Name: La combinación de reticulación química y espectrometría de masas de complejos de proteína intacta para el estudio de la arquitectura de multi-subunidades proteína asambleas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Aprende a combinar reticulación química con espectrometría de masas nativa para estudiar la arquitectura de complejos proteicos multi-subunidad. Este método proporciona información estructural complementaria esencial para la biología estructural.

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Agradecemos a nuestros colegas para discusiones útiles. También agradecemos a Ilme Schlichting y Peter Karl Hopfner para dar complejos de la proteína. Reconocemos que la financiación del Ministerio Federal de educación e investigación (BMBF, ZIK programa, 03Z22HN22), los europeos fondos de Desarrollo Regional (EFRE, ZS/2016/04/78115) y el MLU Halle-Wittenberg a C.S. y financiado por el Wellcome Trust (109854/658 Z/15/Z) a A.P.

Los autores no tienen nada que revelar.

Protocolos se proporcionan para análisis estructural basada en espectrometría de masa de complejos multi-subunidades de la proteína. Las dos técnicas, descritas en el protocolo, en su mayoría ofrecen resultados complementarios y son adecuadas para ganar penetraciones en los arreglos estructurales en proteínas (-ligando) complejos que son difíciles de estudiar por técnicas estructurales convencionales. Espectrometría de masas nativa proporciona penetraciones en los stoichiometries de proteína así como las interacciones entre proteínas analizando Subcomplejos de mando y módulos de interacción estable. Cross-linking, por otro lado, aporta información sobre sitios de contacto directos. Dependiendo de la vinculante utilizado, cierta flexibilidad puede o debe incluirse en el análisis.
Los protocolos proporcionados son en general fácil de realizar y no requiere mucho tiempo. El conjunto del Protocolo puede ser ejecutado dentro de una semana y se puede aplicar a casi todos los complejos de la proteína, aunque una cierta cantidad de la proteína compleja se requiere para el análisis de éxito. Preparación de la muestra es sencilla y no requiere específicamente complejos de la proteína purificada. Sin embargo, una trampa común es la contaminación de la muestra durante la preparación de muestras para identificación de proteínas basada en espectrometría de masa. Estas contaminaciones en la mayoría de los casos incluyen queratinas que originan polvo, piel o cabello. Por lo tanto, adicional como uso de guantes y batas de laboratorio, filtración acuosas almacenadores intermediarios y el uso de solventes de alta pureza deben tenerse cuidado durante la preparación de muestras para identificación de proteínas basada en espectrometría de masa. Otras proteínas contaminantes como acompañantes generalmente se introducen durante la purificación de la proteína, por ejemplo, cuando se utiliza etiquetas de afinidad. En estos casos, purificación de proteínas debe mejorarse, por ejemplo mediante el aumento de pasos de lavado. En cualquier caso, la contaminación de la proteína en la muestra se pueden identificar fácilmente durante la búsqueda de la base de datos omitiendo el filtro de la taxonomía (es decir, buscar contra las proteínas de todas las especies). Si sólo se observan unos péptidos (es decir, una cobertura baja en proteínas podría obtenerse), aunque muestra suficiente está disponible, puede ser necesario utilizar una proteinasa diferentes durante la digestión. En general la tripsina produce un número suficiente de péptidos; sin embargo, en algunos casos como proteínas de membrana o membrana dominios de proteínas, se reduce el número de sitios de división tríptica y otras enzimas dirigidas a hidrofóbicos aminoácidos son una mejor opción.
En términos de instrumentación, un instrumento especialmente modificado se requiere para espectrometría de masas nativa que mantiene interacciones no-covalentes durante la transferencia en la fase de gas. Se han introducido varios tipos de instrumentos, incluyendo instrumentos de Q-ToF y orbitrap. Mientras que modificado Q-ToF espectrómetros de masas están comercialmente disponibles para espectrometría de masas nativa desde hace varios años, estos últimos fueron introducidos recientemente y en la mayoría de los casos requieren modificación especializada45. Sin embargo, la aplicación de instrumentos de alta resolución permite estudiar la Unión de ligandos múltiples y su cuantificación46,47 y es prometedor para futuras aplicaciones.
Para identificar reticulados di-péptidos mediante espectrometría de masas acoplada a cromatografía de líquidos, se pueden aplicar procedimientos estándar con pocas modificaciones. Sin embargo, la búsqueda de la base de datos es el factor limitante como software especializado puede tratar raramente con grandes bases de datos y reducidos las bases de datos que contienen las subunidades de proteínas de los complejos son necesarios. Estudios recientes utilizan masa espectrometría escindibles cross-linkers dirigida a las interacciones de proteínas en célula entera lisados48,49. El uso de químicos cross-linkers que fragmento sobre todo en experimentos de espectrometría de masas tándem produce péptidos lineales (modificados por la vinculante), que pueden ser identificados por mayor fragmentación y búsqueda de la base de datos de péptidos lineales y esto reduce buscar el tiempo y el espacio de búsqueda computacional. Sin embargo, para realizar estos experimentos, un analizador de masas de trampa iónica o un espectrómetro de masas híbrido con una trampa de iones es necesario. En general, como falsos positivos son un tema importante, espectrometría de masas de péptidos reticulados es a menudo validado manualmente por la calidad de sus espectros de fragmento que amplía enormemente el tiempo de análisis de datos. Desarrollo de robustos sistemas de puntuación que se pueden aplicar sin más pasos de validación, por tanto, son posibles aplicaciones futuras. Una forma para mejorar el análisis de datos y reducir el número de falsos positivos fue la introducción de cálculos de tarifa falsa del descubrimiento y su aplicación a Cross-linking de conjuntos de datos50.
En general, las técnicas aquí descritas pueden complementarse con otras técnicas de espectrometría de masas (p. ej., etiquetado covalentes) para aumentar la salida del análisis. Otras modificaciones y mejoras de los protocolos pueden ser implementados fácilmente. Como tal comparativa Cross-linking34 revela cambios conformacionales en la Asamblea de la proteína. Más avances en espectrometría de masas nativa hoy en día permiten el análisis de membrana proteínas51,52 y sus interacciones con los lípidos28,52,53,54 . Novedades de espectrómetros de masas de alta resolución para espectrometría de masas nativa han extendido la aplicación y atascamiento del ligand, por ejemplo, Unión de lípidos a proteínas de la membrana, ahora pueden ser incluidos en el análisis45, 46. en combinación con métodos de Modelado computacional, estas técnicas pueden ofrecer modelos estructurales de diferentes resolución55. Si no las estructuras cristalinas están disponibles para las subunidades complejas o solo intactas, espectrometría de masas puede entregar primera penetraciones en las interacciones de la proteína y la topología del complejo desconocido. Dependiendo de las técnicas utilizadas y los resultados obtenidos, se pueden obtener modelos de baja resolución del complejo desconocido56,57,58. Si se dispone de las estructuras cristalinas o modelos de la homología, la información estructural espectrometría de masas puede producir incluso materno modelos59.
En comparación con otras técnicas estructurales, espectrometría de masas tiene la ventaja de que requiere cantidades de muestra baja, se puede tratar con muestras heterogéneas y es aplicable a los complejos de la proteína de tamaño ilimitado. Además, la espectrometría de masas permite la investigación de sistemas de dinámica de proteínas. Las diferentes poblaciones de la proteína o complejo de proteínas que existen en solución generalmente se analizan juntos y por lo tanto, a diferencia con otras técnicas estructurales que requieren la selección de determinadas poblaciones, conformaciones todos se mantienen durante Análisis y son evaluable en un experimento. Enfoques cuantitativos de cross-linking fueron recientemente introducido34,60,61 y son prometedores para futuras aplicaciones, describiendo los cambios conformacionales en condiciones diferentes.

