Un alto rendimiento, multiplexado y dirigida proteómico CSF ​​ensayo para cuantificar neurodegenerativas Biomarcadores y apolipoproteína E isoformas Estado

Se describe un alto rendimiento, múltiplex, y el ensayo de líquido cefalorraquídeo proteómica dirigida (CSF) desarrollado con potencial para la traducción clínica. La prueba se puede cuantificar marcadores potenciales y factores de riesgo para la neurodegeneración, tales como las variantes de la apolipoproteína E (E2, E3 y E4), y medir su expresión alélica.

El objetivo general de este método es cuantificar de forma rápida y asequible múltiples biomarcadores en el líquido cefalorraquídeo, o LCR, para evaluar su uso en el diagnóstico y el seguimiento del tratamiento. Se trata de un nuevo ensayo que nos permite medir biomarcadores que antes no eran posibles de medir. Y creemos que esto se puede utilizar con fines diagnósticos y también para diferenciar entre diferentes enfermedades neurodegenerativas y, potencialmente, también para dar información pronóstica.

La principal ventaja de esta técnica es que está diseñada para ser rápida, sencilla en la preparación de la muestra, muy específica y rentable para su traducción al laboratorio clínico. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia o el diagnóstico, ya que esta prueba de alto rendimiento puede utilizarse en futuros ensayos clínicos para nuevas terapias en neurodegeneración. Esta metodología también se puede aplicar a otras enfermedades y tejidos, como la orina para los trastornos renales, el plasma para la miocardiopatía y las células para la pluripotencia.

Para comenzar este procedimiento, vuelva a suspender los péptidos sintéticos deseados a una concentración de un miligramo por mililitro, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Prepare diluciones de uno en 10 del péptido a partir de la concentración de existencias y agrupe 1.000 picomoles de cada péptido en un tubo de microcentrífuga de baja unión. Seque la muestra de péptido agrupada en un concentrador SpeedVac.

Cuando termine, almacene la muestra a menos 20 grados centígrados. A continuación, alícuota 100 microlitros de LCR en tubos de microcentrífuga de baja fijación. Liofiliza las muestras de líquido cefalorraquídeo.

Resuspender una alícuota de la muestra peptídica agrupada en tampón de digestión para obtener concentraciones de 10 y un picomol por microlitro. Ahora, agregue la muestra de péptido agrupada a las alícuotas liofilizadas de 100 microlitros de LCR, a concentraciones de cero, uno, dos, cinco, 10 y 15 picomolares. Luego, agregue 20 nanogramos de proteína intacta no relacionada para que actúe como un estándar interno y controle la eficiencia de la digestión de la tripsina.

Agregue tampón de digestión a las alícuotas del LCR hasta un volumen final de 20 microlitros y vórtice las muestras. A continuación, digiera las muestras según el protocolo estándar añadiendo 1,5 microlitros de ditiotreitol y agitando a temperatura ambiente durante una hora. A continuación, añada tres microlitros de yodoacetamida a las muestras y agite a temperatura ambiente durante 45 minutos en la oscuridad.

A continuación, añade 165 microlitros de agua bidestilada. Agregue 10 microlitros de una solución de tripsina modificada de grado secuencial, de 0,1 microgramos por microlitro, resuspendida en tampón de bicarbonato de amonio de 50 milimolares a las muestras. Incubar las muestras en un baño de agua a 37 grados centígrados durante la noche.

Luego, detenga la digestión congelando las muestras. Después de descongelar el líquido cefalorraquídeo se digiere en hielo, centrifugar a 16.000 veces g durante 10 minutos. Cuando termine, transfiera 60 microlitros de cada digestión a un inserto de vidrio de 300 microlitros.

Utilizando un sistema LC-MS, equipado con una columna UPLC C18, inyecte la concentración más alta desde el punto de la curva estándar utilizando un gradiente lineal de acetonitrilo de 10 minutos, de uno a 40%. Una vez completada la ejecución, abra el cromatograma resultante en el software y anote el tiempo de retención y las dos transiciones más intensas por péptido. Con base en esta información, actualice un método de monitoreo de reacciones múltiples o MRM creado previamente con canales temporizados para medir péptidos.

Para mantener la sensibilidad, mantenga cada canal con puntos por pico superiores a ocho y un tiempo de permanencia superior a 0,01 segundos durante al menos una transición para cada péptido. Incluya los retardos de disolvente en el método MRM seleccionando retardos de disolvente en eventos de método en el archivo de método MS. Es fundamental hacer coincidir correctamente el pico correcto en un método de HPLC corto.

Esto se puede hacer utilizando los péptidos con picos en la matriz que se utilizan para una curva estándar y observando las múltiples transiciones durante el desarrollo del método. Por último, revise manualmente la anotación de datos para garantizar la precisión. Analice cada péptido y la proporción con un estándar interno adecuado marcado con isótopos estables.

Aquí se muestra un cromatograma de los marcadores peptídicos significativos del ensayo de LCR de alto rendimiento. Los datos proporcionan proporciones estandarizadas con el estándar interno relevante marcado con isótopos estables, que se pueden utilizar para determinar las concentraciones absolutas de LCR y analizar estadísticamente los cambios en las muestras clínicas. La cuantificación de los 74 péptidos incluidos en este ensayo de LCR reveló que 25 estaban alterados significativamente en el LCR de pacientes con demencia, y aquí se muestran los resultados de los marcadores de demencia pro-orexina y proteína YKL similar a la quitinasa-3.

La ApoE4 es un factor de riesgo conocido para la enfermedad de Alzheimer, y la detección de las isoformas de ApoE se basa en la detección de los péptidos correspondientes a los cambios de aminoácidos para las isoformas E2 y E4. Aquí se muestra el patrón de pico esperado para cada combinación de isoformas. Una vez que se establece el método, el ensayo se puede realizar en un día si se realiza correctamente. Tras el desarrollo de este método, ha sido posible medir un nuevo conjunto de biomarcadores con alta sensibilidad analítica y especificidad, lo que permitirá a los investigadores evaluar las enfermedades neurodegenerativas de una nueva manera.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo diseñar y optimizar un ensayo MRM para la sensibilidad y la especificidad. No olvide que trabajar con DTE, termitas, ácido fórmico y tejido humano puede ser extremadamente peligroso y se deben aplicar precauciones, como el uso de guantes, durante este procedimiento.