Name: Ingeniería penetran en las células de proteínas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 21 min 8 s
Description: Aprende la transducción de proteínas para manipular células mamíferas sin modificación genética permanente usando péptidos de fusión. Este método permite la entrega titulable de proteínas en neuronas post-mitóticas.

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Damos las gracias a Oliver Brüstle y todos los miembros del Grupo de Ingeniería madre Celular de la Universidad de Bonn, de apoyo y las valiosas discusiones. Damos las gracias a Sabine Schenk para la preparación de la SDS-PAGE y el apoyo permanente durante todo el proyecto. Nicole Russ y Magerhans Anna proporcionan un excelente soporte técnico. Además, nos gustaría agradecer a Andreas Bär y Sheila Mertens para la producción de la película. Este trabajo fue apoyado por becas de la Fundación Volkswagen (Az I/77864) y el Ministerio Alemán de Educación e Investigación (BMBF, 01 GN 0813).

La construcción del vector de expresión y la expresión: El vector de expresión pSESAME-Cre se construyó mediante la inserción de un fragmento de Cre-codificación en pSESAME a través de sitios de restricción NheI AvrII y con los métodos estándar de clonación. pSESAME codifica una proteína de fusión que consiste en una etiqueta de histidina, TAT-dominio, la secuencia NLS y Cre, abreviado HTNCre. Para la expresión de la HTNCre pSESAME Cre-se transformó en TUNER (DE3) Placi y se utiliza para preparar un stock de glicerol. <ol><li> Una cultura durante la noche fueron inoculados con una punta de pipeta recubiertas con bacterias transformadas a partir de las acciones de glicerol. La cultura a lo largo de la noche consistió en medio LB suplementado con 0,5% de glucosa [v / v] y carbenicilina a una concentración final de 50 mcg / ml y se dejó crecer a 37 ° C durante 16 horas. </li><li> Al día siguiente, la densidad crecido durante la noche cultural se utilizó para inocular la cultura de expresión en una proporción de 1 a 40, y fue colocado en una incubadora a 37 ° C. La cultura la expresión de los medios de comunicación consistió en TB suplementado con 0,5% de glucosa [v / v] y la ampicilina a una concentración final de 100 mg / ml. </li><li> En una OD 595 de 1,5 expresión de la cultura fue inducida con IPTG 0,5 mM durante 1 h. </li><li> Posteriormente, las bacterias se recogieron por centrifugación a 5000 rpm durante 10 minutos en un rotor SLA3000. </li><li> Pellets de bacterias fueron almacenadas a -20 ° C hasta la purificación. </li></ol> Purificación de proteínas penetran en las células: <ol><li> Pellets de bacterias congeladas se resuspendieron en 10 ml de solución amortiguadora de lisis por la cultura frasco de litro por 15 minutos a temperatura ambiente. </li><li> La suspensión se incubó con 1 mg / ml de lisozima para otros 15 minutos mientras se mezcla a temperatura ambiente. </li><li> 25 U / mL benzonasa se añadió más tarde y se incubaron durante la mezcla durante 15 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Después de sonificación en hielo durante 1,5 minutos a 0,5 s pulsos a 45% de la potencia, 1 ml de tampón enfriado sal tartárico (TSB) por ml de suspensión se añadió cuidadosamente mientras se mezcla y se incubó durante 5 min en hielo. SDS-PAGE de muestras de la fracción de lisado (L) fue tomada. </li><li> Lisado aclarado se obtuvo por centrifugación a 4 º C durante 30 minutos a 30.000 g. SDS-PAGE de muestras de las fracciones soluble (S) e insoluble (I) se tomaron. </li><li> El sobrenadante fue transferido a nuevos tubos Falcon de 50 ml y se mezcla suavemente durante 1 hora a 4 ° C con 2 ml de 50% de Ni-NTA suspensión por litro de cultivo expresión inicial. </li><li> La suspensión se empaquetó en una columna de flujo por gravedad EconoPac (SDS-PAGE muestra de flujo a través de la fracción (FT) fue tomada) y se lavó dos veces con 5 cama volúmenes de tampón de lavado. SDS-PAGE de muestras de las dos fracciones de lavado (W1 y W2) se recogieron. </li><li> HTNCre que contienen fracciones se eluyeron con 3 dormitorios, volúmenes de tampón de elución de la muestra y de la fracción de eluido (E) para el análisis de SDS-PAGE fue tomada. </li><li> Imidazol fue eliminado por diálisis frente a tampón de elución de la fracción de sal dos veces. </li><li> La solución de proteína se concentró aún más por diálisis frente a tampón de glicerol en dos ocasiones. En todas las etapas de diálisis la relación de amortiguamiento para la muestra fue por lo menos 50. Este procedimiento dio lugar a una solución madre que contiene glicerol HTNCre a una concentración normal de entre 200 y 450 micras, es decir, 1 litro de cultivo de la expresión se traducirá en aproximadamente 12 mg de proteína. Muestra de las acciones de glicerol (GS) para análisis SDS-PAGE se recogieron. HTNCre solución de archivo puede ser almacenado a menos 20 ° C. </li></ol><img border="0" src="/files/ftp_upload/1627/1627fig1tmb.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1: SDS-PAGE análisis de las muestras recogidas durante el proceso de purificación de la recombinasa Cre. Inducción de la expresión de Cre se indica por la banda dominante en la fracción de lisado. Aunque una parte de la proteína es la proteína insoluble Cre puede enriquecer como se ve en eluido y fracciones de glicerol de valores. L: Lisado, I: S insoluble,: sobrenadante, FT: de flujo continuo, W: Lavado, E: eluido, GS: Foto Gylcerol. Por favor, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1627/1627fig1.jpg">haga clic aquí</a> para ver una versión ampliada de la figura 1. Proteína de transducción en madre embrionarias murinas (ES) las células: <ol><li> Células madre embrionarias que lleva un condicional β-galactosidasa reportero construir cinco fueron sembradas como células individuales usando TrypLE ™ Express para la disociación de las células adherentes. Después de 4 a 6 horas, las células se habían re-unido y el medio fue removido. </li><li> Posteriormente, las células ES fueron incubadas con HTNCre medio que contiene de 16 horas. <ul><li> Una cantidad adecuada de proteínas HTNCre (correspondiente a 10 M) de las acciones de glicerol se diluyó en medio de ES y se filtró posteriormente estéril (0,22 m). </li></ul></li><li> Después de medio proteína de transducción fue cambiado de nuevo al medio de crecimiento normal. </li><li> Después de dos días las células fueron lavadas con PBS y fijadas con 4% paraformaldehído (PFA) durante 10 minutos. </li><li> Dos aditradicionales etapas de lavado con PBS fueron ejecutados antes de X-Gal tinción se realizó. </li><li> Las células fijadas fueron cubiertos con una capa de solución de tinción X-Gal 6, y se incubó durante la noche a 37 ° C. </li></ol> Los resultados representativos: Al día siguiente, X-Gal solución de tinción fue aspirado y las células se cubrieron con una capa de PBS para el análisis de microscopía. 80 a 100% de las células recombinadas se puede observar dentro de las células madre embrionarias murinas juzgar por la actividad β-galactosidasa.

