Name: Aislamiento de los precursores de células B subconjuntos de Sangre del Cordón Umbilical (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 6 s
Description: Aprende a aislar subconjuntos de precursores de células B de sangre de cordón umbilical mediante centrifugación en gradiente de densidad, depleción magnética y citometría de flujo. Este método eficiente proporciona células de alta calidad para análisis de ácidos nucleicos.

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Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud (Instituto Nacional del Cáncer R00 CA132784) a KT

1. Aislamiento de células mononucleares de sangre de cordón umbilical <ol><li> Preparar el tampón PBS-EDTA-añadir 5 ml de albúmina de suero bovino (BSA) solución madre a 95 ml de tampón de lavado (1:20 dilución). Desgasificar el tampón y mantener el búfer en hielo IMPORTANTE:. Si no se desgasificar el tampón puede resultar en resultados menos que óptimos cuando se aísla CD19 + células B porque las burbujas puede bloquear la columna de aislamiento. </li><li> Preparar tubos cónicos de 50 ml por centrifugación en gradiente de densidad. Determinar el número de tubos necesarios para el procesamiento de la sangre del cordón umbilical (1 tubo puede procesar 8 ml de sangre) y añadir 15 ml de Ficoll-Paque PLUS a cada tubo. </li><li> Diluir 8 ml de sangre de cordón con 24 ml de DPBS (1x) y cuidadosamente la capa de la mezcla diluida de sangre de cordón en la parte superior de la Ficoll-Paque PLUS en cada uno de los tubos de 50 ml cónicos. No mezcle la sangre y Ficoll-Paque PLUS IMPORTANTE:. Para evitar la mezcla de la sangre del cordón umbilical y PLUS Ficoll-Paque, sostenga el tubo en un ángulo de 45 grados ycapa de la mezcla de sangre lentamente. </li><li> Centrifugar a 400 xg durante 40 min a 20 ° C. Las células mononucleares (MNC) se mantendrá en el plasma-Ficoll-Paque PLUS interfaz mientras que los granulocitos y eritrocitos de sedimentos debido a la mayor densidad a la presión osmótica de Ficoll-Paque PLUS. Etiqueta siete 5 ml de fondo redondo tubos para ser utilizados en la Parte 3 con el ID de la muestra, la fecha y la siguiente: </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Tubo </td><td> Etiqueta </td><td> Propósito </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Sin teñir </td><td> Células no teñidas para la normalización durante la citometría de flujo </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 7AAD </td><td> Para determinar la viabilidad durante citometría de flujo </td></tr><tr><td> 3 </td><td> + + + </td><td> Contiene las células que se según </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 34 + </td><td> Para recoger CD34 + / CD19 +(Fines de pro-B - principios de pre-BI), las células </td></tr><tr><td> 5 </td><td> Bajo 45 </td><td> Para recoger CD34 - / CD19 + / CD45 bajo (pre-BI), las células </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 45 med </td><td> Para recoger CD34 - / CD19 + / CD45 Med (pre-BII) las células </td></tr><tr><td> 7 </td><td> 45 de alto </td><td> Para recoger CD34 - / CD19 + / CD45 alto (B) células inmaduras </td></tr></tbody></table> Escudo tubos 4, 5, 6, y 7 con FBS al 2% y colocar todos los tubos en hielo. <ol start="5"><li> Aspirar la capa superior de plasma cuidadosamente y evitar el contacto con la capa de células mononucleares. Usando una pipeta de 10 ml de vidrio, transferir cuidadosamente la capa de células mononucleares a un nuevo tubo cónico de 50 ml. Combinar las células mononucleares de tres tubos juntos en un tubo de 50 ml único. </li><li> Llenar el tubo con PBS, mezclar suavemente y centrifugar a 300 xg durante 10 min a20 ° C. Aspirar con cuidado el sobrenadante sin alterar el sedimento celular. Repita 1x. Después del primer lavado, resuspender los gránulos y transferir a un tubo de 50 ml único cónica. </li><li> Suavemente resuspender el sedimento celular en 200 ul de PBS. Eliminar 1 l de la suspensión de células, añadir a 1 ml de PBS en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y dejar de lado para contar (contar las células después de la