La investigación estructural de los conjuntos de proteínas se ha vuelto particularmente importante para la comprensión de los procesos celulares. En consecuencia, muchas técnicas se han desarrollado y mejorado en biología estructural1. Sin embargo, estas técnicas son a veces limitadas en su aplicación debido al tamaño, la flexibilidad o la heterogeneidad de los complejos de proteína bajo investigación. Espectrometría de masas puede hacer frente a estos desafíos y, por lo tanto, surgió como una poderosa herramienta en biología estructural2,3,4,5. La mayor ventaja de espectrometría de masas, sin embargo, es la capacidad de identificar inequívocamente proteínas en mezclas complejas y heterogéneas6. Para ello, proteínas generalmente son digeridas con endoproteinases y la mezcla resultante del péptido se separa por cromatografía líquida y eluyen directamente en el espectrómetro de masas. Posteriormente se determinan las masas de los péptidos y los iones precursores seleccionados de mayor fragmentación de los péptidos. Las proteínas entonces se identifican por péptido busca y masas de fragmento correspondiente contra una base de datos conocido. Este procedimiento no sólo permite la identificación de péptidos/proteínas sino también sus modificaciones post-traduccionales que causan un cambio de masa de los péptidos precursores y los iones fragmento que la modificación7. Algunas de las muchas técnicas de espectrometría de masas estructural se basan en este principio4,8. Por ejemplo, etiquetado técnicas como hidrógeno deuterio intercambio9,10, de11,de estrategias de etiquetado químico12o radical hidroxilo pie de impresión13,14 , dar información sobre la accesibilidad de la superficie de las proteínas bajo ciertas condiciones.
Otra técnica es (química) Cross-linking que involucra el acoplamiento covalente de aminoácidos en proximidad cercana a través de sus grupos funcionales. Para ello, reactivos químicos, reactivos UV-activatable o aminoácidos son empleados15,16. Después de cross-linking, las proteínas generalmente son hidrolizadas con proteasas y reticulados di-péptidos, son analizados por espectrometría de masas acoplada a cromatografía de líquidos. La identificación de los productos Cross-linking de base de datos de búsqueda, sin embargo, requiere el uso de software especializado que concatenar secuencias de péptidos de diferentes proteínas y dispares regiones17,18,19. El uso de cross-linkers química tiene la ventaja de que puede ser empleado para casi cada complejo de la proteína de interés y no requiere la incorporación de aminoácidos UV-activatable, que sólo se logra expresar la proteína de interés en las células del huésped. Como tal, Cross-linking es una herramienta versátil y fue empleado con éxito en muchos estudios estructurales de proteínas grandes asambleas20.
Espectrometría de masas de complejos de proteína intacta (a veces llamado 'nativo' espectrometría de masas), por el contrario, implica el análisis de proteínas intactas y complejos de la proteína sin hidrólisis en péptidos. Revela composición, heterogeneidad, estequiometría, topología y las interacciones de la subunidad de la proteína complejos21,22. En combinación con la movilidad de iones, espectrometría de masas nativa más permite la determinación de su conformación23,24. Esto es una poderosa herramienta para la investigación estructural de complejos de proteína que son difíciles de evaluar mediante técnicas estructurales convencionales. Sin embargo, espectrometría de masas nativa requiere buffers de análisis que las interacciones no covalentes de proteínas durante la ionización por electrospray. Esto se logra mediante el uso de buffers acuosos, volátiles como amonio acetato25. Además, instrumento modificaciones son necesarias para evitar la disociación durante la transmisión en la fase gas del espectrómetro de masas26. Aplicado de esta manera, se analizaron muchos complejos de la proteína (grande). Ejemplos impresionantes son los estudios de ribosomas intactos27, ATP sintasas28o29de virus.
La combinación de espectrometría de masas nativa y cross-linking resultó particularmente exitosa en estudios anteriores. Por ejemplo, los stoichiometries de complejos de acompañante, incluyendo un inesperado dimer de Hsp70, podrían obtenerse experimentos de espectrometría de masas de los complejos de proteína intacta, mientras que el cross-linking químico reveló los arreglos de las proteínas en el Asambleas de30,31. En un estudio, se estudiaron los efectos de modificaciones poste-de translación en un intacto synthase del ATP complejo. Espectrometría de masas nativa proporciona penetraciones en la estabilidad complejos de proteína en la presencia o ausencia de fosforilación o acetilación de32,33. Una estrategia Cross-linking comparativo34 reveló cambios conformacionales de la proteína del complejo bajo las diferentes condiciones.
Presentamos los protocolos para la identificación de proteínas por espectrometría de masas, Cross-linking (química) y espectrometría de masas nativa, incluyendo análisis de datos e interpretación (figura 1). La combinación de resultados complementarios de estos métodos con la ayuda de dos complejos de la proteína bien caracterizado es demostrada35. Nuestro protocolo se puede aplicar a cualquier conjunto de proteínas que puede ser purificado en cierta pureza y concentración. El enfoque es en algunos casos limitadas por el análisis de los datos de la reticulación de los datos, es decir, el tamaño de la base de datos empleado, que determina la búsqueda requiere espacio y tiempo. Además, validación manual de enlaces cruzados identificados a menudo es necesario y reduce aún más la salida. Espectrometría de masas nativa está limitada sobre todo por la calidad de la muestra, por ejemplo, tampones y aductores utilizado durante la purificación y la posibilidad de canjearlos por buffers acuosos y volátiles. Sin embargo, complejos de la proteína purificados para análisis estructural generalmente tienen la calidad necesaria para el análisis de éxito con nuestros protocolos.

