Uso de mitocondrias aisladas a partir de cantidades mínimas de ratón músculo esquelético para alta microplacas rendimiento Mediciones respiratorias

El objetivo general del siguiente experimento es utilizar la tecnología de consumo de oxígeno basada en microplacas para evaluar la función de la cadena de transporte de electrones, la vía de oxidación beta del ciclo del TCA y los transportadores de sustrato. Esto se logra preparando primero el sustrato y las soluciones de inyección para el ensayo. El segundo paso es añadir las soluciones inyectables en un cartucho de ensayo tric previamente hidratado para calibrar la máquina de consumo de oxígeno.

A continuación, prepare las soluciones de sustrato mitocondrial y cargue estas soluciones en la placa de cultivo celular. Gire la placa de cultivo celular para permitir la adherencia mitocondrial a la placa mucho antes de cargar la placa en el ensayo métrico Respira. Se obtienen resultados de instrumentos que muestran tasas de consumo de oxígeno basadas en la respiración mitocondrial para cada ensayo respirométrico.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como el electrodo de Clark, es que las tecnologías basadas en microplacas permiten una adquisición más eficiente y de mayor rendimiento del consumo de oxígeno con cantidades más pequeñas de mitocondrias, generalmente las personas nuevas en este método tendrán dificultades debido a todas las partes móviles involucradas en la preparación de las soluciones para el ensayo. Incubadora de CO2 a 37 grados centígrados al día siguiente, saque todos los tallos congelados y descongélelos en un baño o incubadora a 37 grados centígrados. Prepare todas las soluciones de sustrato y soluciones de inyección y guárdelas en hielo. El siguiente paso es programar la máquina de medición de consumo de oxígeno de múltiples pocillos según el peso de mezcla adecuado y los parámetros de medición.

Ingrese al software de análisis y seleccione el modo estándar. Ingrese al foro de invitados de caballitos de mar y haga clic en el asistente de ensayos. Una vez en el asistente de ensayo, haga clic en protocolo para cambiar el peso de la mezcla y los parámetros de medición.

Etiquete los pozos de fondo debajo de la pestaña de corrección posterior y asegúrese de resaltarlos. Realiza la corrección de fondo. Etiquete las condiciones haciendo clic primero en la pestaña de grupos y etiquetas, seguida de la pestaña de información del grupo.

Una vez introducidos estos parámetros, haga clic en finalizar seguido de guardar plantilla. Para comenzar este procedimiento, cargue las soluciones de inyección en un cartucho de ensayo. Tenga cuidado de inyectar las soluciones en los puertos adecuados.

Cargue el cartucho de ensayo en la máquina con una esquina con muescas en la parte inferior izquierda. Inicie la calibración introduciendo primero el software de análisis y, a continuación, entrando en el modo estándar. Entra en el foro de invitados de caballitos de mar.

Abra la plantilla guardada en la unidad XF, en la pestaña de plantillas. Una vez abierto, haga clic en iniciar para comenzar la calibración, que tardará unos 30 minutos. Las mitocondrias para este procedimiento se aislaron del músculo esquelético rojo, se mezclaron suave pero completamente el sustrato de las mitocondrias agitando suavemente la solución con una punta de pipeta de 200 microlitros a la que se le habían cortado unos tres milímetros de su extremo.

Después de determinar la concentración de proteína del stock mitocondrial, resus suspende 10 microgramos de proteína mitocondrial por cada 200 microlitros de la mezcla de sustrato conocida de pudrición por succinato. Mezcle la solución de sustrato mitocondrial suave pero bien agitando suavemente la solución con una punta de pipeta de 200 microlitros a la que se le hayan cortado aproximadamente tres milímetros de su extremo de la misma manera. Reeses Band, 14 microgramos de proteína mitocondrial por 200 microlitros de cada una de las mezclas de sustrato restantes coloque todas las mezclas de sustrato de proteína mitocondrial en hielo.

Colocar una placa de cultivo celular de 24 pocillos sobre hielo y por triplicado cargar 50 microlitros por pocillo de cada una de las mezclas de sustrato mitocondrial. Los desarrolladores del ensayo tric basado en microplacas recomiendan dejar un mínimo de dos pocillos en blanco sin mitocondrias, preferiblemente a ambos lados de la placa de cultivo celular. Girar la placa de cultivo celular a 2000 G durante 20 minutos a cuatro grados centígrados para que las mitocondrias se adhieran a los pocillos mientras la placa gira.