colocación de la suspensión 50 ml de células en la centrífuga). Llenar el tubo con PBS y centrifugar a 200 xg durante 15 min para eliminar las plaquetas. Eliminar el sobrenadante completamente sin alterar el sedimento celular. </li></ol> 2. Modificado células B Aislamiento de células mononucleares utilizando separación MACS <ol><li> Resuspender el precipitado de la etapa 160 con 1,7 l frío (4 ° C) con EDTA tampón PBS. </li><li> Añadir 40 l B-CLL cóctel de anticuerpos con biotina. Pipeta para mezclar bien e incubar durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Lavar las células - añade 1 ml frío (4 ° C) con EDTA tampón PBS por 10 millones de células (células numbre determinado en el paso 1,7) y se centrifuga a 300 xg durante 10 min. Aspirar el sobrenadante completamente y luego volver a suspender el sedimento celular en 320 l frío (4 ° C) con EDTA tampón PBS. </li><li> Añadir 80 mu l anti-biotina MicroBeads, se mezcla bien y se incuba durante 15 min a 4 ° C. </li><li> Lavar las células - añadir 1 ml frío (4 ° C) con EDTA tampón PBS por 10 millones de células y se centrifugan a 300 xg durante 10 min. Resuspender hasta 100 millones de células en 500 l de frío (4 º C) con EDTA tampón PBS. Volumen de tampón de escala de acuerdo con el número de células. </li><li> Preparar columnas MACS y separadores MACS durante la centrifugación (Paso 2.5). Colocar una columna de LS en el campo magnético del separador MACS, añadir 3 ml de frío (4 º C) con EDTA tampón PBS en la columna y permitir que el tampón a gotear a través de la columna. Use un receptáculo para coger el flujo a través. Desechar el flujo a través. </li><li> Colocar un tubo cónico de 50 ml debajo de la columna y pipetear la suspensión celular en la columna. Permita que las células no marcadas a gotear through de la columna y en el tubo cónico de 50 ml. IMPORTANTE: Estas son las células que se utilizarán para el etiquetado de anticuerpos y de células de clasificación. No deseche el flujo a través. Para recuperar todas las células de la etapa 2,5, agregar un adicional de 1 ml de frío (4 º C) con EDTA tampón PBS a las paredes del tubo cónico. Mezclar suavemente y pipetear la suspensión celular restante en la columna. Repita 1x. Continúe en el paso 2,8 usando las células no marcadas recogidos en el tubo cónico después de pasar a través de la columna. </li><li> Llenar el tubo cónico que contenía las células no marcadas con PBS y centrifugar a 300 xg durante 10 min. Retirar con cuidado el sobrenadante sin alterar el sedimento celular. Añadir 200 l de EDTA-tampón PBS y suavemente resuspender las células. </li></ol> 3. Anticuerpo etiquetado y preparación para la clasificación de células <ol><li> Aspirar 1 l de la suspensión celular y el lugar en el tubo con la etiqueta &quot;sin mancha&quot; (paso 1,4). Añadir 500 l de EDTA tampón PBS y almacenar el tubo en hielo. </li><li> Añadir 20l de cada anticuerpo (CD19, CD34 y CD45) por millón de células en la suspensión celular restante. Mezclar bien y colocar el tubo en la oscuridad durante 30 min a TA. Anticuerpos CD son ligeros pasos delicados, completos 2-4 con las luces apagadas. </li><li> Después de 30 min de incubación con anticuerpos, aspire 40 l de la suspensión celular y colocarlo en el tubo etiquetado &quot;7AAD&quot;. Añadir 1 ml de PBS en el tubo y centrifugar a 500 xg durante 2 min. Eliminar el sobrenadante y resuspender las células en 100 l de tampón de unión. Añadir 7 l de 7AAD (7-Aminoactinomycin D) e incubar en la oscuridad durante 10 min a TA. Durante la etapa de 10 min de incubación completa 3,4. </li><li> Añadir PBS a la parte superior del tubo que contiene las células que quedan marcadas con anticuerpos CD. Centrifugar el tubo a 500 xg durante 3 min. Eliminar el sobrenadante, añadir 500 l de EDTA tampón PBS y resuspender el botón celular. Transferir todo el volumen de la suspensión de células en el tubo etiquetado &quot;+ + +&quot;. Para recuperar la totalidad de la suspensión de células add un adicional de 1 ml de EDTA tampón PBS al tubo cónico de 50 ml y la transferencia en el tubo marcado como &quot;+ + +&quot;. </li><li> Después