<ol><li>Gump, J. M., Dowdy, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAT+transduction%3A+the+molecular+mechanism+and+therapeutic+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">TAT transduction: the molecular mechanism and therapeutic prospects.</a> Trends Mol Med. 13 (10), 443-448 (2007).</li>
<li>Edenhofer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+transduction+revisited%3A+novel+insights+into+the+mechanism+underlying+intracellular+delivery+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Pharm+Des%22%5BJournal%5D)">Protein transduction revisited: novel insights into the mechanism underlying intracellular delivery of proteins.</a> Curr Pharm Des. 14 (34), 3628-3636 (2008).</li>
<li>Branda, C. S., Dymecki, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Talking+about+a+revolution%3A+The+impact+of+site-specific+recombinases+on+genetic+analyses+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Talking about a revolution: The impact of site-specific recombinases on genetic analyses in mice.</a> Dev Cell. 6 (1), 7-28 (2004).</li>
<li>Nolden, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+recombination+in+human+embryonic+stem+cells+induced+by+cell-permeant+Cre+recombinase%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Site-specific recombination in human embryonic stem cells induced by cell-permeant Cre recombinase.</a> Nat Methods. 3 (6), 461-467 (2006).</li>
<li>Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+site-directed+recombination+in+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Inducible site-directed recombination in mouse embryonic stem cells.</a> Nucleic Acids Res. 24 (4), 543-548 (1996).</li>
<li>Peitz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+purification+of+cell-permeant+Cre+and+germline+transmission+after+transduction+into+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Enhanced purification of cell-permeant Cre and germline transmission after transduction into mouse embryonic stem cells.</a> Genesis. 45 (8), 508-517 (2007).</li>
<li>Bosnali, M., Edenhofer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+transducible+versions+of+transcription+factors+Oct4+and+Sox2%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Generation of transducible versions of transcription factors Oct4 and Sox2.</a> Biol Chem. 389 (7), 851-861 (2008).</li>
<li>Landry, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Runx+genes+are+direct+targets+of+Scl%2FTal1+in+the+yolk+sac+and+fetal+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Runx genes are direct targets of Scl/Tal1 in the yolk sac and fetal liver.</a> Blood. 111 (6), 3005-3014 (2008).</li>
</ol>

