Ensayo de actividad enzimática basado en cromatografía en capa fina: una técnica para determinar la actividad de la pirofosfoquinasa in vitro mediante cromatografía en capa fina

La pirofosfoquinasa cataliza la transferencia de difosfato o pirofosfato del precursor de nucleótidos, como el trifosfato de adenosina, ATP, al sustrato como el difosfato de guanosina, GDP. Esto forma tetrafosfato de guanosina, una importante molécula de señalización.

Para determinar la actividad de la pirofosfoquinasa, prepare una mezcla de reacción que comprenda GDP y ATP radiomarcados en un tampón adecuado suplementado con cloruro de magnesio. Agregue la cantidad deseada de pirofosfoquinasa a la mezcla de reacción e incube.

Con el tiempo, en presencia de iones de magnesio, la pirofosfoquinasa comienza a transferir la fracción de pirofosfato radiomarcada de ATP a GDP, produciendo guanosina tetrafosfato radiactivo.

Ahora, tome una cromatografía de capa delgada o TLC, placa prerecubierta con polietilenimina-celulosa, una fase estacionaria a base de polímeros catiónicos. Localice las alícuotas de los analitos de la mezcla de reacción cerca de la base de la placa TLC en diferentes puntos de tiempo para detener la reacción y evaluar el progreso.

Sumerja la placa en una cámara de vidrio que contenga fosfato de potasio monobásico, un disolvente de fase móvil. A medida que el frente del