Aislamiento de los precursores de células B subconjuntos de Sangre del Cordón Umbilical

El objetivo general de este procedimiento es aislar subconjuntos de células B precursoras de la sangre del cordón umbilical. Esto se logra aislando primero las células mononucleares de la sangre del cordón umbilical mediante centrifugación en gradiente de densidad. En el segundo paso, los antígenos de superficie celular se marcan con anticuerpos conjugados con biotina para agotar magnéticamente cualquiera de las células no B restantes.

A continuación, las células B aisladas se marcan con fluorescencia con anticuerpos contra los antígenos de superficie celular CD 19, CD 34 y CD 45. En el paso final, las células se clasifican por citometría de flujo para recuperar los subconjuntos de células B precursoras. En última instancia, se pueden adquirir células de número y calidad suficientes para su utilización en ensayos posteriores que requieren ADN y ARN de alta calidad.

Una ventaja de la estrategia de clasificación celular sobre los métodos alternativos es que nuestra estrategia requiere menos tiempo en el citómetro de flujo y solo tres anticuerpos fluorescentes, lo que reduce en gran medida el costo del experimento. En general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades con la variedad de métodos disponibles para preparar las células sanguíneas del cordón umbilical para la citometría de flujo y la complejidad de la preparación del citómetro de flujo. Aunque este método puede proporcionar información sobre las células B precursoras sanas, también se puede aplicar a otros tipos de células presentes en la sangre del cordón umbilical, como las células T, o a estudios de enfermedades que involucran células hematopoyéticas, como la leucemia o el linfoma.

La demostración visual de este método es crítica porque es difícil describir las técnicas adecuadas requeridas para procesar la sangre y las células del cordón umbilical de una manera que maximice la viabilidad celular y reduzca la presencia de desechos contaminantes. Para aislar las células mononucleares de la sangre del cordón umbilical, primero diluya ocho alícuotas de mililitros de la sangre del cordón umbilical con 24 mililitros de DPBS. Luego, coloque lentamente cada mezcla de sangre diluida encima de 15 mililitros de vatios ALI de fipa plus en tubos cónicos de 50 mililitros, teniendo cuidado de mantener las capas separadas.

A continuación, centrifugar la sangre durante 40 minutos a 400 veces G y 20 grados Celsius mientras las células se separan mediante una etiqueta de gradiente de densidad, siete tubos de fondo redondo de cinco mililitros con la fecha de identificación de la muestra y cualquier otra información apropiada como se describe en la tabla. Después de la separación, las células mononucleares permanecerán en la interfaz fluorescente fi opaque plus, mientras que los granulocitos y eritrocitos sedimentarán y aspirarán las capas plasmáticas superiores, evitando el contacto con las capas de células mononucleares. A continuación, utilice una pipeta de vidrio de 10 mililitros para recoger cuidadosamente las capas de células mononucleares de tres de los tubos de 50 mililitros en un único tubo nuevo de 50 mililitros.

Llene este nuevo tubo con PBS, mezcle suavemente la suspensión celular y luego lave las células dos veces durante 10 minutos a 300 veces G y 20 grados Celsius. Después del primer lavado, vuelva a suspender los pellets y transfiéralos a un solo tubo cónico de 50 mililitros. Después del segundo lavado, suspenda suavemente el pellet de celda en 200 microlitros de PBS, transfiera un microlitro de la suspensión celular a un mililitro de PBS en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros para contar.

A continuación, lave las células en el tubo de 50 mililitros con más PBS, eliminando completamente el sobrenadante sin alterar el pellet. Para aislar las células B de las células mononucleares, primero Resus suspende el pellet recién lavado en 160 microlitros de cuatro grados centígrados. Tampón E-D-T-A-P-B-S de DGA recién preparados.

A continuación, mezcle 40 microlitros del kit de aislamiento de células B, el cóctel de anticuerpos bio ITIN con la suspensión celular. Después de incubar las células durante 10 minutos a cuatro grados centígrados, lave el anticuerpo libre en un mililitro de cuatro grados centígrados, tampón E-D-T-A-P-B-S por cada 10 millones de células. A continuación, vuelva a suspender el pellet celular en 320 microlitros de cuatro grados centígrados de tampón E-D-T-A-P-B-S.

Ahora mezcle 80 microlitros de microesferas anti biotina con la suspensión celular después de una incubación de 15 minutos a cuatro grados centígrados. Lava las células de nuevo mientras las células están girando. Coloque una columna LS en el campo magnético de un separador máximo y gotee tres mililitros de tampón E-D-T-A-P-B-S a través de la columna.

A continuación, resuspenda hasta 100 millones de células lavadas en 500 microlitros de cuatro grados centígrados, tampón E-D-T-A-P-B-S. A continuación, pipetee la suspensión de células en la columna, recogiendo las células no marcadas que pasan a través de la columna en un tubo cónico de 50 mililitros. Agregue dos mililitros adicionales de cuatro grados Celsius, tampón E-D-T-A-P-B-S a las paredes del tubo cónico original, un mililitro a la vez y luego mezcle suavemente y pipetee la suspensión de células residuales en la columna cada vez para asegurarse de recuperar todas las células.

Finalmente, llene el tubo cónico que contiene las células no marcadas con PBS. Después de la centrifugación, las células eliminan cuidadosamente el sobrenadante sin alterar la pelletización celular. A continuación, resus suspender suavemente las células en 200 microlitros de tampón E-D-T-A-P-B-S.

Comience el etiquetado de anticuerpos. Paso transfiriendo primero un microlitro de la suspensión celular al tubo sin teñir previamente etiquetado. Agregue 500 microlitros de tampón E-D-T-A-P-B-S al tubo y guárdelo en hielo.

