recombinación premediada. Se extirpa una secuencia de parada del flanco P de bloqueo y se activa un gen reportero de lujo impulsado por el promotor del equipo. Con el fin de evaluar la eficiencia de la recombinación en las células de aire indicador pretratadas, las células deben fijarse.

Aspire las celdas de lavado de medios dos veces con celdas superpuestas de PBS con 4% de PFA e incube las celdas durante 10 minutos a temperatura ambiente. A partir de entonces, lave las celdas una vez más tres veces con PBS. Después de aspirar el PBS desde el último paso de lavado en la solución de Xal Stain a los pocillos, incube las células durante la noche a 37 grados en una incubadora.

Al día siguiente, la actividad de Beal puede ser monitoreada por células de cuello azul. La eficiencia de la recombinación se puede determinar por el número de colonias azules. En condiciones óptimas, debería poder lograr una eficiencia de recombinación superior al 90%Bien, hoy le hemos mostrado cómo expresar y purificar la recombinación de consultas específicas del sitio De e coli.

En este estudio de prueba de principio, pudimos inducir la recombinación en la mayoría de las sales. Está bien, eso es todo. Buena suerte con tus Experimentos.I.