Durante el proceso de purificación de la proteína de fusión Cre que es importante no omitir la adición de hielo frío buffer TBS antes de la centrifugación. De lo contrario la recombinasa Cre tiende a precipitar en el búfer de glicerol. Si la fracción de eluido parece enturbiarse debido a la alta concentración de tampón de elución de proteínas de fusión se debe agregar hasta que la solución haya desaparecido de nuevo. La aplicación de 10 mM de proteína de fusión Cre generalmente resulta en una eficiencia de la recombinación de 80 a 100%. Suero fetal bovino (FCS) es un componente importante del medio de células ES inhibe fuertemente la transducción de las proteínas. Por lo tanto, alta concentración de la recombinasa Cre tuvo que ser utilizado. Cuando se trabaja en condiciones libres de suero menos proteínas (0,5 a 2 M) se puede utilizar para lograr eficiencias similares recombinación. Con el sistema de vector pSESAME a mano se puede aplicar la técnica de la transducción de la proteína con otras proteínas incluyendo factores de transcripción como Oct4 y Sox2 7 y 8 Scl/Tal1.

<table><tbody><tr><td>TUNER (DE3) pLacI</td><td>Novagen, EMD Millipore</td><td>70625</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>3783.2</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Carl Roth Gmbh</td><td>T876.1</td><td></td></tr><tr><td>Base Trizma</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Carl Roth Gmbh</td><td>4625.1</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Carl Roth Gmbh</td><td>X998.4</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Carl Roth Gmbh</td><td>9265.2</td><td></td></tr><tr><td>Extracto de levadura</td><td>Carl Roth Gmbh</td><td>2363.4</td><td></td></tr><tr><td>Trypton/Peptona</td><td>Carl Roth Gmbh</td><td>8952.4</td><td></td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; </td><td>Carl Roth Gmbh</td><td>P749.2</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Carl Roth Gmbh</td><td>3904.1</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicilina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6344.2</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Lisozima</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>62971</td><td></td></tr><tr><td>Benzonasa</td><td>Novagen, EMD Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ácido L-tártarico, sal disódica</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Almazón al 50% Ni-NTA</td><td>Invitrogen</td><td>R901-15</td><td></td></tr><tr><td>Columnas EconoPac</td><td>Bio-Rad</td><td>732-1010</td><td></td></tr><tr><td>Filtro estéril de 0,22&amp;mu;m</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Medio LB</td><td></td><td></td><td>Extracto de levadura, Trypton/Peptona, NaCl</td></tr><tr><td>Medio TB</td><td></td><td></td><td>Extracto de levadura, Trypton/Peptona, Glicerol, K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Tampón de lisis</td><td></td><td></td><td>50 mM Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 5 mM Tris, pH 7.8</td></tr><tr><td>Tampón de sal de tártaro (TSB)</td><td></td><td></td><td>PTB que contiene 2 M de ácido L-tártarico, sal disódica, y 20 mM de imidazol</td></tr><tr><td>Tampón de lavado</td><td></td><td></td><td>PTB, 500 mM NaCl, 15 mM Imidazol</td></tr><tr><td>Tampón de elución</td><td></td><td></td><td>PTB, 500 mM NaCl, 250 mM Imidazol</td></tr><tr><td>Tampón de alta salinidad</td><td></td><td></td><td>600 mM NaCl, 20 mM HEPES, pH 7.4</td></tr><tr><td>Tampón de glicerol</td><td></td><td></td><td>50% glicerol, 500 mM NaCl, 20 mM HEPES, pH 7.4</td></tr><tr><td>TrypLE&amp;#8482; Express</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ESGRO (LIF)</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11140035</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-Mercapt&amp;#8211;etanol</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>31350010</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11960044</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Suero de feto bovino (FCS)</td><td>PAA Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solución de tinción con X-Gal:</td><td></td><td></td><td>4 mM K&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;(FeIII(CN)&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;), 4 mM K&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;(FeII(CN)&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;),&lt;br/&gt;2 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 0,4 mg/mL X-Gal disuelto en PBS</td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;(FeIII(CN)&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-3367</td><td></td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (FeII(CN)&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-9387</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>X-Gal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4252</td><td></td></tr></tbody></table>