<table><tbody><tr><td><fuerte>Químicos, Reactivos, Consumibles</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-[4-(2-hidroxietil)piperazina-1-il]etanosulfónico (HEPES)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Tampón</td><td>H4034</td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Sigma Aldrich</td><td>695092</td><td>pH</td></tr><tr><td>Acetonitrilo Optima LC/MS</td><td>Fisher Chemicals</td><td>A955-1</td><td>disolvente</td></tr><tr><td>Amicon Ultra centrífugo dispositivos (diferentes MWCO)</td><td>Millipore</td>, <td>es decir</td><td>, UFC500396 tampón de intercambio, concentración</td></tr><tr><td>Solución de acetato de amonio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2706</td><td>MS nativo</td></tr><tr><td>Bicarbonato de amonio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>9830</td><td>digestión en gel</td></tr><tr><td>Solución de amonio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>9859</td><td>pH</td></tr><tr><td>Bis(Sulfosuccinimidyl)suberate-d0 (BS3-d0)</td><td>Thermo Scientific</td><td>21590</td><td>reticulante</td></tr><tr><td>Bis(sulfosuccinimidil)suberado-d4 (BS3-d4)</td><td>Thermo Scientific</td><td>21595</td><td>reticulante</td></tr><tr><td>Yoduro de cesio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>calibración</td><td>203033</td></tr><tr><td>Cloruro de calcio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5670</td><td>digestión en gel</td></tr><tr><td>Capilares (1,0 OD y veces; 0,78 ID y veces; 100 L mm)</td><td>Harvard Apparatus</td><td>30-0038</td><td>EM nativo</td></tr><tr><td>Suberato de disuccinimidilo (DSS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>21655</td><td>reticulante</td></tr><tr><td>DL-Ditiothreitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5545</td><td>digestión en gel</td></tr><tr><td>DMSO (dimetilsulfóxido)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8418</td><td>disolvente</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Fisher Chemicals</td><td>BP2818</td><td></td></tr><tr><td>disolvente Ácido fórmico Optima LC/MS</td><td>Fisher Chemicals</td><td>A117-50</td><td>suplemento solvente</td></tr><tr><td>Instant Blue Coomassie solución de tinción</td><td>expedeon</td><td>ISB1L</td><td>solución de tinción para electroforesis en gel</td></tr><tr><td>Invitrogen NuPAGE 4-12% Geles Bis-Tris (1 mm, 10 pocillos)</td><td>Life Technologies</td><td>NP0323BOX</td><td>electroforesis en gel</td></tr><tr><td>Yodoacetamida</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I1149</td><td>Digestión en gel</td></tr><tr><td>Alcohol isopropílico, grado HPLC</td><td>Fisher Chemicals</td><td>P750717</td><td>disolvente</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Chemicals</td><td>A456-212</td><td>disolvente</td></tr><tr><td>Micro BioSpin 6 columnas</td><td>BioRad</td><td>732-6222</td><td>tampón</td></tr><tr><td>de intercambio NuPAGE Antioxidante</td><td>invitrogen</td><td>NP0005</td><td>tampón de ejecución, electroforesis en gel</td></tr><tr><td>Tampón de muestra NuPAGE LDS (4 &veces;)</td><td>invitrogen</td><td>NP0007</td><td>tampón de carga de muestras (no reductor) para electroforesis en gel</td></tr><tr><td>NuPAGE MES SDS Running buffer</td><td>life technologies</td><td>NP0001</td><td>electroforesis en gel</td></tr><tr><td>NuPAGE MOPS SDS Running buffer</td><td>life technologies</td><td>NP0001</td><td>electroforesis en gel</td></tr><tr><td>NuPAGE Agente reductor de muestras (10 &times;)</td><td>invitrogen</td><td>NP0004</td><td>agente reductor para electroforesis en gel</td></tr><tr><td>PBS - solución salina tamponada con fosfato</td><td>Tampón</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4417</td></tr><tr><td>SeeBlue Plus2 Marcador de proteína estándar preteñido</td><td>invitrogen</td><td>LC5925</td><td>Marcador de proteínas para electroforesis en gel</td></tr><tr><td>Acetato de sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2889</td><td>precipitación de etanol</td></tr><tr><td>Tris (hidroximetilo)aminometano (Tris)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>tampón</td><td>252859</td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>TRYPSEQ-RO (11418475001)</td><td>digestión en gel</td></tr><tr><td>Dispositivos centrífugos Vivaspin (diferentes MWCO)</td><td>Sartorius</td>, <td>es decir, VS0101</td><td>intercambio de tampón, concentración</td></tr><tr><td>Agua para HPLC</td><td>Sigma Aldrich</td><td>270733-2.5L-M</td><td>solvente</td></tr><tr><td><fuerte>Nombre</fuerte></td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga Heraeus Fresco 21, centrífuga de sobremesa</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002425</td><td></td></tr><tr><td>Flaming / Marrón Extractor de micropipetas Modelo P-1000</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>Cámara de electroforesis de gel, Xcell SureLock</td>, <td>MiniCell, Invitrogen</td><td>EI0001</td><td></td></tr>, <tr><td>Gold Coater Quorum, Q150R, S</td><td>Quorum Technologies, Ltd.</td><td>Q150RS</td><td></td></tr><tr><td>Agitador de gel horizontal Rotamax 120 T</td><td>Heidolph Instruments</td><td>544-41200-00</td><td></td></tr><tr><td>Q-TOF Espectrómetro de masas Ultima, actualización de alta masa MS Vision Waters</td><td>(micromasa)</td> <td>columna</td> analítica C18 de fase reversa Acclaim PepMap (C18, 75 mm de diámetro interior, 50 cm, 3 mm de tamaño de <td></td></tr><tr><td>poro)</td><td>Thermo Scientific</td><td>164570</td><td></td></tr><tr><td>precolumna C18 de fase reversa (C18, 150 mm de diámetro interior, 2 cm, 5 mm de tamaño de poro)</td><td>Bisturí Thermo Scientific</td><td>164213</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientifc</td><td>10463989</td> SpeedVac SPD121P <td></td></tr><tr><td>centrífuga</td><td>de vacío Thermo Scientific</td><td>SPD121DP-230</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer C</td><td>Pinzas Eppendorf</td><td>5382000015</td><td></td></tr><tr><td>AA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z680184-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Limpiador ultrasónico USC-TH, baño de sonicación</td><td>VWR</td><td>142-0084</td><td></td></tr><tr><td>Sistema UltiMate Dionex 3000 nano-LC, acoplado al espectrómetro de masas híbrido Q-Exactive plus (fuente nano-ESI)</td><td>Thermo Scientific</td><td>0726030+</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Software, Herramientas de software, Búsqueda en bases de datos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mascot</td><td>www.matrixscience.com</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Massign</td><td>http://massign.chem.ox.ac.uk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MassLynx</td><td>Micromass</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MassMatrix</td><td>Xu, H. J Proteome Res. 9 (2010)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MaxQuant</td><td>Cox, J. Nat. Biotechn. 26 (2008)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pLink</td><td>Yang, B. Nat Methods 9 (2012)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Herramienta de conversión pXtract</td><td>http://pfind.ict.ac.cn/downloads.html</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UniDec</td><td>Marty, M.T. Anal. Chem. 87 (2015)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>XCalibur</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>XiNET</td><td>http://crosslinkviewer.org</td><td></td><td></td></tr><tr><td>XLinkX</td><td>Liu, F. Curr Op Struct Biol 35 (2015)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>xQuest</td><td>Rinner, O. Nat Methods 5 (2008)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xvis</td><td>https://xvis.genzentrum.lmu.de</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

