Ingeniería penetran en las células de proteínas

La manipulación de la función celular puede lograrse mediante los enfoques clásicos de transfección de ADN o transducción viral en los últimos 15 años. Otra técnica ha evolucionado. La proteína biológicamente activa puede entregarse directamente en células de mamífero utilizando péptidos pequeños fusionados a la proteína de interés, lo que promueve la absorción celular.

Como no se utiliza ADN, se evita el riesgo de agenesia por esfuerzo. A diferencia de los métodos clásicos mencionados anteriormente, la transducción de proteínas permite la entrega de proteínas de manera titulable.

Además, pueden modularse poblaciones celulares pequeñas así como células no divididas, como neuronas posmitóticas. Para expresar proteínas recombinantes de manera eficiente, recomendamos el uso del sistema de vectores Paciz. Es un sistema modular que consta de una variante terminal N y una variante terminal C.

Ambos vectores permiten la inserción sencilla de su gen de interés con fines de purificación. Se integra una etiqueta de histidina, así como un dominio de transducción proteica. En nuestro caso, contacto con el virus HI que promueve la absorción celular para la distribución celular.

Una señal de localización nuclear completa el vector por razones de control; las etiquetas de fusión pueden eliminarse simplemente. Además, la disposición de estas etiquetas puede tener una influencia importante en las propiedades de las proteínas de fusión. La influencia sobre el rendimiento y la pureza, así como sobre la comercialización y la función biológica, no es predecible.

Hola, mi nombre es Bernard Mus y trabajo en el grupo de Ingeniería de Células Madre del Instituto de Neurobiología Reconstructiva en Bonn, Alemania. Hola, mi nombre es Christoph P y también soy miembro del Laboratorio Hoover. Nuestro grupo de trabajo utiliza intensivamente la técnica de transducción proteica para entregar directamente proteínas biológicamente activas en diversas células de mamíferos, y hoy queremos guiarte a través del proceso de expresión y purificación en y a partir de E. coli.

Posteriormente, nos gustaría mostrarle cómo aplicar la proteína de fusión celular permanente en cultivo celular para ejemplificar todo el procedimiento de expresión, purificación y aplicación. Hacemos uso de la recombinación específica de sitio Cre para modificar genéticamente células madre epiteliales de ratón. Muy bien. Muy bien. Comencemos.

Para inocular el cultivo nocturno, utilizamos bacterias ya transformadas almacenadas en un stock de glicerol a menos 80 grados centígrados. Estas bacterias ya contienen el vector que codifica para la recombinación decre. Mediante una punta de pipeta, raspamos una pequeña cantidad de las bacterias sobre la punta de pipeta y la depositamos en el vaso que contiene el cultivo nocturno.

El cultivo nocturno consiste en medio LB suplementado con glucosa a una concentración final de 0,5% y 50 microgramos de insulina carbónica por ml. Luego, el vaso de precipitados se coloca en un incubador a 37 grados centígrados para la expresión del Recombinante Cree específico del sitio. Estamos utilizando medio TB precalentado para nuestro cultivo de expresión a gran escala.

Para acelerar la expresión, recomendamos el uso de medio TB precalentado a 37 grados centígrados, que representa la temperatura durante la expresión de la proteína recombinante. A continuación, agregamos glucosa al medio TB hasta una concentración final de 0,5%. La glucosa evita un aumento en la expresión basal de la proteína de fusión durante el crecimiento del cultivo de expresión antes de la inducción. Finalmente, se añade ampicilina al cultivo de expresión hasta una concentración final de 100 microgramos por ml para asegurar un cultivo puro que contenga únicamente las bacterias que aún portan el plásmido que codifica para la proteína decree.

Ahora podemos obtener nuestra cultura de crecimiento nocturno e inocular la cultura de expresión en una proporción de uno a 50. Luego, los vasos se transfieren a un incubador que funciona a una temperatura de 37 centígrados. Debe tomar muestras para medir la densidad óptica de forma regular durante toda la expresión.

En cuanto el cultivo alcance una densidad óptica de 1.5, las bacterias se inducen con una concentración final de 0,5 milimolar de IPTG. Después de una hora de inducción, el cultivo de expresión se transfiere a tubos y posteriormente se recoge mediante centrifugación. Para este fin, estamos utilizando un rotor SLA 3000.