ingeniería penetran en las células de proteínas

Engineering Cell-permeable Protein

La técnica de la transducción de la proteína permite la entrega directa de material biológicamente activo en células de mamífero [para una revisión véase 1,2]. Para esto se puede hacer uso de la capacidad de translocación de los péptidos de células llamadas penetrantes (CPP), designado también como dominios de la proteína de transducción (PTDs). El TAT-CPP derivan del tipo de virus de inmunodeficiencia humana 1 (VIH-1) Tat (trans-activador de la transcripción) de la proteína ha sido ampliamente utilizado. La carga positiva TAT promueve la permeabilidad celular superando así las barreras de la membrana celular por endocitosis y / o penetración de la membrana directa 2. En combinación con una señal de localización nuclear (NLS) de proteínas de fusión son capaces de entrar en el núcleo de la funcionalidad de exhibición. Nuestra presentación en video demuestra, como un ejemplo para la ingeniería de proteínas penetran en las células, la construcción, producción y aplicación de una versión penetran en las células del ADN Cre-modificando la enzima. Cre recombinasa es un sitio específico que es capaz de reconocer y recombinar base de 34 sitios loxP par en células de mamíferos in vitro e in vivo. Por lo tanto el sistema Cre / loxP es ampliamente utilizado para inducir condicional mutaciones en el genoma de 3,4 células vivas. La entrega de los activos de la recombinasa Cre en las células, sin embargo, representa una limitación. Se describe el sistema de vectores pSESAME, lo que permite una inserción directa del gen de interés, y ofrece una plataforma para clonar rápidamente los diferentes dominios y las etiquetas utilizadas en el vector de una manera conveniente y estandarizada. Reordenación de las diferentes etiquetas se ha demostrado que modificar las propiedades bioquímicas de las proteínas de fusión proporciona la posibilidad de lograr un mayor rendimiento y una mejor solubilidad. Demostramos cómo expresar y purificar recombinante de células permeables en proteínas y de E. coli. La funcionalidad de la proteína recombinante Cre es finalmente validada en el cultivo celular mediante la evaluación de su actividad recombinasa intracelular.

Transducción de la proteína permite la entrega directa de proteínas biológicamente activas en las células. En contraste con los métodos convencionales, tales como la transfección de ADN o transducción viral de este paradigma no invasiva permite la manipulación celular de alta eficiencia de una manera valorable eludir la toxicidad celular y el riesgo de la transformación oncogénica de la modificación genética permanente.

Ingeniería penetran en las células de proteínas

La técnica de transducción de proteínas permite la entrega directa de material biológicamente activo en células de mamíferos [para una revisión, véanse 1,2]. Para ello, se puede...