la combinación de reticulación química y espectrometría de masas de complejos de proteína intacta para el estudio de la arquitectura de multi-subunidades proteína asambleas

Combining Chemical Cross-linking and Mass Spectrometry of Intact Protein Complexes to Study the Architecture of Multi-subunit Protein Assemblies

Proteínas interactúan con sus ligandos a asambleas activa y dinámica de forma que llevar a cabo diversas funciones celulares. Aclaración de estas interacciones es fundamental para la comprensión de los procesos celulares. Sin embargo, muchos complejos de la proteína están ensamblados dinámicos y no son accesibles mediante técnicas estructurales convencionales. Espectrometría de masas contribuye a la investigación estructural de estas asambleas, y particularmente la combinación de varias técnicas de espectrometría de masa proporciona penetraciones valiosas en su arreglo estructural.
En este artículo, describimos la aplicación y combinación de dos técnicas complementarias de espectrometría de masa, es decir, reticulación química junto con la espectrometría de masas y espectrometría de masas nativa. Reticulación química involucra el acoplamiento covalente de aminoácidos cerca mediante el uso de reactivos químicos. Después de la digestión con proteasas, reticulados di-péptidos están identificados por espectrometría de masas y sitios de interacción de la proteína están al descubierto. Espectrometría de masas nativa por otra parte es el análisis de conjuntos de proteínas intactas en la fase gaseosa de un espectrómetro de masas. Revela stoichiometries de proteína así como las interacciones de la proteína y de ligando. Ambas técnicas por lo tanto ofrecen información complementaria sobre la estructura de las Asambleas de proteína-ligando y su combinación probada en estudios previos de gran alcance.