La centrífuga gira a una velocidad de 5.000 vueltas por minuto durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Luego, se descarta el sobrenadante y el pellet bacteriano se puede almacenar indefinidamente a menos 20 grados centígrados. Los pellets congelados se resuspenden en tampón lizza, un tampón equivalente a un litro de cultivo de expresión.

Utilizamos 10 ml de tampón lizza y esperamos aproximadamente 15 minutos hasta que la solución se vuelva homogénea. Luego se añade un miligramo de lisozima por cada ml de suspensión. La solución se mezcla durante 20 minutos para permitir que la enzima rompa las bacterias.

Posteriormente, se agrega Benson Nase en una dilución de uno a 1000 durante 15 minutos adicionales, lo que cortará el ADN resultando en una solución no viscosa. Finalmente, se utiliza un sonador para asegurar la lisis de las células. El programa se ejecuta durante un minuto y medio con una potencia del 45 % tras la finalización de la certificación.

Recuerde tomar una muestra de cada paso aquí, el lisado crudo o el análisis por electroforesis SDS-PAGE de la purificación. Ahora es muy importante añadir 1 ml de tampón TSB frío por ml de suspensión, ya que la proteína decree tiende a precipitar dentro del stock de glicerol. Si va a omitir este paso, mezcle brevemente la solución y el lisado ya está listo para la centrifugación.

Para este propósito, utilizamos un rotor SS 34. La centrífuga gira a 17.000 RPM durante 30 minutos a cuatro grados centígrados. Una vez finalizado, se transfiere cuidadosamente el sobrenadante S a tubos Falcon nuevos de 50 ml.

Ahora agregue la suspensión de níquel anti A al sobrenadante con níquel. Anti A es un reactivo crucial para la purificación adecuada de las proteínas de fusión con etiqueta de histidina. La histidina forma un complejo con los iones de níquel, lo que permite la purificación por afinidad. Ahora agite suavemente los tubos durante 60 minutos a 40 grados centígrados.

Después de una hora, ahora puede aplicar la suspensión sobre columnas de 20 ML y dejar que la solución pase por flujo gravitacional. Para producciones a gran escala, es factible dividir la suspensión en varias columnas. Luego lavamos la columna dos veces con un tampón que contiene 15 milimolares de innersole.

La cantidad de tampón aplicada depende del volumen de resina. Dos MLS de níquel NTA corresponden a un ml de resina para fines de lavado. Colocamos cinco volúmenes de resina del tampón de lavado en la columna; después del lavado, ahora estamos listos para eluir nuestra proteína.

Por lo tanto, utilizamos un tampón de elución con una concentración de 250 milimolares de inmuno. Observe cómo el color de la resina cambia hacia el verde. Debido a las altas concentraciones de la proteína CRE, la fracción OID a veces se vuelve turbia.

Para evitar esto, mezcle la solución y agregue tampón de lisis adicional; ahora se reúnen todas las fracciones y posteriormente se transfieren a un tubo de lisis. La lisis eliminará el ole. El primer paso de diálisis se realiza frente al tampón que contiene una alta concentración de sal. Después de una hora, se cambia el tampón de alta salinidad y se aplica el procedimiento de diálisis durante la noche.

Al día siguiente, se retira el tubo de diálisis del tampón con alto contenido salino y se transfiere a un tampón de glicerol. Después de tres a cinco horas, se cambia el tampón de glicerol y se realiza nuevamente la diálisis durante la noche. La lisis frente al tampón de glicerol dará como resultado una solución stock concentrada al menos tres veces.

La solución stock ya puede almacenarse a menos 20 grados centígrados durante varios años sin pérdida de actividad. Para garantizar la calidad, puede cargar las muestras recogidas de SDS-PAGE sobre un gel y teñirlas posteriormente. En el caso de Kamasi, la proteína de fusión Cree es detectable como una banda prominente en la fracción OID. Con el fin de utilizar la concentración adecuada de recombinación de crew, debe determinar la concentración mediante el ensayo de Redford.