La manipulación de la función celular puede lograrse mediante los enfoques clásicos de transfección de ADN o transducción viral en los últimos 15 años. Otra técnica ha evolucionado. La proteína biológicamente activa puede entregarse directamente en células de mamífero utilizando péptidos pequeños fusionados a la proteína de interés, lo que promueve la absorción celular.Como no se utiliza ADN, se evita el riesgo de agenesia por esfuerzo. A diferencia de los métodos clásicos mencionados anteriormente, la transducción de proteínas permite la entrega de proteínas de manera titulable.Además, pueden modularse poblaciones celulares pequeñas así como células no divididas, como neuronas posmitóticas. Para expresar proteínas recombinantes de manera eficiente, recomendamos el uso del sistema de vectores Paciz. Es un sistema modular que consta de una variante terminal N y una variante terminal C.Ambos vectores permiten la inserción sencilla de su gen de interés con fines de purificación. Se integra una etiqueta de histidina, así como un dominio de transducción proteica. En nuestro caso, contacto con el virus HI que promueve la absorción celular para la distribución celular.Una señal de localización nuclear completa el vector por razones de control; las etiquetas de fusión pueden eliminarse simplemente. Además, la disposición de estas etiquetas puede tener una influencia importante en las propiedades de las proteínas de fusión. La influencia sobre el rendimiento y la pureza, así como sobre la comercialización y la función biológica, no es predecible.Hola, mi nombre es Bernard Mus y trabajo en el grupo de Ingeniería de Células Madre del Instituto de Neurobiología Reconstructiva en Bonn, Alemania. Hola, mi nombre es Christoph P y también soy miembro del Laboratorio Hoover. Nuestro grupo de trabajo utiliza intensivamente la técnica de transducción proteica para entregar directamente proteínas biológicamente activas en diversas células de mamíferos, y hoy queremos guiarte a través del proceso de expresión y purificación en y a partir de E. coli.Posteriormente, nos gustaría mostrarle cómo aplicar la proteína de fusión celular permanente en cultivo celular para ejemplificar todo el procedimiento de expresión, purificación y aplicación. Hacemos uso de la recombinación específica de sitio Cre para modificar genéticamente células madre epiteliales de ratón. Muy bien. Muy bien. Comencemos.Para inocular el cultivo nocturno, utilizamos bacterias ya transformadas almacenadas en un stock de glicerol a menos 80 grados centígrados. Estas bacterias ya contienen el vector que codifica para la recombinación decre. Mediante una punta de pipeta, raspamos una pequeña cantidad de las bacterias sobre la punta de pipeta y la depositamos en el vaso que contiene el cultivo nocturno.El cultivo nocturno consiste en medio LB suplementado con glucosa a una concentración final de 0,5% y 50 microgramos de insulina carbónica por ml. Luego, el vaso de precipitados se coloca en un incubador a 37 grados centígrados para la expresión del Recombinante Cree específico del sitio. Estamos utilizando medio TB precalentado para nuestro cultivo de expresión a gran escala.Para acelerar la expresión, recomendamos el uso de medio TB precalentado a 37 grados centígrados, que representa la temperatura durante la expresión de la proteína recombinante. A continuación, agregamos glucosa al medio TB hasta una concentración final de 0,5%. La glucosa evita un aumento en la expresión basal de la proteína de fusión durante el crecimiento del cultivo de expresión antes de la inducción. Finalmente, se añade ampicilina al cultivo de expresión hasta una concentración final de 100 microgramos por ml para asegurar un cultivo puro que contenga únicamente las bacterias que aún portan el plásmido que codifica para la proteína decree.Ahora podemos obtener nuestra cultura de crecimiento nocturno e inocular la cultura de expresión en una proporción de uno a 50. Luego, los vasos se transfieren a un incubador que funciona a una temperatura de 37 centígrados. Debe tomar muestras para medir la densidad óptica de forma regular durante toda la expresión.En cuanto el cultivo alcance una densidad óptica de 1.5, las bacterias se inducen con una concentración final de 0,5 milimolar de IPTG. Después de una hora de inducción, el cultivo de expresión se transfiere a tubos y posteriormente se recoge mediante