Calentar las soluciones de sustrato en un baño de agua a 37 grados centígrados. Una vez completado el centrifugado, cargue cuidadosamente 450 microlitros de cada solución de sustrato en la parte superior de sus respectivos pocillos. Asegúrese de cargar la placa a temperatura ambiente.

Cargue los pozos en blanco con 500 microlitros de sustrato en blanco. Los pocillos designados para el ensayo de flujo de electrones deben cargarse con el sustrato de flujo de electrones, mientras que los pocillos en blanco del ensayo acoplado se pueden cargar con cualquier sustrato de ensayo de acoplamiento. Después de agregar 450 microlitros de sustrato a cada uno, observe la capa de mitocondrias en el pocillo con un aumento de 20x para garantizar que las mitocondrias se dispersen uniformemente en una sola monocapa.

Como se muestra en este ejemplo, los pocillos de imagen que no parecen tener una monocapa distribuida uniformemente se pueden eliminar después de la oc. Después de confirmar la adherencia mitocondrial, lleve la placa de cultivo celular al instrumento de ensayo métrico Respir. Haga clic en Aceptar.

La máquina expulsará la placa de utilidad que se utilizó anteriormente para la calibración. Retire la placa de utilidad y coloque la placa de cultivo celular que contiene las mitocondrias en la bandeja. La muesca azul de la placa de cultivo celular debe colocarse en la esquina inferior izquierda de la bandeja.

Haga clic en continuar para iniciar la ejecución del ensayo, que tarda unos 40 minutos. Una vez completada la ejecución, presione expulsar en la pantalla para expulsar la placa de cultivo celular. Una vez expulsada la placa, retire y deseche la placa y el cartucho de cultivo celular.

Pulsa continuar en la pantalla. La ejecución se guardará automáticamente como un archivo XLS en el archivo de datos. Abra este archivo y cambie la visualización de O2 a OCR presionando la flecha hacia abajo debajo del marcador Y uno.

A continuación, cambie el punto medio a tasas de punto a punto en los datos de tasa que se muestran como opción. Haga clic en Aceptar. Para aplicar estos cambios, haga clic en la pestaña Modo de grupo de pozos en la parte inferior izquierda de la pantalla para agrupar pozos de condiciones similares.

Por último, haga clic en la pestaña de error estándar medio de muestra hacia el centro de la pantalla a la izquierda. Estos comandos también se pueden configurar antes del ensayo. Estos trazados representan las tasas de consumo de oxígeno o el OCR en función del tiempo para cuatro ensayos de acoplamiento.

El primer panel representa el estado dos, respiración o respiración en ausencia de un DP. El segundo panel después de la inyección de A DP representa la respiración acoplada máxima, también llamada respiración de estado tres. El tercer panel después de la inyección de oligo micina. A representa la respiración debida a la fuga de protones, también llamada respiración en estado cuatro.

El cuarto panel después de la inyección de FCCP representa la respiración máxima desacoplada, también llamada respiración U de estado tres. El quinto panel después de la inyección de antimicina A representa la inhibición de la respiración oxidativa. Todos los estados mitocondriales tienen una desviación estándar mínima debido a la mezcla completa del stock mitocondrial y las mezclas de sustrato mitocondrial y al logro de una sola monocapa de mitocondrias después del espín de adherencia.

Por el contrario, la carga de mitocondrias desiguales en cada pocillo y no alcanzar una sola monocapa de mitocondrias conduce a un aumento de la desviación estándar en cada estado, como lo indica la traza azul, que muestra valores de OCR superiores a 1.500 ole por minuto, así como una disminución de las tasas de respiración en el transcurso del período de medición, ejemplificado por la caída en los valores de tasa punto a punto. Tenga en cuenta que el seguimiento rojo muestra velocidades punto a punto consistentes y los valores máximos de OCR están por debajo de 1.500 ole por minuto. La sobrecarga de proteínas mitocondriales también puede provocar el agotamiento del oxígeno dentro de la microcámara del pocillo, lo que impide la medición precisa del OCR para cada medición sucesiva, como lo indica el Blue Trace, que muestra valores de O2 cercanos a cero durante el período de medición, así como valores de O2 iniciales significativamente reducidos después de cada medición sucesiva.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que hay que tener pacientes al mezclar las mitocondrias y las soluciones de sustrato. Una vez que se dominan estos métodos, se pueden deformar experimentos adicionales para responder a preguntas adicionales como, ¿cómo influyen los tratamientos dirigidos a fármacos de un determinado transportador de sustrato en el consumo de oxígeno mitocondrial?