de la incubación (paso 3.3), añadir 300 l de tampón de unión en el tubo 7AAD. El &quot;sin mancha&quot;, &quot;7AAD&quot; y &quot;+ + +&quot; muestras y el &quot;34 +&quot;, &quot;45 bajo&quot;, &quot;med 45&quot; y &quot;45&quot; tubos altos están listos para citometría de flujo. </li></ol> 4. Clasificación de células Utilizando el citómetro de flujo MoFlo XDP <ol><li> Set-up MoFlo para la clasificación: Alineación láser, chorro de gotitas estabilizar, determinar retraso gota. </li><li> Preparar los controles individuales de compensación de color utilizando Invitrogen AbC ratón talón kit (o similar) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Ejecutar los controles de un solo color, ajustando las tensiones de canales de fluorescencia para la separación óptima de las poblaciones positivas y negativas. Establecer y aplicar los coeficientes de compensación parámetro compensa con el protocolo de recogida. Volver a establecer coeficientes de compensación cada vez que se obtiene un nuevo lote de anticuerpos. </li><li> Crear protocolo incluyendo parcelas como se muestra en la Figura 2. </li><li> Ejecutar muestra sin teñir, ajuste de voltaje y ganancia de dispersión frontal y lateral, e identificar las poblaciones negativas de fluorescencia. Debido a que la recuperación de ADN es el objetivo de la clase, el umbral debe establecerse bajo (≤ 1%), de modo que el ADN que contiene desechos no contamine las muestras recuperadas. * Asegúrese de que el sistema de evacuación de aerosol se está ejecutando en todo momento que viven las células humanas se están ejecutando en el MoFlo. </li><li> Ejecutar una pequeña alícuota de los + + + muestra (~ 50.000 eventos) para establecer la estrategia de puerta (Figura 2). Debido a que las células B progenitoras no dispersar de forma idéntica a las células B maduras, sin sincronización backgate el CD19 + / CD34 + población en el complot vs SSC FSC para asegurar la puerta de linfocitos incluye posibles células pro-B. De esta muestra también se establece la población fluorescencia negativa para 7AAD. </li><li> Ejecutar el ejemplo 7AAD para determinar la viabilidad de la muestra. Sólo las células de ordenación a partir de una muestra con alta viabilidad en laprincipio (≥ 95%) como células muertas se tiñen de manera indiscriminada y puede contaminar las poblaciones de ordenación. </li><li> Configure las decisiones de ordenación para recoger cuatro poblaciones: CD19 + / CD34 +, CD19 + / CD34 - / CD45 baja; CD19 + / CD34 - / CD45 med, y CD19 + / CD34 - / CD45 alto. Incluya los linfocitos y las puertas doblete discriminación en las decisiones de ordenación de todas las poblaciones. </li><li> Para evitar obstrucciones en la punta de la clasificación, el filtro + + + muestra a través de un filtro de 40 micras celda inmediatamente antes de la selección y volver a filtrar si cualquier agregación se produce en la muestra durante la clase. </li><li> Ordenar las células en tubos de recogida (paso 1,4) recubiertas con FBS al 2% en PBS en un soporte de tubo enfriada o hielo compactadas. </li><li> Inmediatamente después de la especie se ha completado, extraer el ADN. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El factor con mayor impacto en el éxito del protocolo es la presencia de contaminación de los desechos. Si se solicita la sangre de un banco de sangre del cordón umbilical es importante tener la sangre enviada tan pronto después de la recogida como sea posible. Además, las muestras que se clasifican como linfocitosis contienen un mayor número de linfocitos, sin embargo, estas muestras no tienen un número suficiente de células B precursoras y no debe ser utilizado. Para aumentar la probabilidad de obtener un número suficiente de células para cada uno de los subconjuntos de precursores Recomendamos comenzar con al menos 85 ml de sangre del cordón umbilical. Es importante señalar que a diferencia de las separaciones de sangre periférica de adultos, cuando fraccionamiento de la sangre del cordón umbilical de la capa mononuclear menudo está contaminada con células rojas de la sangre 12. Este