centrifugación. Para este fin, estamos utilizando un rotor SLA 3000.La centrífuga gira a una velocidad de 5.000 vueltas por minuto durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Luego, se descarta el sobrenadante y el pellet bacteriano se puede almacenar indefinidamente a menos 20 grados centígrados. Los pellets congelados se resuspenden en tampón lizza, un tampón equivalente a un litro de cultivo de expresión.Utilizamos 10 ml de tampón lizza y esperamos aproximadamente 15 minutos hasta que la solución se vuelva homogénea. Luego se añade un miligramo de lisozima por cada ml de suspensión. La solución se mezcla durante 20 minutos para permitir que la enzima rompa las bacterias.Posteriormente, se agrega Benson Nase en una dilución de uno a 1000 durante 15 minutos adicionales, lo que cortará el ADN resultando en una solución no viscosa. Finalmente, se utiliza un sonador para asegurar la lisis de las células. El programa se ejecuta durante un minuto y medio con una potencia del 45 % tras la finalización de la certificación.Recuerde tomar una muestra de cada paso aquí, el lisado crudo o el análisis por electroforesis SDS-PAGE de la purificación. Ahora es muy importante añadir 1 ml de tampón TSB frío por ml de suspensión, ya que la proteína decree tiende a precipitar dentro del stock de glicerol. Si va a omitir este paso, mezcle brevemente la solución y el lisado ya está listo para la centrifugación.Para este propósito, utilizamos un rotor SS 34. La centrífuga gira a 17.000 RPM durante 30 minutos a cuatro grados centígrados. Una vez finalizado, se transfiere cuidadosamente el sobrenadante S a tubos Falcon nuevos de 50 ml.Ahora agregue la suspensión de níquel anti A al sobrenadante con níquel. Anti A es un reactivo crucial para la purificación adecuada de las proteínas de fusión con etiqueta de histidina. La histidina forma un complejo con los iones de níquel, lo que permite la purificación por afinidad. Ahora agite suavemente los tubos durante 60 minutos a 40 grados centígrados.Después de una hora, ahora puede aplicar la suspensión sobre columnas de 20 ML y dejar que la solución pase por flujo gravitacional. Para producciones a gran escala, es factible dividir la suspensión en varias columnas. Luego lavamos la columna dos veces con un tampón que contiene 15 milimolares de innersole.La cantidad de tampón aplicada depende del volumen de resina. Dos MLS de níquel NTA corresponden a un ml de resina para fines de lavado. Colocamos cinco volúmenes de resina del tampón de lavado en la columna; después del lavado, ahora estamos listos para eluir nuestra proteína.Por lo tanto, utilizamos un tampón de elución con una concentración de 250 milimolares de inmuno. Observe cómo el color de la resina cambia hacia el verde. Debido a las altas concentraciones de la proteína CRE, la fracción OID a veces se vuelve turbia.Para evitar esto, mezcle la solución y agregue tampón de lisis adicional; ahora se reúnen todas las fracciones y posteriormente se transfieren a un tubo de lisis. La lisis eliminará el ole. El primer paso de diálisis se realiza frente al tampón que contiene una alta concentración de sal. Después de una hora, se cambia el tampón de alta salinidad y se aplica el procedimiento de diálisis durante la noche.Al día siguiente, se retira el tubo de diálisis del tampón con alto contenido salino y se transfiere a un tampón de glicerol. Después de tres a cinco horas, se cambia el tampón de glicerol y se realiza nuevamente la diálisis durante la noche. La lisis frente al tampón de glicerol dará como resultado una solución stock concentrada al menos tres veces.La solución stock ya puede almacenarse a menos 20 grados centígrados durante varios años sin pérdida de actividad. Para garantizar la calidad, puede cargar las muestras recogidas de SDS-PAGE sobre un gel y teñirlas posteriormente. En el caso de Kamasi, la proteína de fusión Cree es detectable como una banda prominente en la fracción OID. Con el fin de utilizar la concentración adecuada de recombinación de crew, debe determinar la concentración mediante el ensayo de Redford.Cómo aplicar proteínas permanentes en células de mamífero. En primer lugar, prepare sus células diana para lograr las máximas eficiencias de transducción proteica. Observe las células en monocapa a una densidad que dé como resultado una capa celular del 80 al 90 % de confluencia al día siguiente, en caso de que sus