Determinación de la capacidad de retención de calcio de mitocondrias aisladas

Coloque las mitocondrias aisladas de las células de neuroblastoma en un tampón que contenga un tinte fluorescente impermeable a la membrana y unido al calcio.

Incubar para permitir que las mitocondrias se estabilicen en el tampón.

Agregue un tampón que contenga calcio e incube agitando.

Los iones de calcio se unen a las moléculas de colorante, provocando su fluorescencia.

Con un espectrómetro de fluorescencia, controle la fluorescencia del tinte en tiempo real.

Ahora, inyecte tampón que contenga calcio a intervalos regulares.

El aumento de la concentración de calcio promueve la absorción de calcio mitocondrial, reduciendo los iones de calcio libres disponibles para unirse al tinte, lo que resulta en una disminución de la fluorescencia.

Una vez que las mitocondrias alcanzan su capacidad máxima de almacenamiento de calcio, la adición adicional de calcio desencadena la apertura del poro de transición de permeabilidad mitocondrial (mPTP).

Esta abertura de poros libera calcio de las mitocondrias hacia el tampón, donde se une al tinte y provoca un aumento de la fluorescencia.

Determinar la cantidad total de calcio necesaria para inducir la apertura de mPTP, que refleja la capacidad de retención de calcio mitocondrial.

Prepare el medio de cloruro de potasio y agregue el tinte fluorescente verde fijador de calcio a una concentración final de 0,5 micromolares antes del experimento. Para determinar la capacidad de retención de calcio mitocondrial, primero transfiera 1 mililitro de mitocondrias aisladas en medios de cloruro de potasio que contengan 0,5 colorantes fluorescentes verdes de unión al calcio micromolar a cada pocillo de una placa de 6 pocillos.

Incube las mitocondrias en el tinte fluorescente verde que se une al calcio en la placa de 6 pocillos a temperatura ambiente. Protéjalo de la luz ambiental durante 1 minuto. Después de la incubación, agregue 4 alícuotas de microlitros de una solución de cloruro de calcio de 20 milimolares a cada pocillo de la placa de 6 pocillos, utilizando la configuración de dispensación automática para introducir 200 nanomoles de calcio por miligramo de proteína mitocondrial.

Utilice un espectrómetro fluorescente para monitorear los cambios de fluorescencia cada tres segundos durante 2 minutos, con una longitud de onda de excitación de 506 nanómetros y una longitud de onda de emisión de 531 nanómetros. La placa está equipada con agitación a 600 RPM durante 3 segundos entre lecturas, controlada por software. Agregue una alícuota adicional de 4 microlitros de solución de cloruro de calcio de 20 milimolares a cada pocillo, luego controle los cambios de fluorescencia cada 3 segundos durante 2 minutos.