El análisis estructural de las proteínas y los complejos forman es fundamental para la comprensión de su función. Espectrometría de masas contribuye considerablemente a la investigación estructural en que se puede aplicar a casi cualquier complejo de interés independientemente del tamaño o heterogeneidad de la muestra. Nos ejemplifican el protocolo mediante el uso de dos complejos de la proteína bien caracterizadas; en primer lugar, la hetero-dodecamer RvB1/B2 de Chloracidobacterium C. y segundo, la CPS de hetero-octámerico complejo de e. coli.
En primer lugar, se identificaron los componentes de proteína de los dos complejos. Para ello, las proteínas se separaron por SDS-PAGE (figura 2) y bandas de gel se cortaron del gel. Después de la digestión de las proteínas en gel-, la mezcla de péptidos se analizaron por espectrometría de masas acoplada a cromatografía de líquidos y masas peptídicas y fragmento fueron sometidas a la búsqueda de la base de datos. Después de este flujo de trabajo, identificamos todas las subunidades de proteína de los dos complejos con alta confianza, es decir, se observó un alto número de péptidos con puntaje péptido razonable rendimiento cobertura alta secuencia de subunidades de proteína todos (tabla 1 ).
Luego analizamos la intacta RvB1/B2 complejo por espectrometría de masas nativa (Figura 3A). El espectro de masas reveló dos especies, una en aproximadamente 8.000 m/z y otra en aproximadamente 11.000-12.000 m/z. Las masas calculadas para estas especies corresponden al hexámero (RvB1)3(RvB2)3 anillo (aproximadamente 310 kDa) y dodecameric doble anillo (RvB1)6(RvB2)6 (aproximadamente 620 kDa). Ambas series de pico muestra dos poblaciones; Estos proceden de una mezcla de sus etiquetados y sin etiquetar RvB2 subunidades de los complejos. Una estructura de cristal para el RvB1/B2 complejo previamente obtuvo36 y muestra la disposición de doble anillo (figura 3B). El espectro de masas nativo confirma, por tanto, la estequiometría del dodecamer intacto y además revela un complejo estable de sub. Además, se identifican las poblaciones coexistentes.
Para identificar sitios de interacción de proteínas en el complejo RvB1/B2, químicamente reticulado complejo purificado con BS3 vinculante. Primero titula la cantidad de BS3 durante la reacción de reticulación para determinar la concentración óptima. BS3 es específica de amina y covalentemente cadenas de enlaces lisina laterales así como el termini N de proteínas. La reacción de entrecruzamiento fue seguida por SDS-PAGE (figura 2A). El complejo no-cruz-ligado demostró RvB1 y RvB2 subunidades. BS3 de agregar a la mezcla de reacción causó el acoplamiento covalente de las proteínas dando lugar a bandas de proteínas con peso molecular mayor. El gel de la SDS muestra que cantidades cada vez mayores de BS3 mayores cantidades de especies reticuladas mientras que subunidades de la proteína no-cruz-ligado se reducen. Luego cortar las bandas de proteínas desde el gel y seguido el protocolo estipulado anteriormente para identificar los sitios de interacción de la proteína. Un espectro de ejemplo de un di-péptido reticulado se muestra (figura 3). El espectro muestra serie de iones y de ambos péptidos confirmando esta interacción de la proteína. En total, se obtuvieron 14 las interacciones entre proteínas, incluyendo cuatro enlaces cruzados entre las subunidades RvB1 y RvB2 y dos enlaces cruzados entre dos copias de RvB2 (tabla 2). Los resultados de BS3 Cross-linking se visualizan en una red de interacción (figura 3D), mostrando las interacciones intra moleculares como las interacciones entre las subunidades diferentes. Enlaces cruzados intra moleculares sugieren que las subunidades RvB1 y RvB2 doblan de manera que N y C terminal dominios están en proximidad cercana. Tenga en cuenta que no pueden distinguirse interacciones intra moleculares de interacciones inter moleculares de la subunidad de la misma en este caso. También se observaron entre moleculares enlaces cruzados entre las dos subunidades. De estos dos enlaces cruzados inter moleculares entre RvB1 y RvB2 podrían visualizarse en la estructura de validar el enfoque Cross-linking. Los otros entre moleculares enlaces cruzados se encuentran en bucles flexibles que no están incluidos en la estructura cristalina. También identificamos dos enlaces cruzados en RvB2 que contiene el mismo secuencias de péptidos. Estos enlaces cruzados inequívoca pueden ser clasificados como la molecular como deben proceder de dos copias de la misma proteína (figura 3D). Nuestros experimentos Cross-linking revelan sitios de interacción de la proteína dentro del complejo sino también dentro de las subunidades de proteína proporciona penetraciones en su arreglo estructural que también se podría confirmar por la estructura cristalina (figura 3B).
El segundo complejo de proteínas que estudiamos fue CPS. El espectro de masas nativo (Figura 4A) reveló tres complejos de proteínas entre 6.000 y 12.000 m/z. El complejo más grande de 640 kDa corresponde a la hetero-octámero intacto. Los complejos más pequeños representan dos complejos secundarios; el dímero de las pequeñas y grandes subunidades CPS (160 kDa) y un hetero-tetrámero que contiene dos copias de cada subunidad (320 kDa). Estos complejos sub entregan primera penetraciones en la Asamblea de la proteína; es decir, las subunidades grandes y pequeñas están en contacto directo (según lo revelado por el dimer del hetero) y el tetrámero podría ser un producto de dos dímeros. Para obtener más información sobre el arreglo estructural en el CPS intacto complejo, realizamos la espectrometría total en tándem (MS/MS) de la hetero-octámero y hetero-tetrámero. En ambos casos, la subunidad pequeña disociada el precursor lo que sugiere que la subunidad pequeña está situada en la periferia de la Asamblea (Figura 4B). De hecho, la subunidad pequeña es periférica en la estructura (figura 4) de cristal disponibles44.
Reticulación química con el BS3 vinculante también se realizó. Usar cantidades cada vez mayores, el acoplamiento covalente de las subunidades de la CPS fue realzado. Después de la digestión de las proteínas y el análisis de los péptidos como se describe anteriormente, muchas de las interacciones de proteínas en la subunidad grande y una reticulación en la subunidad pequeña se obtuvieron (tabla 2). Además, similar a la RvB1/B2 complejo, encontramos dos enlaces cruzados inter moleculares entre dos copias de la subunidad grande del CPS. Estos enlaces cruzados Coloque las dos subunidades grandes uno frente al otro en sus lados C-terminal. Combinación estructural espectrometría de masas y Modelado computacional35, en un estudio anterior, se identificaron tres interacciones adicionales en la subunidad grande que probablemente originan desde la interfaz de dos copias de la subunidad grande validado por la estructura cristalina y el modelo obtenido (figura 4 y tabla 2). Estas interacciones permiten el arreglo de la base de CPS complejo que consiste en cuatro subunidades grandes. Sin embargo, no entre la subunidad enlaces cruzados entre las pequeñas y las subunidades grandes se observaron. Mediante la inspección de la estructura de cristal disponible (figura 4), es evidente que la superficie de interacción entre la base tetramérica del complejo, que consiste en la subunidad grande y las subunidades pequeñas periféricas es muy pequeña, que podría explicar la ausencia de las interacciones entre subunidades. Esto es confirmado por espectrometría de masas nativa que demostró que la subunidad pequeña se disocia fácilmente de los complejos intactos probablemente debido a una interfaz de enlace pequeña. Sin embargo, las interacciones de la proteína en el CPS complejo combinado de reticulación química y espectrometría de masas nativa permiten deducir su arreglo estructural (figura 4).
