Ensayo de cribado de nematicidas de moléculas pequeñas: un método de rendimiento medio para cribar posibles nematicidas contra Ditylenchus dipsaci

Los nematodos parásitos de plantas como Ditylenchus dipsaci son gusanos microscópicos. Los gusanos vivos exhiben movimientos sinusoidales a través de contracciones musculares, y su motilidad es un determinante importante de su salud en condiciones de cultivo.

La exposición a nematicidas, tóxicos químicos, puede interferir con procesos biológicos clave, afectando la movilidad de estos nematodos cultivados, lo que lleva a su muerte.

Para detectar nematicidas de moléculas pequeñas, tome una placa de pocillos múltiples que contenga agua destilada. Con una herramienta de fijación limpia, transfiera los posibles nematicidas moleculares pequeños de la placa de almacenamiento químico a la placa de ensayo para garantizar una transferencia de cantidades constantes de moléculas a cada pocillo.

Dispense un número igual de nematodos a cada pocillo de la placa. Selle las placas mientras mantiene las condiciones húmedas para apoyar la supervivencia y la movilidad de los nematodos. Incube la placa con agitación suave para evitar que los gusanos se asienten.

Durante la incubación, varias moléculas pequeñas tóxicas actúan sobre los gusanos y los matan, mientras que las no tóxicas no tienen ningún impacto. Observe la placa bajo un microscopio de disección para identificar los pocillos con una población de gusanos inmóviles.

Complemente las placas de ensayo con una solución de hidróxido de sodio, estimulante químico de punto final. Esto desencadena el movimiento de cualquier gusano en reposo y los diferencia de los muertos.

La presencia de gusanos inmóviles después del tratamiento con hidróxido de sodio en algunos pozos confirma la eficacia de las moléculas pequeñas correspondientes como nematicidas.

Para preparar las placas de ensayo, vierta agua destilada esterilizada en autoclave en un comedero estéril y dispense 40 microlitros de agua destilada del comedero en cada pocillo de una placa de fondo plano de 96 pocillos con una pipeta multicanal. Agregue productos químicos de las placas de material químico de 96 pocillos a las placas de ensayo, fijando tres veces en la placa química. Luego, transfiera los alfileres 10 veces a la placa de ensayo. Seque sobre papel frente a la solución de limpieza.

Para contar el número de nematodos de la colección, primero, vuelva a suspender la colección y luego, pipetee 5 microlitros de la solución con puntas de baja retención en un portaobjetos. Cuente el número de nematodos en 5 microlitros usando un microscopio de disección. Luego, ajuste la concentración a dos gusanos por microlitro usando agua destilada estéril.

A continuación, agregue 10 microlitros de la muestra a cada pocillo de las placas de 96 pocillos con una pipeta multicanal y un comedero. Envuelve los platos con una toalla de papel húmeda y colócalos en una caja. Luego, agregue una toalla de papel húmeda adicional para estabilizar y asegurar un movimiento mínimo de los platos, y colóquela en una almohadilla adhesiva en una incubadora agitadora a 20 grados Celsius a 200 rpm.

Observe las placas el día 5 bajo un microscopio de disección. Cuente el número de D. dipsaci móviles y totales en controles de solventes DMSO y pocillos tratados con medicamentos.

Si los gusanos están inmóviles, agregue 2 microlitros de hidróxido de sodio 1 molar a una concentración final de 40 milimolares al pozo para estimular el movimiento. Calcule la proporción de gusanos móviles. En las pantallas de D. dipsaci, los pozos que produjeron 0% de gusanos móviles de manera reproducible se clasifican como golpes fuertes.