Ensayo de actividad enzimática basado en cromatografía en capa fina: una técnica para determinar la actividad de la pirofosfoquinasa in vitro mediante cromatografía en capa fina

La pirofosfoquinasa cataliza la transferencia de difosfato o pirofosfato del precursor de nucleótidos, como el trifosfato de adenosina, ATP, al sustrato como el difosfato de guanosina, GDP. Esto forma tetrafosfato de guanosina, una importante molécula de señalización.

Para determinar la actividad de la pirofosfoquinasa, prepare una mezcla de reacción que comprenda GDP y ATP radiomarcados en un tampón adecuado suplementado con cloruro de magnesio. Agregue la cantidad deseada de pirofosfoquinasa a la mezcla de reacción e incube.

Con el tiempo, en presencia de iones de magnesio, la pirofosfoquinasa comienza a transferir la fracción de pirofosfato radiomarcada de ATP a GDP, produciendo guanosina tetrafosfato radiactivo.

Ahora, tome una cromatografía de capa delgada o TLC, placa prerecubierta con polietilenimina-celulosa, una fase estacionaria a base de polímeros catiónicos. Localice las alícuotas de los analitos de la mezcla de reacción cerca de la base de la placa TLC en diferentes puntos de tiempo para detener la reacción y evaluar el progreso.

Sumerja la placa en una cámara de vidrio que contenga fosfato de potasio monobásico, un disolvente de fase móvil. A medida que el frente del disolvente se mueve hacia arriba, los analitos cargados negativamente comienzan a migrar en función de sus afinidades con la fase estacionaria cargada positivamente.

Las diferencias en las cargas negativas y el peso de los analitos fosforilados de manera diferente determinan su migración relativa en la placa TLC, lo que les permite inmovilizarse como bandas distintas.

A medida que el frente del disolvente alcance la distancia deseada, retire la placa y seque al aire. Mida la intensidad de la señal radiactiva, correspondiente al agotamiento de ATP marcado radiactivamente y la acumulación de guanosina tetrafosfato para analizar la actividad de la pirofosfoquinasa.

Antes de realizar la reacción, prepare placas de cromatografía de capa delgada de PEI-celulosa lavándolas en agua desionizada. Colocar las placas en una cámara de vidrio con agua doble destilada, a una profundidad de aproximadamente 0,5 centímetros. Después de permitir que el agua migre a la parte superior del plato, saque los platos de la cámara de vidrio y déjelos secar durante la noche en una rejilla de sobremesa.

Marque las placas secas a 2 centímetros de un borde con un lápiz suave, para indicar dónde se aplicarán las muestras para TLC. Para muestras de 2 microlitros, aplique muestras a una distancia no inferior a 1 centímetro. Al planificar experimentos, deje siempre un lugar en cada placa sin usar, para que sirva como un carril en blanco para la cuantificación de la muestra.

Para realizar el ensayo de actividad enzimática, prepare reacciones individuales utilizando ^γ-32P-ATP, como se describe en el protocolo de texto. Agregue el RSH después de que se hayan mezclado los otros componentes, ya que la adición de RSH a la mezcla que contiene nucleótidos inicia el ensayo de actividad enzimática.

Para controlar la hidrólisis de ATP de la actividad de la nucleasa contaminante, ensamble una reacción de 10 microlitros que no contenga proteínas e incube en paralelo. Detecte muestras de 2 microlitros en t = 0, y al final del experimento para asegurarse de que el ATP no se hidrolizó en ausencia de proteínas.

Inmediatamente después de la adición de RSH, retire 2 microlitros y colóquelo en la placa de PEI-celulosa etiquetada como la muestra t = 0 minutos.

Incube la reacción a 37 grados centígrados, eliminando 2 alícuotas de microlitros en los puntos de tiempo deseados. Después de que se hayan recolectado todas las alícuotas, realice una cromatografía en capa delgada llenando la cámara de cromatografía con fosfato de potasio monobásico de 1,5 molares a una profundidad de 0,5 centímetros. Sumerja el borde inferior de la placa en disolvente y deje que el disolvente migre a la parte superior de la placa durante aproximadamente 90 minutos.

Retire la placa del tanque de cromatografía y colóquela en una rejilla de secado de sobremesa para que se seque al aire durante la noche. Una vez que la placa esté seca, envuélvala en una película de plástico para evitar la transferencia de material radiactivo al casete de imágenes y analícela mediante autorradiografía.

Exponga la placa de PEI-celulosa que contiene reacciones separadas a un casete de fosforimagen durante cuatro horas a temperatura ambiente. Después de la exposición, obtenga una imagen del casete en un generador de imágenes de fósforo.

Usando software de imágenes con una interfaz gráfica de usuario, dibuje regiones de interés o ROI, seleccionando primero "Dibujar rectángulo". Luego, use el mouse para dibujar ROI rectangulares alrededor de un carril completo y las manchas de ATP y tetrafosfato de guanosina contenidas dentro de ese carril.

Utilice los comandos "Seleccionar, Copiar y Pegar" para dibujar ROI idénticos dentro de los otros carriles, para asegurarse de que los ROI midan señales dentro de áreas idénticas en cada carril. Incluya ROI de un carril no utilizado para usarlos como espacios en blanco.

Usando el comando "Analizar | Herramientas | Gerente de ROI | Agregar" del software de imágenes, seleccione todos los ROI dibujados en la placa de PEI-celulosa. Ahora, use el comando "Analizar | Establecer medidas | Medir" para cuantificar la intensidad de la señal dentro de cada ROI y exportar las mediciones como una hoja de cálculo. En la hoja de cálculo, reste los valores de ROI en blanco de las señales experimentales.