Uso de mitocondrias aisladas a partir de cantidades mínimas de ratón músculo esquelético para alta microplacas rendimiento Mediciones respiratorias
30 de octubre de 2015
Los métodos presentados proporcionan instrucciones paso a paso para la realización de una colección de ensayos respirométricos basados en microplacas utilizando mitocondrias aisladas de cantidades mínimas de músculo esquelético de ratón. Estos ensayos son capaces de medir los cambios/adaptaciones mecanicistas en el consumo de oxígeno mitocondrial en un modelo animal comúnmente utilizado.
El objetivo general del siguiente experimento consiste en utilizar la tecnología de consumo de oxígeno basada en microplacas para evaluar la función de la cadena de transporte de electrones, del ciclo del ácido tricarboxílico, de la vía de beta-oxidación y de los transportadores de sustratos. Esto se logra primero preparando el sustrato y las soluciones de inyección para el ensayo. El segundo paso es añadir las soluciones de inyección a un cartucho tric previamente hidratado para calibrar el equipo de consumo de oxígeno.
A continuación, prepare las soluciones de sustrato mitocondrial y cargue estas soluciones en la placa de cultivo celular. Gire la placa de cultivo celular para permitir que las mitocondrias se adhieran al pocillo antes de colocar la placa en el ensayo respirométrico. Se obtienen resultados del instrumento que muestran las tasas de consumo de oxígeno basadas en la respiración mitocondrial para cada ensayo respirométrico.
La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como el electrodo de Clark es que las tecnologías basadas en microplacas permiten una adquisición más eficiente y de mayor rendimiento del consumo de oxígeno con cantidades más pequeñas de mitocondrias. En general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades debido a todas las partes variables implicadas en la preparación de las soluciones para el ensayo. La noche anterior al experimento, hidrate el cartucho de ensayo tric con un mililitro de solución de calibración en un incubador sin CO₂ a 37 grados Celsius. Al día siguiente, retire todas las puntas congeladas y deshiéles en un baño o incubador a 37 grados Celsius. Prepare todas las soluciones de sustrato y soluciones de inyección y guárdelas en hielo. El siguiente paso consiste en programar la máquina de medición del consumo de oxígeno de múltiples pocillos con los parámetros adecuados de mezcla, peso y medición.
Ingrese al software de análisis y seleccione el modo estándar. Acceda al foro de SeaHorse y haga clic en el asistente de ensayos. Una vez dentro del asistente de ensayos, haga clic en protocolo para cambiar los parámetros de mezcla, peso y medición.
Etiquete los pocillos de fondo bajo la pestaña de corrección de fondo y asegúrese de resaltarlos. Realice la corrección de fondo. Etiquete las condiciones haciendo primero clic en la pestaña de grupos y etiquetas, seguida por la pestaña de información del grupo.
Después de ingresar estos parámetros, haga clic en finalizar seguido de guardar plantilla. Para comenzar este procedimiento, cargue las soluciones de inyección en un cartucho de corrida de ensayo. Tenga cuidado de inyectar las soluciones en los puertos adecuados.
Coloque el cartucho del ensayo en la máquina con la esquina marcada en la parte inferior izquierda. Inicie la calibración ingresando primero al software de análisis y luego al modo estándar. Ingrese al foro de invitados de Seahorse.
Abra la plantilla guardada en la unidad XF, en la pestaña de plantillas. Una vez abierta, haga clic en "iniciar" para comenzar la calibración, lo cual tomará aproximadamente 30 minutos. Las mitocondrias para este procedimiento se aislaron del músculo esquelético rojo y se mezclaron suave pero completamente con el sustrato mitocondrial, agitando suavemente la solución con la punta de una pipeta de 200 microlitros a la que se le ha cortado aproximadamente tres milímetros de su extremo.
Después de determinar la concentración de proteína del stock mitocondrial, resuspenda 10 microgramos de proteína mitocondrial por 200 microlitros de la mezcla conocida de sustrato de succinato. Mezcle suavemente pero completamente la solución de sustrato mitocondrial agitando suavemente la solución con una punta de pipeta de 200 microlitros a la que se le ha cortado aproximadamente tres milímetros de su extremo de la misma manera. Resuspenda 14 microgramos de proteína mitocondrial por 200 microlitros de cada una de las mezclas de sustrato restantes y coloque todas las mezclas de sustrato con proteína mitocondrial en hielo.
Coloque una placa de cultivo celular de 24 pocillos sobre hielo y agregue, por triplicado, 50 microlitros por pocillo de cada una de las mezclas de sustratos mitocondriales. Los desarrolladores del ensayo tric basado en microplaca recomiendan dejar un mínimo de dos pocillos en blanco sin mitocondrias, preferiblemente en ambos lados de la placa de cultivo celular. Centrifugue la placa de cultivo celular a 2000 G durante 20 minutos a cuatro grados Celsius para adherir las mitocondrias a los pocillos mientras la placa está en movimiento.
Caliente las soluciones de sustrato en un baño de agua a 37 grados Celsius. Una vez finalizada la centrifugación, cargue cuidadosamente 450 microlitros de cada solución de sustrato encima de los pozos correspondientes. Asegúrese de cargar la placa a temperatura ambiente.