Tomados en conjunto, la combinación de espectrometría de masas nativa y reticulación química junto con la identificación de espectrometría de masa de péptidos reticulados, permite la reconstitución del arreglo estructural de ambos complejos ejemplo. Mientras que la reticulación química reveló el arreglo de las subunidades de la proteína, por ejemplo las interacciones entre RvB1 y RvB2 o dentro de la base tetramérica de CPS, espectrometría de masas nativa entregado stoichiometries proteínas de los complejos intactos y Subcomplejos de mando común. En el caso de CPS, para que no las interacciones inter moleculares entre las dos subunidades se podían observar por reticulación química, espectrometría de masas nativa sugiere que cada subunidad grande interacciona con una subunidad pequeña (figura 4). Espectrometría de masas tándem propuso la localización periférica de la subunidad pequeña en el complejo y una pequeña interfaz entre ambas subunidades.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56747/56747fig1.jpg"> Figura 1: flujo de trabajo de espectrometría de masas nativa y cross-linking. Ambas técnicas ofrecen resultados complementarios. Mientras que la espectrometría de masas nativa revela stoichiometries y módulos de interacción, Cross-linking proporciona penetraciones en los sitios de interacción de la proteína dentro de los complejos. Tenga en cuenta que la reticulación química sólo revela las interacciones binarias. (A) el primer paso en espectrometría de masas nativa es cambio de buffer a un búfer volátil y acuoso mediante filtros o columnas de filtración de gel. Espectrometría de masas de los complejos de proteína intacta luego revela su estequiometría. En experimentos de espectrometría de masas tándem, subunidades periféricas son disociados. (B) para reticulación química, el complejo de la proteína se incuba con un reactivo de reticulación. El reticulado proteínas son digeridas luego en péptidos que posteriormente son analizados por espectrometría de masas acoplada a cromatografía de líquidos. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56747/56747fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56747/56747fig2.jpg"> Figura 2: SDS-PAGE de reticulado RvB1/B2 (A) y CPS (B) complejos. (A) 2.5 μm RvB1/B2 fueron cargados por carril del gel. La concentración de BS3 es variada. No-cruz-ligado RvB1/B2 muestra las subunidades de dos proteína de aproximadamente 50 kDa. Además de BS3 causaron acoplamiento covalente de las subunidades de proteína dando lugar a bandas de proteínas con peso molecular mayor. La cantidad de especies reticuladas aumenta con mayores concentraciones de BS3. Óptimas condiciones de cross-linking son resaltado (rojo). (B) 10 μm CPS fueron cargados por carril del gel. El grande (90 kDa) y pequeño (40 kDa) subunidades de la CPS se obtienen. Además de BS3 causaron acoplamiento covalente de las subunidades de proteína dando lugar a bandas de proteínas con peso molecular mayor. Óptimas condiciones de cross-linking son resaltado (rojo). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56747/56747fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56747/56747fig3.jpg"> Figura 3: espectrometría de masas nativa y reticulación química de RvB1/B2 complejo. (A) el espectro de masas nativo revela dos especies de RvB1/B2; del dodecamer intacto (es decir, (RvB1)6(RvB2)6) aproximadamente 11.000 a 12.000 m/z y el hexámero anillo (RvB1)3(RvB2)3 en aproximadamente 8.000 m/z. Ambas especies muestran dos poblaciones resultantes RvB2 su etiquetados y sin etiquetar. El espectro ha sido modificado desde35. (B) el cristal estructura de RvB1/B2 se muestra (ID de PDB 4WVY). Alternancia de RvB1 y RvB2 subunidades forman dos anillos hexamérica. (C) espectro de fragmentación de un reticulado di-péptido. El N-terminal de RvB1 fue reticulado con K23 de RvB1 serie de iones y se obtuvieron para ambos péptidos (rojo y cian). (D) Intra y inter protein interacciones en el complejo RvB1/B2. Intra-Cruz-enlaces se muestran en rojo, en azul se muestran inter-cross-links. El inserto muestra dos enlaces cruzados inter moleculares entre las subunidades RvB1 y RvB2 que podrían visualizarse en la estructura cristalina (verde, insertar). Interacciones que originan dos copias RvB2 se muestran como líneas de puntos azules. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56747/56747fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56747/56747fig4.jpg"> Figura 4: espectrometría de masas nativa y reticulación química de CPS. (A) el espectro de masas nativo de CPS muestra tres complejos. El dimer del hetero (160 kDa), hetero-tetrámero (320 kDa) y hetero-octámero (640 kDa). El espectro ha sido modificado desde35. (B) spectrometry total en tándem de la tetramérica y octámerico CPS complejo reveló la disociación de la subunidad pequeña del CPS. (C) el cristal estructura de CPS se muestra (ID de PDB 1BXR). Las subunidades grandes forman una base tetramérica y las subunidades pequeñas se encuentran en la periferia del complejo. Enlaces cruzados inter moleculares entre dos copias de la subunidad grande se muestran (verde). (D) interacción de las subunidades grandes y pequeñas de la CPS. Espectrometría de masas nativa reveló Subcomplejos mando y sugiere una localización periférica de la subunidad pequeña. Enlaces químicos cruzados indican arreglos en la base tetramérica de CPS. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56747/56747fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Tabla 1: resultados de la búsqueda de la base de datos. Se identificaron las proteínas por espectrometría de masas acoplada a cromatografía de líquidos y la búsqueda de la base de datos. Los nombres de la proteína de adhesión número, descripción como proteína se dan masa. El puntaje de la proteína, número de espectros observados por proteína y el número de secuencias de péptidos observados se enumeran. Los cinco péptidos con puntuaciones más altas de péptidos de mascota se enumeran para cada subunidad de la proteína. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56747/Table1.xlsx">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Tabla 2: enlaces cruzados observaron en RvB1/B2 y CPS. Las subunidades de los complejos y los residuos reticulados se dan. El tipo de reticulación (intra - o inter-moleculares) fue revelado de secuencias de péptidos traslapados o un anterior estudio35. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56747/Table2.xlsx">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