células diana sean células yes, que se cultivan en colonias compactas.Separar las células somáticas y observarlas en una suspensión de células individuales cinco horas de antelación. Es importante preparar una suspensión de células individuales antes de la transducción proteica, ya que de lo contrario solo las células superficiales de una colonia podrán ser transfundidas. Aspirar el medio y lavar brevemente las células aéreas con PPS antes del tratamiento.Elimine el medio Yes, grueso, que contiene suero. Después de aspirar las células con la capa superior de PPS gota a gota, déjelas incubar de tres a cinco minutos. Ahora, compruebe con el microscopio si todas las colonias se han disuelto en células individuales.Por las razones mencionadas anteriormente, este es un paso crucial para la transducción proteica en células yes. Transfiera las células desprendidas a un tubo. Coloque el tubo en una centrífuga y centrifugue para sedimentar las células. Aspire el sobrenadante y resuspenda la célula.P en medio de crecimiento diluya las células a un número adecuado. Esto, por supuesto, depende del tamaño del cultivo de tejidos. Incube las células en placa durante cinco horas adicionales.Esto dará a las células aéreas tiempo suficiente para adherirse al fondo y crecer de forma adherente. El stock de tres líneas celulares puede almacenarse a menos 20 grados durante más de dos años. Cuando se trabaja con proteína de fusión permanente recombinante, es muy beneficioso contar con una solución stock como esta que pueda usarse según sea necesario.Mientras se espera a que las células se adhieran al recipiente, se puede preparar el medio de transducción C diluyendo simplemente un volumen apropiado de proteína permanente de células procedente del stock de colesterol en el medio. Dado que la solución stock de Clare aún no es estéril, el medio de transducción debe filtrarse estérilmente antes de su uso. Recomendamos utilizar una jeringa que pueda atornillarse a un filtro de unión a proteínas de lóbulo.La concentración final de creek depende del tipo de célula o de los suplementos del medio. Por ejemplo, el suero tiene una fuerte influencia negativa sobre la eficiencia de transducción. Esto puede superarse utilizando un medio sin suero o aumentando la concentración de creek.Encontramos la condición óptima que permite la mayor eficiencia de recombinación. Hidrate la concentración del decreto desde 0,5 hasta 10 micromolares. Recomendamos probar diferentes tiempos de incubación entre seis y 18 horas.Después de cinco horas de incubación, retire las células diana y aspire el medio cruzado. Posteriormente, reemplácelo con medio de transducción proteica y coloque nuevamente las células en el incubador tras una incubación nocturna. Lave brevemente las células D con PPS y cambie el medio de transducción proteica por medio ES normal.48 horas después de la incubación de células, la expresión génica permanente de Cree puede detectarse mediante xul. Las células teñidas con fenotipo positivo para bega han sido exitosamente modificadas genéticamente mediante recombinación específica de sitio. Cree el informe.Las células albergan la construcción CRE-Lae tras la recombinación mediada por pre. Se excinde una secuencia de parada flanqueada por P y se activa un gen reportero luxe controlado por el promotor team. Con el fin de evaluar la eficiencia de recombinación en células aéreas reporteras tratadas con pre, es necesario fijar las células.Aspire el medio y lave las células dos veces con PBS, cubra las células con PFA al 4 % y incube las células durante 10 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente, lave las células nuevamente tres veces con PBS. Después de aspirar el PBS del último paso de lavado, añada la solución de tinción Xal a los pocillos e incube las células durante la noche a 37 grados en un incubador.Al día siguiente, la actividad Beal se puede monitorear mediante células con collar azul. La eficiencia de recombinación se puede determinar por el número de colonias azules. En condiciones óptimas, debería poder alcanzar una eficiencia de recombinación superior al 90 %. Muy bien, hoy les hemos mostrado cómo expresar y purificar la recombinación específica de sitio de consulta a partir de e coli.En este estudio de prueba de principio, pudimos inducir recombinación en la mayoría de las sales. Bueno, eso es todo. Buena suerte con sus experimentos.I.

