Método para Refolding eficiente y la purificación del quimioreceptor ligando vinculante dominio

El objetivo general de este procedimiento es volver a plegar un dominio de unión a un ligando quimiorreceptor de cuerpos de inclusión y purificarlo para su uso en estudios estructurales y funcionales. Para establecer qué señales envía un quimiorreceptor bacteriano y cómo, se pueden utilizar los dominios de unión de ligandos aislados para contrastar bibliotecas de moléculas pequeñas o para determinar la estructura con y sin ligando. La epresión del dominio de unión al ligando extracelular en E. coli a menudo resulta en la deposición en cuerpos de inclusión.

Aquí, mostramos cómo se pueden recuperar miligramos de proteína funcional de los cuerpos de inclusión. Para empezar, inocular 150 mL de caldo LB estéril que contenga 50 microgramos por mL de ampicilina con células BL21-CodonPlus RIPL transformadas con el vector pET151 D-TOPO para la expresión de hexahistidina TIp3-LBD. Incubar el cultivo a 200 RPM y 37 grados centígrados durante la noche.

Prepare seis matraces Erlenmeyer de 2 litros que contengan 800 ml de caldo LB estéril y 50 microgramos por ml de ampicilina. Inocular cada matraz con 20 mL del cultivo durante la noche. Incubar los matraces a 37 grados centígrados con agitación continua a 200 RPM hasta que el OD600 alcance 0,6.

En este punto, induzca la expresión de proteínas mediante la adición de 1 milimolar IPTG a cada matraz. Continúe incubando los matraces a 37 grados centígrados en un agitador a 200 RPM durante cuatro horas adicionales. Cosechar las células por centrifugación a 5000 xg y cuatro grados centígrados durante 15 minutos.

Luego, desecha el sobrenadante. Transfiera todos los gránulos de celdas a un vaso de precipitados de 250 mL y agregue 100 mL de tampón A. Si está congelado, deje que las celdas se descongelen por completo y luego vuelva a suspender el pellet. Mantenga la muestra en hielo a menos que se indique lo contrario.

A continuación, pase las células resuspendidas a través de un homogeneizador de alta presión tres veces para lisar las células y asegurar el cizallamiento completo del ADN genómico. A continuación, centrifugar el lisado a 10.000 xg y cuatro grados centígrados durante 15 minutos. Recoja una muestra de un ml del sobrenadante y guárdela a menos 20 grados Celsius para su posterior análisis SDS-PAGE.

Luego, deseche el resto del sobrenadante y coloque la bolita sobre hielo. A continuación, vuelva a suspender completamente el pellet de los cuerpos de inclusión en 20 mL de tampón B helado. Esto facilita la solubilización de la membrana y las proteínas de la membrana. Agite la muestra durante uno o dos minutos para ayudar en la resuspensión.

Después de centrifugar la muestra, vuelva a suspender completamente el pellet en 20 ml de tampón B helado primero vortexting el tubo durante uno o dos minutos. Asegúrese de que el pellet esté roto en pedazos pequeños. A continuación, pipetea la muestra hacia arriba y hacia abajo para volver a suspenderla.

Centrifugar la muestra como antes y desechar el sobrenadante. Si el sobrenadante está turbio o coloreado, vuelva a centrifugar la muestra y utilice un tampón B helado adicional para volver a suspenderlo. Repita la centrifugación y la resuspensión hasta que el sobrenadante esté claro e incoloro antes de volver a peletizar.

Agregue 20 mL de tampón C helado al pellet y vuelva a suspenderlo agitando el tubo en vórtice durante uno o dos minutos. Luego, después de girar la muestra, agregue 25 mL de tampón desnaturalizante frío como hielo D. Vuelva a suspender completamente el pellet de cuerpos de inclusión mediante un vórtice en el tubo durante uno o dos minutos o hasta que el pellet se rompa en pedazos pequeños. Mezcle la suspensión por rotación axial a 30 RPM y 4 grados centígrados durante 30 a 120 minutos.

Clarificar la solución de proteína desnaturalizada por centrifugación a 30, 000 xg y cuatro grados centígrados durante 30 minutos. Luego, coloque el sobrenadante en hielo y deseche el pellet. Mientras remueve 250 mL de tampón E a 500 RPM, agregue 60 miligramos de mezcla de proteínas desnaturalizadas que contenga hexahistadina TIp3-LBD.

Incubar la mezcla de repliegue a cuatro grados centígrados con agitación continua a 500 RPM durante 24 a 48 horas. La concentración final de proteína es de 0,2 mg por mL. Después de preparar siete L de tampón A preenfriado y el tubo de diálisis de acuerdo con el protocolo de texto, use el cierre del tubo de diálisis para sujetar un extremo de la membrana de diálisis y transferir la mezcla de diálisis al tubo.

Luego, sujete el extremo abierto y asegúrese de que no haya fugas. Coloque el tubo de diálisis en un cubo de diálisis con el tampón A preenfriado. Luego, agregue una barra de agitación magnética, asegurándose de que no toque el tubo de diálisis mientras agita. Diálisar la muestra a cuatro grados centígrados con agitación continua a 500 rpm y cambiar el tampón al menos cuatro veces durante un período de 12 horas.

