La combinación de reticulación química y espectrometría de masas de complejos de proteína intacta para el estudio de la arquitectura de multi-subunidades proteína asambleas

El objetivo general de combinar la reticulación con la espectrometría de masas nativa es obtener información estructural complementaria sobre ensamblajes de proteínas de múltiples subunidades que ayude a dilucidar su disposición tridimensional. La reticulación química y la espectrometría de masas nativa ayudan a responder a preguntas clave de la biología estructural, como la composición, la conectividad y la estequiometría. La principal ventaja de combinar varias técnicas es que se obtiene información complementaria que no se obtiene con una sola técnica.

Nuestro flujo de trabajo se puede aplicar a cualquier otro complejo proteico. Se puede purificar a partir de sales o tejidos o que se pueden reconstituir a partir de proteínas purificadas. En primer lugar, aplique 7,5 microlitros de tampón simple cuádruple y tres microlitros de agente reductor 10 veces al complejo proteico deseado.

Gire la muestra durante un minuto a 16, 200 veces la gravedad. Después de la centrifugación, caliente la muestra durante 10 minutos a 70 grados centígrados. Prepare un gel con un gradiente de cuatro a 12% para la electroforesis y coloque el gel en la cámara de electroforesis.

Diluir el tampón de funcionamiento previamente preparado 20 veces con agua y llenar la cámara de electroforesis. A continuación, añade 0,5 mililitros de antioxígeno a la cámara interior. Cargue un marcador de proteína adecuado en la primera cavidad del gel y las muestras de proteína en las cavidades restantes.

Luego, separe las proteínas durante la cantidad de tiempo adecuada a 200 voltios. Para teñir las bandas de proteínas, transfiera el gel a una caja de tinción de gel y cubra el gel con una solución de pie de Coomassie a base de agua. Incuba el gel durante la noche a temperatura ambiente en un agitador de gel horizontal.

Al día siguiente, elimine las manchas del gel reemplazando la solución de tinción con agua. Repita el paso anterior aproximadamente de tres a cinco veces hasta que el fondo de gel aparezca claro. Ahora, corte las bandas de proteínas que se visualizan por la tinción azul de Coomassie de los geles con un bisturí.

Corta con cuidado las bandas de proteína en trozos pequeños de aproximadamente un mililitro por uno. A continuación, lave las bandas de proteínas con agua y acetonitrilo. Reducir los enlaces disulfuro con DTT, y luego alquilar los residuos de cisteína con yodoacetamida.

Después de esto, digiera las proteínas con tripsina como se describe en el protocolo de texto. Para extraer los péptidos, incube las piezas de gel con bicarbonato de amonio y acetonitrilo y recoja el sobrenadante que contiene péptidos. A continuación, incube las piezas de gel con ácido fórmico al 5% y acetonitrilo y recoja el sobrenadante que contiene péptidos.

Después de recolectar el sobrenadante que contiene péptidos, combine ambos sobrenadantes y seque los péptidos extraídos evaporando los solventes en una centrífuga al vacío. Una vez que los péptidos estén secos, mézclalos con 20 microlitros de solución de acetonitrilo al 2% y ácido fórmico al 0,1%. Disuelva los péptidos con un baño de sonicación durante dos o tres minutos.

A continuación, gire la muestra en una centrífuga a 16.200 veces la gravedad durante 30 minutos. Después de transferir la muestra a un vial de muestreador automático, inyecte cinco microlitros en un sistema nano LC-MS/MS y cargue la mezcla de péptidos en una precolumna C18 de fase inversa para desalar y concentrar los péptidos en línea. Retire el tampón de almacenamiento de una columna de centrifugación de exclusión de tamaño mediante centrifugación a 1.000 veces la gravedad y cuatro grados Celsius durante un minuto.

Después de desechar el flujo, lave la columna tres veces agregando 500 microlitros de acetato de amonio de 200 milimolares seguido de centrifugación. Después de la centrifugación, cargue 20 microlitros de la muestra de proteína en la columna y centrifuga a 1.000 veces la gravedad y cuatro grados Celsius durante cuatro minutos. Ahora, coloque un capilar recubierto de oro previamente preparado en un soporte para capilares.

Abra la punta de una aguja y llene el capilar con uno a cuatro microlitros de muestra de proteína. Conecte el soporte capilar con la fuente de nano electrospray del espectrómetro de masas y coloque la punta del capilar a una distancia de 0,5 a 1,5 centímetros del orificio del cono. Use gas de nanoflujo de 80 a 150 litros por hora para iniciar la pulverización y ajuste el flujo de gas para mantener una pulverización estable.

Ajuste los parámetros y la página de afinación del instrumento Q-TOF. A continuación, inicie la adquisición haciendo clic en el botón Adquirir y combine tantos escaneos como sea posible para obtener un buen espectro de masas. Disuelva 1,43 miligramos de BS3 y 100 microlitros de agua para preparar una solución madre de 25 milimolares.

A continuación, agregue BS3 al complejo de proteínas. Utilice cantidades variables de BS3 para identificar la concentración óptima de reticulante. Incubar las mezclas de reacción a 25 grados centígrados durante una hora en una termobatidora.

Ahora, realice la página SDS de las proteínas reticuladas con un gel de cuatro a 12% de gradiente. Corte las bandas de gel y digiera la proteína mediante digestión en gel como se describió anteriormente. Después de obtener los péptidos de la digestión en gel, realice la cromatografía líquida por espectrometría de masas acoplada como se describió anteriormente.

Se identificaron todas las subunidades proteicas del heterododímero RvB1/B2 y los complejos CPS heterooctaméricos con alta confianza. El espectro de masas de RvB1/RvB2 revela dos especies que corresponden a los anillos dobles hexámero y dodecamerico. Una estructura cristalina para el complejo RvB1/B2 muestra la disposición del doble anillo.

La adición de BS3 al complejo RvB1/RvB2 provoca un enlace covalente de las proteínas, lo que da lugar a bandas de proteínas con un peso molecular más alto. Y el aumento de las cantidades de BS3 produce mayores cantidades de especies reticuladas, mientras que las subunidades de proteínas no reticuladas se reducen. El espectro de dipéptidos reticulados muestra la serie de iones Y de ambos péptidos, lo que confirma esta interacción proteica.

Los resultados de la reticulación de BS3 se visualizan en una red de interacción que muestra las interacciones intramoleculares, así como las interacciones entre diferentes subunidades. El espectro de masas nativo de CPS muestra el heterodímero, heterotetrámero y heterooctámero. La espectrometría de masas en tándem de la CPS tetrámica y octamérica revela la disociación de la pequeña subunidad CPS.

La reticulación química de CPS con el reticulante BS3 muestra varios enlaces cruzados intramoleculares entre dos copias de la gran subunidad CPS. La estructura cristalina revela que la superficie de interacción entre el núcleo tetrámico y las pequeñas subunidades periféricas es muy pequeña, lo que podría explicar la ausencia de interacciones entre subunidades. Una vez dominado, nuestro flujo de trabajo se puede realizar durante una semana si se realiza correctamente.

Como el ensamblaje de proteínas es demasiado complejo, se requiere tiempo adicional para el análisis de datos. Siguiendo este procedimiento, se puede realizar posteriormente un modelado computacional para obtener modelos tridimensionales de los complejos proteicos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar experimentos de reticulación química y espectrometría de masas nativa hasta que estas dos técnicas complementarias ayuden a dilucidar las estructuras de los ensamblajes de proteínas.