Cargue los pocillos en blanco con 500 microlitros de sustrato en blanco. Los pocillos designados para el ensayo de flujo de electrones deben cargarse con el sustrato para el flujo de electrones, mientras que los pocillos en blanco para el ensayo acoplado pueden cargarse con cualquier sustrato para ensayo de acoplamiento. Después de añadir 450 microlitros de sustrato a cada pocillo, observe la capa de mitocondrias en el pocillo con un aumento de 20x para asegurar que las mitocondrias estén distribuidas uniformemente en una monocapa simple.
Como se muestra en este ejemplo, los pocillos de imagen que no parecen tener una monocapa uniformemente distribuida pueden eliminarse tras la oclusión. Tras confirmar la adhesión mitocondrial, lleve la placa de cultivo celular al instrumento del ensayo Respir métrico. Haga clic en aceptar.
La máquina expulsará la placa de utilidad que se utilizó anteriormente para la calibración. Retire la placa de utilidad y coloque la placa de cultivo celular que contiene las mitocondrias sobre la bandeja. La muesca azul de la placa de cultivo celular debe colocarse en la esquina inferior izquierda de la bandeja.
Haga clic en continuar para iniciar la ejecución del ensayo, que tarda aproximadamente 40 minutos. Una vez finalizada la ejecución, presione expulsar en la pantalla para expulsar la placa de cultivo celular. Después de que la placa sea expulsada, retire y deseche la placa de cultivo celular y el cartucho.
Pulse continuar en la pantalla. La corrida se guardará automáticamente como un archivo XLS en el archivo de datos. Abra este archivo y cambie la visualización de O2 a OCR pulsando la flecha hacia abajo debajo del marcador Y uno.
A continuación, cambie el punto medio a tasas de punto a punto en los datos de tasas mostrados como opción. Haga clic en aceptar. Para aplicar estos cambios, haga clic en la pestaña del modo de grupo de pocillos en la parte inferior izquierda de la pantalla para agrupar los pocillos con condiciones similares.
Finalmente, haga clic en la pestaña de error estándar de la media de la muestra hacia el centro de la pantalla a la izquierda. Estos comandos también podrían configurarse antes del ensayo. Estos trazados representan las tasas de consumo de oxígeno o OCR frente al tiempo para cuatro ensayos de acoplamiento.
El primer panel representa el estado dos, respiración o respiración en ausencia de un DP. El segundo panel tras la inyección de un DP representa la respiración acoplada máxima, también llamada respiración en estado tres. El tercer panel tras la inyección de oligomicina A representa la respiración debida a la fuga de protones, también denominada respiración en estado cuatro oh.
El cuarto panel tras la inyección de FCCP representa la respiración máxima desacoplada, también llamada respiración Estado tres U. El quinto panel tras la inyección de antimicina A representa la inhibición de la respiración oxidativa. Todos los estados mitocondriales presentan una desviación estándar mínima debido a la mezcla exhaustiva del stock mitocondrial y las mezclas de sustrato mitocondrial, así como al establecimiento de una monocapa única de mitocondrias tras la centrifugación de adherencia.
En contraste, cargar cantidades desiguales de mitocondrias en cada pocillo y no lograr una monocapa única de mitocondrias conduce a un aumento en la desviación estándar en cada estado, como indica el trazo azul, que muestra valores de OCR superiores a 1.500 ole por minuto, así como tasas de respiración decrecientes durante el período de medición, ejemplificado por la disminución de los valores de tasa punto a punto. Téngase en cuenta que el trazo rojo muestra tasas punto a punto consistentes y valores máximos de OCR inferiores a 1.500 ole por minuto. La sobrecarga de proteína mitocondrial también puede provocar el agotamiento de oxígeno dentro de la microcámara del pocillo, impidiendo así la medición precisa del OCR en cada medición sucesiva, como indica el trazo azul, que muestra valores de O₂ cercanos a cero durante el período de medición, así como valores iniciales de O₂ significativamente reducidos tras cada medición sucesiva.
Al intentar este procedimiento, es importante recordar tener paciencia al mezclar las soluciones de mitocondrias y sustrato. Una vez dominados estos métodos, se pueden modificar experimentos adicionales para responder otras preguntas, como, ¿cómo influye el tratamiento con fármacos dirigidos a un transportador de sustrato específico en el consumo mitocondrial de oxígeno?
Descripción general
Este artículo presenta métodos para realizar ensayos respirométricos basados en microplacas utilizando mitocondrias aisladas de músculo esquelético de ratón. Estos ensayos miden cambios en el consumo mitocondrial de oxígeno, proporcionando información sobre adaptaciones metabólicas.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Fisiología metabólica
Antecedentes
- Las tecnologías basadas en microplacas mejoran la eficiencia de las mediciones del consumo de oxígeno.
- Las mitocondrias aisladas del músculo esquelético sirven como modelo para estudiar la función mitocondrial.
- Comprender la respiración mitocondrial es fundamental para obtener conocimientos sobre las enfermedades metabólicas.
