PCR digital basada en chip en tubo para la cuantificación de variantes de un solo nucleótido

La reacción en cadena de la polimerasa digital, o dPCR, es útil para cuantificar variantes de un solo nucleótido, o SNV, una mutación en la que la sustitución de un solo nucleótido en una posición específica del genoma crea dos variaciones de nucleótidos o alelos.

Para comenzar la cuantificación utilizando la técnica de dPCR de chip en un tubo, tome una muestra de ADN que contenga SNV, el alelo mutante y el alelo de tipo salvaje correspondiente. Agregue una mezcla que contenga una enzima ADN polimerasa termoestable, dNTP y cebadores.

A continuación, agregue sondas de oligonucleótidos específicas de alelos, marcadas con reporteros de fluorescencia de diferentes colores para distinguir entre los alelos, y una molécula extintora. La proximidad del apagador al reportero suprime su fluorescencia.

Divida la solución en las cámaras de reacción de un chip microfluídico. Cada cámara que contiene un alelo sirve como un recipiente de reacción independiente.

Coloque el tubo con el chip dentro de un termociclador y comience la reacción. A alta temperatura, el ADN bicatenario se desnaturaliza en hebras simples. Baje la temperatura para recocer los cebadores y las sondas de oligonucleótidos a sus