Cómo aplicar proteínas permanentes en células de mamífero. En primer lugar, prepare sus células diana para lograr las máximas eficiencias de transducción proteica. Observe las células en monocapa a una densidad que dé como resultado una capa celular del 80 al 90 % de confluencia al día siguiente, en caso de que sus células diana sean células yes, que se cultivan en colonias compactas.

Separar las células somáticas y observarlas en una suspensión de células individuales cinco horas de antelación. Es importante preparar una suspensión de células individuales antes de la transducción proteica, ya que de lo contrario solo las células superficiales de una colonia podrán ser transfundidas. Aspirar el medio y lavar brevemente las células aéreas con PPS antes del tratamiento.

Elimine el medio Yes, grueso, que contiene suero. Después de aspirar las células con la capa superior de PPS gota a gota, déjelas incubar de tres a cinco minutos. Ahora, compruebe con el microscopio si todas las colonias se han disuelto en células individuales.

Por las razones mencionadas anteriormente, este es un paso crucial para la transducción proteica en células yes. Transfiera las células desprendidas a un tubo. Coloque el tubo en una centrífuga y centrifugue para sedimentar las células. Aspire el sobrenadante y resuspenda la célula.

P en medio de crecimiento diluya las células a un número adecuado. Esto, por supuesto, depende del tamaño del cultivo de tejidos. Incube las células en placa durante cinco horas adicionales.

Esto dará a las células aéreas tiempo suficiente para adherirse al fondo y crecer de forma adherente. El stock de tres líneas celulares puede almacenarse a menos 20 grados durante más de dos años. Cuando se trabaja con proteína de fusión permanente recombinante, es muy beneficioso contar con una solución stock como esta que pueda usarse según sea necesario.

Mientras se espera a que las células se adhieran al recipiente, se puede preparar el medio de transducción C diluyendo simplemente un volumen apropiado de proteína permanente de células procedente del stock de colesterol en el medio. Dado que la solución stock de Clare aún no es estéril, el medio de transducción debe filtrarse estérilmente antes de su uso. Recomendamos utilizar una jeringa que pueda atornillarse a un filtro de unión a proteínas de lóbulo.

La concentración final de creek depende del tipo de célula o de los suplementos del medio. Por ejemplo, el suero tiene una fuerte influencia negativa sobre la eficiencia de transducción. Esto puede superarse utilizando un medio sin suero o aumentando la concentración de creek.

Encontramos la condición óptima que permite la mayor eficiencia de recombinación. Hidrate la concentración del decreto desde 0,5 hasta 10 micromolares. Recomendamos probar diferentes tiempos de incubación entre seis y 18 horas.

Después de cinco horas de incubación, retire las células diana y aspire el medio cruzado. Posteriormente, reemplácelo con medio de transducción proteica y coloque nuevamente las células en el incubador tras una incubación nocturna. Lave brevemente las células D con PPS y cambie el medio de transducción proteica por medio ES normal.

48 horas después de la incubación de células, la expresión génica permanente de Cree puede detectarse mediante xul. Las células teñidas con fenotipo positivo para bega han sido exitosamente modificadas genéticamente mediante recombinación específica de sitio. Cree el informe.

Las células albergan la construcción CRE-Lae tras la recombinación mediada por pre. Se excinde una secuencia de parada flanqueada por P y se activa un gen reportero luxe controlado por el promotor team. Con el fin de evaluar la eficiencia de recombinación en células aéreas reporteras tratadas con pre, es necesario fijar las células.

Aspire el medio y lave las células dos veces con PBS, cubra las células con PFA al 4 % y incube las células durante 10 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente, lave las células nuevamente tres veces con PBS. Después de aspirar el PBS del último paso de lavado, añada la solución de tinción Xal a los pocillos e incube las células durante la noche a 37 grados en un incubador.

Al día siguiente, la actividad Beal se puede monitorear mediante células con collar azul. La eficiencia de recombinación se puede determinar por el número de colonias azules. En condiciones óptimas, debería poder alcanzar una eficiencia de recombinación superior al 90 %. Muy bien, hoy les hemos mostrado cómo expresar y purificar la recombinación específica de sitio de consulta a partir de e coli.

En este estudio de prueba de principio, pudimos inducir recombinación en la mayoría de las sales. Bueno, eso es todo. Buena suerte con sus experimentos.I.