protocolo incluye una etapa de lavado adicional para eliminar las plaquetas contaminantes. Protocolos que describen las separaciones mononucleares de sangre de cordón sugiere incluir una etapa de lisis to eliminar los glóbulos rojos no deseados. No recomendamos este paso, ya que produce residuos contaminantes y tiene un impacto negativo en el éxito de la especie celular. Con el fin de reducir el número de células que tienen que ser distinguidos por citometría de flujo es necesario para llevar a cabo un enriquecimiento de células B antes de la clasificación de células. El protocolo proporcionado por Miltenyi Biotec, que acompaña el kit de aislamiento de células B (B-CLL), ha sido optimizado para la sangre periférica y recomienda el uso de 10 l B-CLL cóctel de anticuerpos biotina por 10 millones de células. Este paso utiliza anticuerpos contra CD2 (células T, células NK), células CD4 (células T), CD11b (granulocitos monocitos;; macrófagos), CD16 (células NK; macrófagos, mastocitos), CD36 (plaquetas), CD235a (células eritroides) para agotar las células no-B de la sangre del cordón umbilical. Es importante usar el kit descrito y no el de células B kit de aislamiento II debido a que el kit anterior contiene un anticuerpo contra CD43 que está presente en células pro-B. Durante nuestra optimización de este protocolo, se encontró que un total de 40 l de B-CLL cóctel de anticuerpos con biotina es suficiente para producir un resultado positivo tipo celular. Además se encontró que el uso de tan poco como 5 l más del cóctel de anticuerpos B-CLL biotina tuvieron efectos adversos en el tipo celular. Por lo tanto, es muy recomendable con 40 l de B-CLL cóctel de anticuerpos con biotina para el total de número de células mononucleares de entre 175-250 million. Si se comienza con números menores o mayores de las células puede ser necesario para escalar los reactivos en consecuencia. Hay numerosas publicaciones que describen las conflictivas marcadores que pueden ser utilizados para distinguir subpoblaciones de células B. La mayor parte de la discrepancia puede ser explicada por el hecho de que la diferenciación es un proceso continuo y que la presencia o ausencia de marcadores de superficie celular se produce de manera gradual en lugar de en forma de todo o nada. En este protocolo CD34 - / CD19 + y el nivel de intensidad de CD45 + (expresión bajo, medio, alto) fue utilizada para distinguir pre-BI, pre-BII e inmadura de células B con un aumento en el nivel de CD45 expresión correspondiente a la progresión de la diferenciación 6. Pro-células B han sido descritos por algunos como CD19 + / CD34 + 13 mientras que otros han demostrado que células pro-B son CD19 - / CD34 + y pre-BI células son CD19 + / CD34 + 9,10. Sobre la base de estas discrepancias se han designado las CD19 + / CD34 + células como fines pro-células B / principios de células pre-BI. Es importante señalar que esta estrategia se desarrolló para aislar los subconjuntos de precursor de células B que corresponden a las células afectadas por la enfermedad de la leucemia linfoblástica aguda. Sin embargo, existen múltiples estrategias de clasificación que se pueden emplear dependiendo del subtipo de células de interés. Anticuerpo-fluorocromo combinaciones deben ser seleccionados en base a las capacidades del clasificador de células disponibles. Como génerosl norma, la más brillante de fluorocromo en su panel debe utilizarse para marcar el antígeno menos poblado y viceversa. En la detección de doble manchadas de población, especialmente a los eventos raros como estos, la discriminación doblete (Figura 2B) es una parte muy importante de la estrategia de activación periódica. Esto garantiza que los eventos doble positivas son células verdaderamente individuales teñidas con los anticuerpos y no simplemente dos de una sola manchadas células adheridas entre sí. De alta velocidad, 4-way clasificación de células necesariamente crea un entorno controlado aerosol. Por lo tanto, la clasificación de células vivas humano debe realizarse con sumo cuidado. Publicado pautas de seguridad y descontaminación