La arquitectura de complejos de la proteína es esencial para su función. Combinando varias técnicas de espectrometría de masa probado poderoso para el estudio de su montaje. Ofrecemos protocolos de reticulación química y espectrometría de masas nativa y mostrar cómo estas técnicas complementarias ayudan a dilucidar la arquitectura de los conjuntos de multi-subunidades de proteína.

La combinación de reticulación química y espectrometría de masas de complejos de proteína intacta para el estudio de la arquitectura de multi-subunidades proteína asambleas

Proteins interact with their ligands to form active and dynamic assemblies which carry out various cellular functions. Elucidating these interactions is ...

El objetivo general de combinar la reticulación con la espectrometría de masas nativa es obtener información estructural complementaria sobre ensamblajes de proteínas de múltiples subunidades que ayude a dilucidar su disposición tridimensional. La reticulación química y la espectrometría de masas nativa ayudan a responder a preguntas clave de la biología estructural, como la composición, la conectividad y la estequiometría. La principal ventaja de combinar varias técnicas es que se obtiene información complementaria que no se obtiene con una sola técnica.Nuestro flujo de trabajo se puede aplicar a cualquier otro complejo proteico. Se puede purificar a partir de sales o tejidos o que se pueden reconstituir a partir de proteínas purificadas. En primer lugar, aplique 7,5 microlitros de tampón simple cuádruple y tres microlitros de agente reductor 10 veces al complejo proteico deseado.Gire la muestra durante un minuto a 16, 200 veces la gravedad. Después de la centrifugación, caliente la muestra durante 10 minutos a 70 grados centígrados. Prepare un gel con un gradiente de cuatro a 12% para la electroforesis y coloque el gel en la cámara de electroforesis.Diluir el tampón de funcionamiento previamente preparado 20 veces con agua y llenar la cámara de electroforesis. A continuación, añade 0,5 mililitros de antioxígeno a la cámara interior. Cargue un marcador de proteína adecuado en la primera cavidad del gel y las muestras de proteína en las cavidades restantes.Luego, separe las proteínas durante la cantidad de tiempo adecuada a 200 voltios. Para teñir las bandas de proteínas, transfiera el gel a una caja de tinción de gel y cubra el gel con una solución de pie de Coomassie a base de agua. Incuba el gel durante la noche a temperatura ambiente en un agitador de gel horizontal.Al día siguiente, elimine las manchas del gel reemplazando la solución de tinción con agua. Repita el paso anterior aproximadamente de tres a cinco veces hasta que el fondo de gel aparezca claro. Ahora, corte las bandas de proteínas que se visualizan por la tinción azul de Coomassie de los geles con un bisturí.Corta con cuidado las bandas de proteína en trozos pequeños de aproximadamente un mililitro por uno. A continuación, lave las bandas de proteínas con agua y acetonitrilo. Reducir los enlaces disulfuro con DTT, y luego alquilar los residuos de cisteína con yodoacetamida.Después de esto, digiera las proteínas con tripsina como se describe en el protocolo de texto. Para extraer los péptidos, incube las piezas de gel con bicarbonato de amonio y acetonitrilo y recoja el sobrenadante que contiene péptidos. A continuación, incube las piezas de gel con ácido fórmico al 5% y acetonitrilo y recoja el sobrenadante que contiene péptidos.Después de recolectar el sobrenadante que contiene péptidos, combine ambos sobrenadantes y seque los péptidos extraídos evaporando los solventes en una centrífuga al vacío. Una vez que los péptidos estén secos, mézclalos con 20 microlitros de solución de acetonitrilo al 2% y ácido fórmico al 0,1%. Disuelva los péptidos con un baño de sonicación durante dos o tres minutos.A continuación, gire la muestra en una centrífuga a 16.200 veces la gravedad durante 30 minutos. Después de transferir la muestra a un vial de muestreador automático, inyecte cinco microlitros en un sistema nano LC-MS/MS y cargue la mezcla de péptidos en una precolumna C18 de fase inversa para desalar y concentrar los péptidos en línea. Retire el tampón de almacenamiento de una columna de centrifugación de exclusión de tamaño mediante centrifugación a 1.000 veces la gravedad y cuatro grados Celsius durante un minuto.Después de desechar el flujo, lave la columna tres veces agregando 500 microlitros de acetato de amonio de 200 milimolares seguido de centrifugación. Después de la centrifugación, cargue 20 microlitros de la muestra de proteína en la columna y centrifuga a 1.000 veces la gravedad y cuatro grados Celsius durante cuatro minutos. Ahora, coloque un capilar recubierto de oro previamente preparado