Multimer-PAGE para separar complejos de proteínas nativas: una técnica de separación híbrida que consiste en Blue Native-PAGE y SDS-PAGE para separar proteínas multiméricas intactas del lisado de tejidos.

Los complejos proteicos multiméricos son esenciales para diversos procesos biológicos.

Para separar los complejos de proteínas en su estado nativo mediante multimer-PAGE, tome lisado de tejidos que contenga los complejos deseados. Cargue el lisado en un conjunto de gel para Blue native PAGE.

Llene el sistema con un tampón alcalino que contenga colorante aniónico azul y conéctelo a la fuente de alimentación. A un pH alcalino, las moléculas de colorante se unen al complejo proteico impartiéndole una carga negativa general sin desnaturalizarse. Este complejo proteico intacto y cargado negativamente migra a través del gel como una banda azul.

Después de una ejecución mínima, y permitiendo que la proteína intacta migre al gel de resolución, extirpe la tira que contiene el complejo. Incube la tira en una solución que contenga un agente de reticulación para permitir que sus grupos reactivos interactúen con los grupos amina de la proteína proximal, estabilizando el complejo multimérico.

Reemplace la solución de reticulación con un reactivo de enfriamiento para disminuir la actividad de los reticulantes no reaccionados. Agregue SDS, un detergente aniónico, que imparte una carga negativa uniforme al complejo de proteínas intactas mientras conserva su tamaño y composición nativos.

Coloque la tira tratada en un casete nuevo y vuelva a moldearla en un nuevo gel SDS-PAGE. Durante la electroforesis, el complejo proteico reticulado cargado negativamente migra hacia el ánodo positivo y aparece como una banda de alto peso molecular en el gel.

Para comenzar este procedimiento, prepárese para la electroforesis en gel de poliacrilamida nativa azul, como se describe en el protocolo de texto. Conecte los electrodos a la fuente de alimentación y electroforese las proteínas en el gel a 150 voltios, hasta que la banda de tinte progrese aproximadamente 2 centímetros hacia la capa de resolución. En este punto, detenga y desconecte la fuente de alimentación.

Después de desmontar el aparato de electroforesis, separe los paneles de vidrio del casete de gel. Retire y deseche la capa de apilamiento.

Corta con cuidado el gel, justo debajo del borde inferior del frente del tinte, teniendo cuidado de que este corte sea lo más suave y recto posible. Luego, deseche el trozo de gel sin usar. Recorta las porciones no utilizadas a lo largo de los bordes de la tira de gel.

Coloque con cuidado la tira en 10 mililitros de solución salina tamponada con fosfato en un recipiente pequeño y mezcle suavemente con nutación durante 30 minutos para equilibrar. Después del equilibrio, deseche y reemplace el PBS con otros 10 mililitros.

Pipetear 500 microlitros de DSP de 25 milimolares disueltos en dimetilsulfóxido en el PBS y continuar mezclando como antes, durante 30 minutos. Después de 30 minutos, vierta la solución DSP. Agregue 10 mililitros de Tris-HCl molar 0.375, pH 8.8, que contenga dodecil sulfato de sodio al 2%, para apagar el DSP sin reaccionar. Continúe la nutación durante 15 minutos.

Mientras la tira de gel se enfría, prepare soluciones de gel SDS-PAGE de acuerdo con los métodos estándar. No agregue los reactivos de polimerización. Después de enfriar, vuelva a colocar la tira de gel nativo azul a temperatura ambiente y colóquela en un nuevo casete de gel.

Para hacer esto, levante con cuidado el gel y colóquelo en una placa espaciadora de casete de gel limpia. Oriente la tira de modo que se voltee de su orientación anterior y la parte inferior del frente de tinte esté más cerca de la parte superior del nuevo casete.

Coloque la tira de manera que su borde superior quede al mismo nivel que el borde superior de la placa de cubierta. Asegúrese de que el frente del tinte esté paralelo a los bordes horizontales de la placa de vidrio. Empuje un lado de la tira extirpada contra una de las paredes espaciadoras, dejando espacio en el otro lado para verter el gel y cargar un estándar de proteína o una escalera. Si el borde inferior de la tira de gel contiene áreas irregulares o irregulares, córtelas con cuidado.

Una vez que la tira de gel esté colocada correctamente, coloque la placa de cubierta sobre la placa espaciadora. Aplique una presión suave para expulsar las burbujas de aire atrapadas. Continúe montando el aparato de vertido de gel, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

La tira de gel a veces se mueve cuando se coloca la placa superior. Ayuda dejar que la tira cuelgue un poco sobre el borde de la placa superior, por lo que se puede ajustar con una espátula para corregir cualquier cambio.

Agregue reactivos de polimerización al tampón de gel de resolución y viértalo en el casete de gel preparado con una pipeta serológica. Llene el casete de gel hasta aproximadamente 2 centímetros por debajo de la tira de gel PAGE nativa azul extirpada para dejar espacio para la capa de apilamiento. Luego, agregue 100 microlitros de butanol sobre la parte superior del gel vertido y espere 30 minutos para la polimerización de la capa de resolución antes de verter el butanol.

A continuación, agregue los reactivos de polimerización a la solución de gel de apilamiento. Con una pipeta serológica, vierta la capa de apilamiento para llenar todos los espacios vacíos restantes en el casete de gel. Incline el casete de gel a medida que se vierte la capa de apilamiento, de modo que llene el espacio debajo de la tira de gel y no queden atrapadas las burbujas de aire.

A medida que el tampón de gel apilable llena el espacio vacío debajo de la tira de gel, vuelva gradualmente a colocar el casete de gel nivelado. Continúe llenando el espacio vacío al lado de la tira de gel extirpada con el tampón de gel apilable, hasta que casi se desborde. Luego, deje que la capa de apilamiento se polimerice durante 30 minutos.

Después de que la capa de apilamiento se haya polimerizado, retire el casete de gel del aparato de vertido, enjuáguelo con agua destilada y ensamble el aparato de electroforesis, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Llene completamente la cámara interior con 1X SDS-PAGE búfer de funcionamiento. Luego, llene la cámara exterior hasta el nivel indicado por el fabricante. Cargue el espacio junto a la tira de gel extirpada con una escalera de peso molecular o el estándar de proteína apropiado.

Conecte los electrodos a la fuente de alimentación y electroforese las muestras a 120 voltios. Cuando el tinte Coomassie se escurra fuera del gel, detén la carrera y desconecta la fuente de alimentación. Analice el gel utilizando métodos estándar de electrotransferencia y detección de proteínas basadas en anticuerpos.