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Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Este video analiza el ensayo de fuga de fluorescencia para estudiar las interacciones de los péptidos que penetran en las células con las membranas celulares utilizando imitadores de membranas celulares: grandes vesículas unilaminares, o LUV, encapsuladas con un tinte fluorescente y un extintor.

Ensayo de fuga de fluorescencia para estudiar la interacción del péptido que penetra en las células con la membrana

Muchas aplicaciones terapéuticas requieren un transporte seguro y eficiente de los portadores de fármacos y sus cargas a través de barreras celulares en el cuerpo. En este artículo se describe una adaptación de los métodos establecidos para evaluar la tasa y el mecanismo de transporte de nanovehículos drogas (NCS) a través de barreras celulares, tales como el tracto gastrointestinal (GI) epitelio.

Modelos y métodos para evaluar el transporte de Drug Delivery Systems a través de barreras celulares

El transistor orgánico electroquímico está integrado con células vivas y se utiliza para controlar el flujo de iones a través de la barrera epitelial intestinal. En este estudio, un incremento en el flujo de iones, relacionados con la alteración de las uniones estrechas, inducida por la presencia de la EGTA quelante de calcio (ácido etilenglicol-bis (beta-aminoetil éter)-N, N, N ', N'-tetra acético ácido), se mide.

Detección de barrera interrupción del tejido con un transistor orgánico Electroquímica

Esta presentación demuestra un método mediante el cual la electroporación de células adherentes y cultivadas se utiliza para el estudio de la comunicación intercelular y de unión, mientras las células crecen en un portaobjetos recubierto con óxido de indio-estaño conductor y transparente.

Un ensayo funcional para Gap Junctional examen; La electroporación de células adherentes de indio-óxido de estaño

La electroporación se utilizó para insertar proteínas efectoras de virulencia bacteriana purificadas directamente en células eucariotas vivas. La localización de proteínas se monitorizó mediante microscopía de inmunofluorescencia confocal. Este método permite estudiar el tráfico, la función y las interacciones proteína-proteína utilizando proteínas exógenas activas, evitando la necesidad de expresión heteróloga en células eucariotas.

La electroporación de efectores bacterianos funcionales en células de mamífero

Aquí, presentamos un protocolo para determinar la orientación y topología de las proteínas integrales de membrana en células vivas. Este sencillo protocolo se basa en la sensibilidad selectiva de las quimeras a la proteasa entre la proteína de interés y la GFP.

La determinación de la proteína de membrana de topología usando fluorescencia de Protección de la proteasa (FPP)

El protocolo presentado describe el análisis del transporte mediado por proteínas de membrana a nivel de transportador único utilizando bicapas lipídicas sin disolventes que atraviesan poros. Esto se logra mediante la creación de chips de matriz de nanoporos producidos a granel, combinados con la adquisición y el análisis de datos altamente paralelos, lo que permite el establecimiento futuro de cribados de efectores de proteínas de membrana.

Membrana de transporte de procesos analizados por un sistema de nanoporos viruta altamente paralela a la Resolución de la proteína individual

Aquí se presentan dos métodos para determinar la función de barrera intestinal. Un medidor epitelial (voltios/ohmios) se utiliza para la medición de la resistencia eléctrica transepitelial de epitelio cultivado directamente en los pocillos de cultivo de tejidos. En ratones, el método de sonda de FITC-los dextranos se utiliza para determinar la permeabilidad intestinal en vivo.

In Vitro e In Vivo métodos para determinar la permeabilidad de la célula epitelial Intestinal

El ensayo de fuga de fluorescencia es un método simple que permite la investigación de las interacciones péptido/membrana con el fin de comprender su participación en varios procesos biológicos y especialmente la capacidad de los péptidos que penetran en las células para alterar las bicapas de fosfolípidos durante un proceso de translocación celular directa.

Ensayo de fuga fluorescente para investigar la desestabilización de la membrana por péptido que penetra en las células

Este protocolo describe las técnicas de microfabricación necesarias para construir un dispositivo de electroporación microfluídica de laboratorio en un chip. La configuración experimental realiza transfecciones controladas a nivel de una sola célula en un flujo continuo y se puede extender a rendimientos más altos con control basado en la población. Se proporciona un análisis que muestra la capacidad de monitorear eléctricamente el grado de permeabilización de la membrana celular en tiempo real.

La fabricación y operación de un sistema de microelectroporación de flujo continuo con detección de permeabilización

La electroporación de sustratos porosos (PSEP) combina una entrega consistente y de alto rendimiento con una alta viabilidad de celda. La introducción de las mediciones de impedancia eléctrica transepitelial (TEEI) proporciona información sobre los procesos intermedios de PSEP y permite la entrega sin etiquetas. Este artículo discute un método para realizar experimentos de entrega de PSEP y análisis de medición TEEI simultáneamente.

Electroporación basada en sustrato poroso con monitoreo de impedancia eléctrica transepitelial

Aprende la transducción de proteínas para manipular células mamíferas sin modificación genética permanente usando péptidos de fusión. Este método permite la entrega titulable de proteínas en neuronas post-mitóticas.

Ingeniería penetran en las células de proteínas

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