en un soporte para capilares.Abra la punta de una aguja y llene el capilar con uno a cuatro microlitros de muestra de proteína. Conecte el soporte capilar con la fuente de nano electrospray del espectrómetro de masas y coloque la punta del capilar a una distancia de 0,5 a 1,5 centímetros del orificio del cono. Use gas de nanoflujo de 80 a 150 litros por hora para iniciar la pulverización y ajuste el flujo de gas para mantener una pulverización estable.Ajuste los parámetros y la página de afinación del instrumento Q-TOF. A continuación, inicie la adquisición haciendo clic en el botón Adquirir y combine tantos escaneos como sea posible para obtener un buen espectro de masas. Disuelva 1,43 miligramos de BS3 y 100 microlitros de agua para preparar una solución madre de 25 milimolares.A continuación, agregue BS3 al complejo de proteínas. Utilice cantidades variables de BS3 para identificar la concentración óptima de reticulante. Incubar las mezclas de reacción a 25 grados centígrados durante una hora en una termobatidora.Ahora, realice la página SDS de las proteínas reticuladas con un gel de cuatro a 12% de gradiente. Corte las bandas de gel y digiera la proteína mediante digestión en gel como se describió anteriormente. Después de obtener los péptidos de la digestión en gel, realice la cromatografía líquida por espectrometría de masas acoplada como se describió anteriormente.Se identificaron todas las subunidades proteicas del heterododímero RvB1/B2 y los complejos CPS heterooctaméricos con alta confianza. El espectro de masas de RvB1/RvB2 revela dos especies que corresponden a los anillos dobles hexámero y dodecamerico. Una estructura cristalina para el complejo RvB1/B2 muestra la disposición del doble anillo.La adición de BS3 al complejo RvB1/RvB2 provoca un enlace covalente de las proteínas, lo que da lugar a bandas de proteínas con un peso molecular más alto. Y el aumento de las cantidades de BS3 produce mayores cantidades de especies reticuladas, mientras que las subunidades de proteínas no reticuladas se reducen. El espectro de dipéptidos reticulados muestra la serie de iones Y de ambos péptidos, lo que confirma esta interacción proteica.Los resultados de la reticulación de BS3 se visualizan en una red de interacción que muestra las interacciones intramoleculares, así como las interacciones entre diferentes subunidades. El espectro de masas nativo de CPS muestra el heterodímero, heterotetrámero y heterooctámero. La espectrometría de masas en tándem de la CPS tetrámica y octamérica revela la disociación de la pequeña subunidad CPS.La reticulación química de CPS con el reticulante BS3 muestra varios enlaces cruzados intramoleculares entre dos copias de la gran subunidad CPS. La estructura cristalina revela que la superficie de interacción entre el núcleo tetrámico y las pequeñas subunidades periféricas es muy pequeña, lo que podría explicar la ausencia de interacciones entre subunidades. Una vez dominado, nuestro flujo de trabajo se puede realizar durante una semana si se realiza correctamente.Como el ensamblaje de proteínas es demasiado complejo, se requiere tiempo adicional para el análisis de datos. Siguiendo este procedimiento, se puede realizar posteriormente un modelado computacional para obtener modelos tridimensionales de los complejos proteicos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar experimentos de reticulación química y espectrometría de masas nativa hasta que estas dos técnicas complementarias ayuden a dilucidar las estructuras de los ensamblajes de proteínas.

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Biología

Espectrometría de masas ha demostrado ser una valiosa herramienta para el análisis de grandes complejos de proteínas. Este método permite a los puntos de vista en la arquitectura de la composición, estequiometría y en general de las asambleas de múltiples subunidades. Aquí se describe, paso a paso, cómo realizar un análisis de espectrometría de masas estructurales, y caracterizar estructuras macromoleculares.

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Aprende a combinar reticulación química con espectrometría de masas nativa para estudiar la arquitectura de complejos proteicos multi-subunidad. Este método proporciona información estructural complementaria esencial para la biología estructural.

La combinación de reticulación química y espectrometría de masas de complejos de proteína intacta para el estudio de la arquitectura de multi-subunidades proteína asambleas (Video) | JoVE Journal

La combinación de reticulación química y espectrometría de masas de complejos de proteína intacta para el estudio de la arquitectura de multi-subunidades proteína asambleas

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