PCR digital basada en chip para detectar variantes raras de transcripción utilizando un chip nanofluídico

La técnica de PCR digital basada en chip divide una sola reacción en las cámaras de un chip nanofluídico. La amplificación de las secuencias particionadas permite la detección de variantes raras de transcripción: transcripciones no canónicas que ocurren a baja frecuencia.

Para comenzar, tome una muestra que contenga ADNc de la variante de transcripción rara objetivo y la variante común. Agregue una solución que contenga ADN polimerasa termoestable, dNTP y cebadores.

Agregue sondas de oligonucleótidos específicas de variantes de transcripción comunes y raras, marcadas con diferentes reporteros fluorescentes y moléculas extintoras. El apagador absorbe la fluorescencia del reportero cuando está muy cerca.

Cargue la mezcla en el chip nanofluídico. La solución se divide en nanocámaras de tamaño uniforme. Cada cámara que contiene un ADNc sirve como un recipiente de reacción independiente.

Inicie el proceso de ciclo térmico. Una alta temperatura de desnaturalización separa el ADN bicatenario en hebras simples. Baje la temperatura, permitiendo que los cebadores y las sondas de oligonucleótidos se recocan a las regiones complementarias de las hebras individuales de ADN.

Aumente la temperatura para alcanzar el paso de extensión, donde la ADN polimerasa extiende el cebador y escinde la sonda. La distancia desde el apagador permite la emisión de fluorescencia del reportero. Lea la señal de fluorescencia.

Cree un diagrama de dispersión que represente las cámaras con el objetivo de transcripción rara amplificado y las cámaras desprovistas del objetivo. Las señales positivas para el objetivo indican la presencia de la variante de transcripción rara en la muestra.

Para comenzar, deje que la mezcla maestra y el ensayo se descongelen a temperatura ambiente durante al menos 20 minutos. Luego, cargue tubos de 0,5 mililitros con alícuotas de 6 microlitros de las muestras de ADNc. Además, haga un tubo de control sin plantilla. A continuación, agite suavemente la mezcla maestra y alícuotas de 8,7 microlitros por reacción en un tubo estéril.

Luego, para cada reacción, agregue 0,87 microlitros del cebador de ensayo personalizado y agregue 1,83 microlitros de agua libre de nucleasas. Mezcle la combinación suavemente y transfiera 11,4 microlitros a cada tubo que contenga ADNc y al control sin plantilla. Luego, mezcle los tubos suavemente y agrupe el contenido del tubo mediante centrifugación por pulsos. Para obtener resultados óptimos, cargue las virutas lo antes posible.

Enchufe el cargador de virutas y espere hasta que la luz indicadora se vuelva verde. Luego, prepare la jeringa de líquido de inmersión tirando suavemente del émbolo a 1 a 2 milímetros, luego, retire la tapa y agregue la punta.

A continuación, tome nota del código escrito en la tapa de un nuevo chip, luego, sostenga la tapa con cuidado por el costado, retire la película protectora y colóquela en el nido de la tapa con el lado adhesivo hacia arriba. Ahora, presione hacia abajo la palanca para abrir la abrazadera y cargue con cuidado el chip en el nido de chips.

A continuación, coloque una nueva cuchilla de carga en el cargador. Empújelo suavemente para asegurarse de que esté firmemente en su lugar. Ahora, transfiera 14,5 microlitros de mezcla de reacción a la cuchilla de carga. No haga burbujas de aire y no desvíe la hoja. Luego, presione el botón negro "Cargando" para distribuir el volumen en el chip.

Es importante confirmar que la cuchilla de carga esté en su lugar. A continuación, mientras llena la cuchilla, no presione la pipeta hasta el segundo tope para evitar introducir burbujas. Además, no desvíe la hoja con la punta.

Continúe usando la jeringa para transferir aproximadamente 20 gotas de líquido de inmersión a la superficie del chip. Tenga cuidado de no tocar la superficie con la punta y cubra completamente la superficie sin desbordarla. A continuación, gire el brazo del rotor para que la tapa entre en contacto con el chip y presione hacia abajo durante 15 segundos. Luego, presione el botón de la tapa para liberar el chip y volver a colocar el brazo del cargador en su posición de reposo. Ahora, abra la abrazadera y sostenga el chip ensamblado en un ángulo de 45 grados para dispensar con cuidado el líquido de inmersión a través del puerto de llenado a través de una jeringa. Luego, gire ligeramente el chip para eliminar las burbujas de aire y luego elimine el exceso de líquido con la toallita estéril.

Evite derramar líquido de inmersión en el borde de la punta. Si eso sucede, retire con cuidado el exceso antes de sellar.

Finalmente, selle la caja de chips despegando suavemente la etiqueta de la tapa y luego, bloqueando el puerto de llenado durante al menos 5 segundos. Ahora, use el chip dentro de las dos horas y, hasta entonces, guárdelo en la oscuridad.

Para configurar la reacción, abra la tapa e instale los adaptadores en ambos bloques, incluso cuando se usa un solo bloque. Luego, coloque un chip en los bloques de muestra y oriente sus puertos de llenado hacia la parte delantera del termociclador y eleve ligeramente el puerto. Usa fichas vacías para equilibrar los dos bloques.

A continuación, coloque la almohadilla térmica sobre la configuración para cubrir completamente los chips. Luego, programe los ciclos, cierre la tapa y comience la reacción.

Cuando termine la reacción, apague el termociclador, retire las almohadillas térmicas y luego retire las virutas. Deje que las papas fritas se descongelen a temperatura ambiente durante al menos 10 minutos en la oscuridad y analícelas dentro de una hora. Limpie la superficie del chip con isopropanol mientras los inspecciona en busca de fugas u otros problemas.

Para guardar los datos, inserte una memoria USB en el sistema detector donde se pueden guardar los datos. Luego, abra la bandeja de chips del sistema detector y cargue el chip boca arriba. Cierre la bandeja y espere 30 segundos para que se procesen los datos. Luego, retire el chip y repita el proceso para el siguiente chip.

A continuación, mueva la memoria USB del detector a una computadora y transfiera los archivos. Abra el software basado en la nube, luego cree un proyecto e importe todos los archivos de datos para los chips de interés. Luego, en la pestaña "Chips definidos", seleccione el tinte y el ensayo utilizados. Determine si el chip es aceptable visualizándolo en la pestaña "Revisar datos". Si la muestra se cargó bien, se deberían utilizar al menos 13.000 puntos.

A continuación, mire el diagrama de dispersión del chip seleccionado. Allí, aplique un umbral definido por el tipo de ensayo. Para la señal de colorante indicador de amidita de fluoresceína, use un umbral de 6,000. Ahora, elimine cualquier señal dudosa que pueda resultar en falsos positivos. Seleccione el punto cuestionable en el diagrama de dispersión con la herramienta "Lazo" y seleccione la opción "Indeterminado".

Todos los puntos positivos restantes indican la presencia de copias de ADNc del raro objetivo analizado.