Después del último cambio de tampón, deje que la muestra se dialice durante la noche. A la mañana siguiente, retire el tubo de diálisis del cubo y transfiera su contenido a un vaso de precipitados de 500 ml. Mantenga la solución de proteína en hielo a menos que se indique lo contrario.

Filtre la solución de proteína a través de una membrana del tamaño de un poro de 0,43 micras en una botella de vidrio de 500 ml para eliminar cualquier proteína precipitada. Después de lavar, cargar y equilibrar una columna quelante de acuerdo con el protocolo de texto, ajuste la muestra de proteína replegada obtenida a la composición de Buffer F agregando 25 mL de cloruro de sodio 5 M, 2,5 mL de tris-HCl 1 M, pH 8,0 y 2,5 mL de soluciones madre de imidazol 2 M. Cargue la muestra en la columna a una velocidad de 5 mL por minuto o menos y deseche el flujo que contiene las proteínas no unidas.

A continuación, lave la columna con 50 a 100 ml de tampón F para eliminar las proteínas no unidas específicamente y desechar el flujo. Eluir la hexahistadina TIp3-LBD con 25 mL de tampón G. A continuación, agrupar las fracciones de flujo que contienen la proteína. Después de preparar el tampón H y el tubo de diálisis de acuerdo con el protocolo de texto, agregue la proteasa TEV marcada con hexahistadina a la proteína marcada con hexahistadina en el tubo.

Agregue una proporción molar final de un TEV por ocho de proteína. Coloque el tubo de diálisis con pinza en los cuatro L preenfriados de tampón H e incube a cuatro grados centígrados con agitación continua durante dos horas. Luego, cambie el tampón y continúe la diálisis durante la noche para permitir que se complete la reacción de escisión mediada por TEV.

Después de cambiar a Buffer I, filtrar la solución de proteína y ajustar la muestra nuevamente, cargue la muestra en una columna HP quelante HiTrap preparada de cinco mL. A un caudal de cinco ml por minuto, recoja el flujo que contiene el TIp3-LBD sin etiquetar. En la proteína escindida, la columna retiene la etiqueta de hexahistadina escindida y el TEV de hexahistadina.

Utilice cinco ml de tampón F para lavar la columna y permitir que la proteína no marcada fluya y recoja el eluido. Luego, después de equilibrar una columna de exclusión de tamaño y concentrar y clarificar la muestra de proteína de acuerdo con el protocolo de texto, cargue la muestra en la columna de filtración de gel 26/60 preequilibrada. Aplique el tampón A a un caudal de cuatro ml por minuto y controle la traza UV para la elución de proteínas.

TIp3-LBD eluye a un volumen de retención de 210 a 220 mL. Finalmente, después de la cromatografía, agrupe las fracciones, mida la concentración de proteínas y realice SDS-PAGE. El procedimiento de aislamiento de proteínas demostrado en este video produjo de 10 a 20 mg de TIp3-LBD puro sin marcar por un L de cultivo bacteriano.

Como se ve aquí, la proteína eluida de la columna de filtración de gel tiene un solo pico simétrico, correspondiente a un volumen de retención de 220 mL con un peso molecular calculado de 29 kDa. Como se muestra aquí por SDS-PAGE, los cuerpos de inclusión contenían predominantemente hexahistadina TIp3-LBD con un peso molecular aparente de 28 kDa, que está cerca del valor calculado a partir de la secuencia de aminoácidos de 31,8 kDa. La eliminación de la etiqueta de hexahistadina, la cromatografía de afinidad y los pasos de filtración en gel produjeron proteínas de alta pureza.

La espectroscopia de CD con CDSSTR reveló que la estructura secundaria de la hexahistidina TIp3-LBD estaba compuesta por un 31% de contenido de alfa-hélice y un 23% de beta-hoja. Estos también estuvieron cerca de los valores pronosticados de 37% y 26% respectivamente del análisis de secuencia utilizando el servidor JPred 3. Este protocolo requiere un mínimo de cinco días de principio a fin, y se puede pausar si es necesario en tres etapas diferentes.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que la resuspensión completa y minuciosa de los cuerpos de inclusión en el tampón de desnaturalización mediante vórtice o pipeteo hacia arriba y hacia abajo es fundamental para toda esta realización. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo replegar y purificar el dominio de unión al ligando del quimiorreceptor TIp3. La proteína purificada se puede utilizar para unirse a ácidos para investigar la especificidad del ligando para este receptor.

Además, hemos demostrado previamente que la proteína obtenida por este procedimiento podría utilizarse para producir cristales altamente ordenados, y eso allanó el camino para los estudios de las bases estructurales de su especificidad de ligando. Este procedimiento podría ser generalmente útil para la producción de cantidades de mg de quimiorreceptores de otras bacterias en una forma cristalizable y soluble. Hemos utilizado este protocolo en su forma original o ligeramente modificada para replegar y purificar el dominio de unión al ligando de otros quimiorreceptores de este tipo para estudios cristalográficos.

Recuerde que, en cada caso por separado, es probable que sea necesaria la optimización del protocolo, por ejemplo, la composición de los tampones de desnaturalización y repliegue y los tiempos de incubación.