Apague todas las luces y luego agregue 20 microlitros de anticuerpos CD 19, CD 34 y CD 45 por cada millón de células en la suspensión celular restante. Mezcle bien y coloque el tubo en la oscuridad durante 30 minutos a temperatura ambiente. A continuación, transfiera 40 microlitros de la suspensión celular marcada con anticuerpos al tubo marcado con siete A a D.

Lave las celdas en un mililitro de PBS y luego vuelva a suspender el palet en 100 microlitros de tampón de unión. Agregue siete microlitros de siete A a d a estas células y luego incube en la oscuridad durante 10 minutos a temperatura ambiente mientras las células se marcan con siete A a d, complete el tubo de las células marcadas con anticuerpos con PBS, lave las células marcadas con anticuerpos y luego vuelva a suspender el pellet en 500 microlitros de tampón E-D-T-A-P-B-S. Ahora transfiera todo el volumen de la suspensión celular marcada con anticuerpos al tubo marcado con CD 19 positivo, CD 34 positivo, CD 45 positivo.

Enjuague el tubo con un mililitro adicional de tampón E-D-T-A-P-B-S y transfiera la suspensión de células residuales al tubo marcado CD 19 positivo, CD 34 positivo, CD 45 positivo. Finalmente, agregue 300 microlitros de tampón de unión al tubo de siete A a D para clasificar las celdas usando el citómetro de flujo MO flow XDP. En primer lugar, configure el flujo de MO para la clasificación, ejecute los controles de compensación adecuados y, a continuación, cree un protocolo que incluya gráficos como se ilustra en esta figura.

Asegúrese de que el sistema de evacuación de aerosoles esté funcionando en todo momento y, a continuación, utilice la muestra sin teñir para ajustar el voltaje y la ganancia de los diagramas de dispersión frontal y lateral. Identificar las poblaciones de fluorescencia negativa. Establezca el umbral en menor o igual al 1% para que cualquier ADN que contenga desechos no contamine las muestras recuperadas.

Ejecute alrededor de 50.000 eventos de la muestra CD 19 positiva CD 34 positiva CD 45 positiva. Para establecer la estrategia de compuerta, como se acaba de demostrar, la repuerta de la población positiva para CD 19 CD 34 positiva sin catar en el diagrama de dispersión lateral frente a dispersión directa. Para asegurar que la marcha de los linfocitos incluya posibles procélulas B.

Utilice esta muestra para establecer también la población de fluorescencia negativa para la tinción de siete a a d. A continuación, ejecute la muestra de siete a a d para determinar la viabilidad de la muestra, solo clasifique las células de una muestra con una viabilidad mayor o igual al 95% al principio, ya que las células muertas se mancharán indiscriminadamente y pueden contaminar las poblaciones de clasificación ahora establecidas para las decisiones de clasificación para recolectar para las poblaciones CD 19 positivo, CD 34 positivo CD 19 positivo, CD 34 negativo, CD 45 bajo, CD 19 positivo, CD 34 negativo, CD 45 medio y CD 19 positivo. CD 34 negativo CD 45 alto.

Incluir las puertas de discriminación de linfocitos y dobletes en las decisiones de clasificación de todas las poblaciones para prevenir obstrucciones. En la punta de clasificación, filtre la muestra CD 19 positiva, CD 34 positiva y CD 45 positiva a través de un filtro de células de 40 micras inmediatamente antes de clasificar. A continuación, coloque los tubos de recolección etiquetados recubiertos con 2%FBS en PBS en un soporte de tubo empaquetado con hielo y clasifique las células en el tubo de recolección apropiado inmediatamente después de que se haya completado la clasificación.

Extraer el ADN entre la variación de la muestra juega un papel en el éxito de la célula, clasifique en un buen orden. Hay un alto porcentaje de células en la marcha de los linfocitos. Las muestras con buenas tasas de éxito contienen bajos niveles de desechos contaminantes, como lo demuestra el bajo número de eventos que caen por debajo y a la izquierda de la población de linfocitos controlada.

Las muestras con bajas tasas de éxito contienen altos niveles de residuos contaminantes. Las muestras pobres muestran un marcado aumento de estos eventos. Las células clasificadas por flujo y el ADN posterior aislado de cada subconjunto de células B precursoras son de cantidad y calidad para realizar análisis posteriores.

Hemos utilizado rutinariamente este ADN en Myra para enriquecer el ADN metilado aquí, ADN, aislado de CD 19 positivo, CD 34 positivo, CD 19 positivo, CD 34 negativo, CD 45 células bajas, CD 19 positivo, CD 34 negativo, CD 45, células medianas y CD 19 positivo, CD 34. Las células altas CD 45 negativas se sonicaron en alto durante un total de nueve minutos, se purificaron en columna y luego se visualizaron en un gel de 1%aros con tinción de gel de ácido nucleico verde cibernético en este carril. También se ejecutó una escalera de control de 100 pares de bases después de Myra utilizando el método de motivo activo, colector ultra kit PCR con el control metilado SLC 25 A 37 y control APC no metilado uno de genes para confirmar el enriquecimiento del ADN metilado.

La mayor amplificación del SLC 25. A 37 confirma el enriquecimiento de ADN metilado en los subconjuntos de células B precursoras Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en 10 horas si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar tratar la célula con mucha suavidad y utilizar la cantidad optimizada de anticuerpos para que se minimice la generación de residuos contaminantes después de este procedimiento.

Se pueden realizar otros métodos, como la secuenciación de próxima generación, para responder a preguntas adicionales, como qué genes están metilados y qué subconjuntos de células B precursoras. No olvide que trabajar con células humanas vivas puede ser extremadamente peligroso, y se deben tomar precauciones como el funcionamiento de un sistema de evacuación de aerosoles en todo momento al realizar este procedimiento.