Ensayo de electroquimioluminiscencia para la cuantificación de los niveles de proteínas diana en el lisado cerebral

Para la detección cuantitativa de una proteína específica en el lisado cerebral de ratón mediante electroquimioluminiscencia, ECL, inmunoensayo, comience con una placa de ensayo de pocillos múltiples.

Los pozos comprenden electrodos conductores de trabajo y contraelectrodos, completando el circuito eléctrico. Una capa dieléctrica separa los electrodos, mejorando la sensibilidad del ensayo.

Agregue anticuerpos monoclonales primarios de ratón contra la proteína diana a los pocillos. Los electrodos de trabajo, con mayor capacidad de unión, facilitan que los anticuerpos se inmovilicen sobre ellos.

Incubar con una solución que contenga proteínas, uniéndose a las superficies de unión restantes del pocillo, reduciendo la interferencia de fondo.

Agregue lisado de fracción nuclear de cerebro de ratón. La proteína diana en el lisado se une específicamente a los anticuerpos monoclonales.

Agregue anticuerpos policlonales no marcados, reconociendo y uniéndose a los epítopos de la proteína, que se une a los anticuerpos monoclonales primarios en el electrodo. Agregue anticuerpos secundarios específicos marcados con complejo de rutenio, uniéndose a los anticuerpos no marcados. Agregue un tampón adecuado que contenga tensioactivo, proporcionando un entorno de generación de ECL adecuado, y tripropilamina, TPA.

Coloque la placa de pocillos múltiples en el sistema de detección ECL. Tras la aplicación de potencial a través de los electrodos, el complejo de rutenio unido a los anticuerpos se oxida. Al mismo tiempo, el TPA se oxida y pierde espontáneamente un protón.

El radical TPA resultante reduce el complejo de rutenio oxidado a su estado excitado. Al relajarse a su estado fundamental, el complejo de rutenio emite un fotón detectado por el fotodetector.

La intensidad de la luz medida es representativa de la concentración de proteína específica del lisado.

Saca la placa de 96 pocillos del refrigerador y retira el papel de aluminio. Retire la solución de recubrimiento de anticuerpos de los pocillos arrojándola a un contenedor de desechos. Luego, golpee el plato sobre una toalla de papel para eliminar cualquier resto de solución.

A continuación, agregue 125 microlitros de solución de bloqueo a cada pocillo. Luego, vuelva a sellar la placa con papel de aluminio adhesivo. Coloque la placa en un agitador de microplacas orbital, a 800 RPM, e incube durante 90 minutos a temperatura ambiente.

Descongele en hielo, un vial de solución madre de proteína MeCP2 o TAT-MeCP2, lisados de cerebro de ratón y lisados de HDF. Diluya la solución madre de proteínas en tubos limpios, como se describe en la Tabla 2 del manuscrito.

A continuación, diluya las muestras de lisado. Para los lisados cerebrales de ratón, use de 1 a 20 microgramos por cada 25 microlitros de tampón de lisis. Para el lisado HDF, agregue de 0,25 a 1 microgramo por cada 25 microlitros de tampón de lisis.

Después de que la placa de 96 pocillos se haya incubado durante 90 minutos, retire la solución de bloqueo de los pocillos arrojándola a un contenedor de desechos. Luego, golpee el plato sobre una toalla de papel para eliminar cualquier resto de solución. Luego, lave la placa 3 veces con 150 microlitros de solución de lavado, agregando la solución de lavado y retirándola inmediatamente.

Agregue 25 microlitros de estándares y muestras a los pocillos de la placa de 96 pocillos. Selle la placa e incube durante otras cuatro horas a temperatura ambiente, con agitación constante de 800 RPM.

Descongele el anticuerpo de detección no marcado, policlonal conejo anti-MeCP2, en hielo. Usando una solución diluyente de ensayo, diluya el anticuerpo en una proporción de 1: 6000. Cuando la placa de 96 pocillos haya terminado de incubarse en el agitador, retire los estándares y las muestras colocando la placa en un contenedor de desechos. Luego, golpee el plato sobre una toalla de papel para eliminar cualquier resto de solución.

Lave la placa 3 veces con 150 microlitros de solución de lavado agregando la solución de lavado y retirándola inmediatamente. Agregue 25 microlitros de solución de anticuerpos de detección sin marcar a cada pocillo con la pipeta multicanal. Sellar la placa e incubarla durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación constante a 800 RPM.

Obtenga el anticuerpo secundario específico del refrigerador y colóquelo en hielo. Diluya el anticuerpo secundario en una solución de diluyente de ensayo y mezcle suavemente.

Para eliminar el anticuerpo de detección libre sin etiquetar de la placa de 96 pocillos, colóquelo en el contenedor de desechos y luego, golpee la placa con una toalla de papel. Después de lavar la placa 3 veces, como se describió anteriormente, agregue 25 microlitros de anticuerpo secundario a cada pocillo con la pipeta multicanal. Sellar la placa e incubarla durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación constante a 800 RPM.

Retire el anticuerpo secundario libre arrojándolo al contenedor de desechos y golpeando el plato con una toalla de papel, y luego, lave el plato tres veces como se describió anteriormente.

A cada pocillo de la placa, agregue 150 microlitros de tampón de lectura de oro 1X basado en tris con surfactante, que contiene tripropilamina como co-reactivo para la generación de luz.

Para evitar producir burbujas de aire, utilice técnicas de pipeteo inverso. Coloque la placa de 96 pocillos en la plataforma de microplacas con un sistema de detección de electroquimioluminiscencia.

Con la cámara CCD incorporada, comience inmediatamente a capturar datos. Registre los recuentos de señales que corresponden a unidades de luz relativas y son directamente proporcionales a la intensidad de la luz.