PCR digital basada en chip en tubo para la cuantificación de variantes de un solo nucleótido

La reacción en cadena de la polimerasa digital, o dPCR, es útil para cuantificar variantes de un solo nucleótido, o SNV, una mutación en la que la sustitución de un solo nucleótido en una posición específica del genoma crea dos variaciones de nucleótidos o alelos.

Para comenzar la cuantificación utilizando la técnica de dPCR de chip en un tubo, tome una muestra de ADN que contenga SNV, el alelo mutante y el alelo de tipo salvaje correspondiente. Agregue una mezcla que contenga una enzima ADN polimerasa termoestable, dNTP y cebadores.

A continuación, agregue sondas de oligonucleótidos específicas de alelos, marcadas con reporteros de fluorescencia de diferentes colores para distinguir entre los alelos, y una molécula extintora. La proximidad del apagador al reportero suprime su fluorescencia.

Divida la solución en las cámaras de reacción de un chip microfluídico. Cada cámara que contiene un alelo sirve como un recipiente de reacción independiente.

Coloque el tubo con el chip dentro de un termociclador y comience la reacción. A alta temperatura, el ADN bicatenario se desnaturaliza en hebras simples. Baje la temperatura para recocer los cebadores y las sondas de oligonucleótidos a sus regiones complementarias.

A una temperatura de extensión adecuada, la ADN polimerasa extiende los cebadores y escinde la sonda. La distancia desde el apagador permite la emisión de fluorescencia del reportero.

Lea las señales de fluorescencia de diferentes colores y cree un gráfico de posición para detectar las cámaras que contienen los alelos.

Para determinar la frecuencia del alelo mutante, la fracción del alelo variante, calcule la proporción de cámaras que contienen el alelo mutante frente al alelo de tipo salvaje.

Agregue cebadores, sondas y ADN genómico previamente diseñados a una nueva tira de 8 tubos, para lograr un volumen total de 15 microlitros. Pipetea hacia arriba y hacia abajo para mezclar.

Agregue la plataforma de carga a las virutas incorporadas en la tira de 8 tubos nueva y luego, coloque la tira de tubos en el cargador automático. Asegúrese de que haya un contacto entre las virutas y la plataforma de carga. A continuación, coloque el control deslizante de carga en la plataforma y use un tope para mantener el control deslizante fuera del cargador. Pipetea 15 microlitros de la mezcla de PCR cerca de la punta del control deslizante y luego presiona el botón del cargador para hacer funcionar el cargador durante 1 minuto.

Retire la tira de tubo del cargador después de la ejecución y colóquela en el potenciador de sellado. Empuje con cuidado la tapa deslizante y el borde de la tapa superior. Ejecute el potenciador de sellado durante aproximadamente 2 minutos. Si el sellado está incompleto, indicado por un charco de líquido, repita la ejecución durante un minuto más.

Agregue 230 microlitros de líquido de sellado a los tubos. Coloque la tira de tubo en el termociclador y ejecute la PCR como se describe en el protocolo. Si hay una distribución desigual de las particiones positivas, ajuste la temperatura o la duración de la PCR.

Para detectar y analizar la intensidad de fluorescencia de los productos de PCR, coloque la tira de tubo en la plantilla de detección y agregue 6 mililitros de agua destilada. Elimine las burbujas de aire visibles con una punta de pipeta.

Cargue la plantilla en el detector. En el software de detección, seleccione las pestañas "Fluorescencia", "Experimento" y luego "Muestra/NTC", y haga clic en el botón "Ejecutar" para iniciar la ejecución. Después de completar la ejecución, confirme el gráfico de posición, el histograma y el diagrama de dispersión 2D.

Para recoger el producto de PCR, retire el líquido de sellado del tubo. Agregue 100 microlitros de tampón TE y agite vigorosamente durante 30 segundos. Centrifugar brevemente los tubos en una centrífuga de mesa y proceder como se describe en el protocolo de texto, para terminar de recolectar el producto de PCR.