- Los métodos tradicionales como el electrodo de Clark son menos eficientes para análisis de alto rendimiento.
Objetivo del estudio
- Evaluar la función de la cadena de transporte de electrones y del ciclo de Krebs.
- Evaluar las adaptaciones mitocondriales en respuesta a diferentes sustratos.
- Proporcionar un protocolo detallado para investigadores nuevos en este método.
Métodos Utilizados
- Preparación de soluciones de sustrato y de inyección para el ensayo.
- Calibración de la máquina de consumo de oxígeno utilizando un cartucho de ensayo hidratado.
- Aislamiento y preparación de mitocondrias a partir de músculo esquelético de ratón.
- Realización de ensayos respirométricos para medir las tasas de consumo de oxígeno.
Resultados principales
- Medición exitosa de las tasas de respiración mitocondrial utilizando tecnología de microplacas.
- Demuestra capacidades de mayor rendimiento en comparación con los métodos tradicionales.
- Identificación de las condiciones óptimas para la adherencia mitocondrial y la carga de sustratos.
Conclusiones
- Los ensayos respirométricos basados en microplacas son eficaces para estudiar la función mitocondrial.
- Este método permite un uso eficiente de muestras mitocondriales limitadas.
- Protocolos detallados pueden ayudar a los investigadores a implementar estos ensayos en sus estudios.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este método permite la evaluación de alto rendimiento de la función mitocondrial utilizando una cantidad mínima de tejido muscular esquelético, lo que apoya la validación temprana de dianas en la investigación de enfermedades metabólicas. Al proporcionar datos cuantitativos sobre el consumo de oxígeno a partir de mitocondrias aisladas, aumenta la confianza predictiva en estudios de modulación de vías metabólicas. El enfoque aborda una carencia clave en la fenotipificación mitocondrial escalable para la reducción de riesgos en fases preclínicas.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la investigación mecanicista de la cadena de transporte de electrones, el ciclo del ácido tricarboxílico y las vías de oxidación de ácidos grasos en un modelo relevante para la enfermedad.
- Valor operativo: Requiere únicamente cantidades del orden de microgramos de proteína mitocondrial, conservando así muestras preclínicas valiosas.
- Valor científico: Facilita la comprobación de hipótesis sobre dianas al vincular la modulación de transportadores de sustratos con el rendimiento respiratorio.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Genera mediciones cuantitativas reproducibles de OCR en múltiples estados respiratorios para la selección de compuestos.
- Valor operativo: El formato de microplaca permite la prueba simultánea de condiciones, mejorando el rendimiento del ensayo y la eficiencia de los reactivos.
- Valor científico: La adhesión mitocondrial estandarizada y la carga de sustratos reducen la variabilidad entre pocillos, aumentando la fiabilidad de los datos.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Proporciona datos relevantes sobre las mitocondrias del músculo esquelético relacionados con enfermedades para orientar estrategias de biomarcadores traslacionales.
- Valor operativo: Permite la evaluación longitudinal de las adaptaciones metabólicas en modelos preclínicos.
- Valor científico: Apoya la reducción de riesgos mecanicistas al aislar las contribuciones mitocondriales a los fenotipos del tejido completo.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en flujos de trabajo de descubrimiento temprano a preclínicos, permitiendo la fenotipificación mitocondrial tras la identificación del blanco y antes de las pruebas de eficacia.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la aclaración de vías y la validación funcional de dianas metabólicas en el músculo esquelético.
- Detección: Proporciona lecturas cuantitativas y reproducibles de OCR para la confirmación de compuestos activos y el análisis de la relación estructura-actividad.
- Análisis: Ofrece métricas de respiración resueltas por estado (basal, acoplada, por fuga, desacoplada) para comparar fenotipos metabólicos entre diferentes condiciones.
- Investigación Traducional: Conecta la función mitocondrial in vitro con la continuidad preclínica mediante modelos de tejido relevantes para la enfermedad.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma estandarizada de ensayos mitocondriales aplicable a múltiples dianas metabólicas y áreas de enfermedad.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la interacción con el objetivo al vincular la modulación con cambios respiratorios medibles.
- Valor operativo: Reduce el consumo de muestras mediante mediciones de bajo volumen y alta precisión.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de continuar/interrumpir al proporcionar datos tempranos sobre posibles problemas metabólicos.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de compuestos según sus perfiles de seguridad y eficacia mitocondrial.
Consideraciones de Implementación
- Se requiere experiencia en aislamiento mitocondrial y respirometría para obtener resultados confiables.
- Es necesario tener acceso a un analizador de consumo de oxígeno compatible con microplacas y a los cartuchos asociados.
- La normalización de la cuantificación de proteínas mitocondriales y la preparación de sustratos entre los equipos garantiza la reproducibilidad.
- La adaptación a otros tejidos puede requerir la optimización de los protocolos de aislamiento y adherencia.
- La precisión técnica en la mezcla y la formación de monocapas es fundamental para minimizar la variabilidad en las mediciones de la tasa de consumo de oxígeno (OCR).