están disponibles y deben ser revisados ​​y aplicados antes de la clase 14. La aprobación de los Comités Institucionales de Bioseguridad o sus equivalentes puede ser requerido antes de la clasificación. Para la descontaminación adecuada después de la clasificación, la lejía debe añadirse al recipiente de desechos a una concentración final de 10%. Similarly, todos los tubos de muestras, así como todas las superficies en el área inmediata debe ser completamente descontaminado con una solución de lejía recién preparada 10%. En resumen, este protocolo proporciona una estrategia para la obtención de poblaciones raras de precursor de células B y puede ser modificado para aislar una población rara presente en la sangre del cordón incluyendo células madre hematopoyéticas y células T inmaduras. Recientemente, las células B inmaduras se han identificado en la sangre periférica de individuos con VIH avanzado 15. Por lo tanto, la utilidad de este método se extiende más allá del estudio de cánceres de la sangre. Por último, no se han realizado todavía aislamientos de ARN en las células de flujo según, sin embargo, este método debe ser adaptable con la salvedad de que durante la clasificación celular las células se deben ordenar directamente en trizol o un equivalente de solución de ARN compatible tal como RLT del kit RNeasy disponible a través de Qiagen.

Con el fin de identificar aberraciones que están presentes en la enfermedad, es de vital importancia que utilizamos tejidos sanos o células que se corresponden con el tipo de tejido o célula afectada por la enfermedad. Una razón para esto es que la variación epigenética entre tipos de tejidos es responsable de regular la expresión génica y es crítica para la diferenciación celular durante el desarrollo normal de 1,2 humana. Una segunda razón es que la regulación aberrante de genes específicos de tejido pueden tener consecuencias nefastas sobre el desarrollo normal y se sabe que contribuyen a una multitud de estados de enfermedad, incluyendo el cáncer. Por lo tanto, una mejor comprensión de una enfermedad que implica a las células hematopoyéticas requiere el conocimiento de las células hematopoyéticas sanas. El desarrollo de las células hematopoyéticas en la médula ósea procede a través de una orden sistemático de los eventos que se caracterizan por cambios en la expresión de marcadores de superficie celular 3. Estudios con participantes adultos tienendemostrado que la médula ósea contiene generalmente un bajo número de precursor de células B 4,5; mientras que los estudios con participantes pediátricos han demostrado que el porcentaje de precursor de células B es relativamente alta en los individuos de menos de 5 años de edad 6. Sangre de cordón umbilical se utiliza como una fuente de células madre hematopoyéticas en el tratamiento de trastornos relacionados con la sangre y tumores malignos, está fácilmente disponible a través de los bancos de sangre de cordón y está enriquecida en B y las células T inmaduras 7 que son las células diana de múltiples trastornos, incluyendo la leucemia y los linfomas. Precursor de células B en la médula ósea han sido ampliamente phenotyped 8,9 y puede ser definido por la presencia de marcadores específicos de la superficie celular que se pueden utilizar para clasificar estas células en subconjuntos distintos. Normales de células B. Con la diferenciación a través de una serie de etapas en la médula ósea a partir de los primeros pro-células B y culminando en inmaduros o ingenuo células B. Conformevan a Zelm y colegas 10, pro-células B se caracterizan por la presencia de CD34 y en la transición a la etapa 2 (Pre-BI) CD19 se adquirieron. Células de la etapa 3 (Pre-BII) ya no expresan CD34 y comienzan a expresar IgM citoplásmica. Finalmente, una característica definitoria de la etapa 4 (inmadura de células B) es la expresión de IgM de superficie. La estrategia de clasificación se describe en este protocolo fue descrito por primera vez por Caldwell y colegas 6 e incluye el uso de sólo 3 marcadores de superficie celular que reduce considerablemente la complejidad y el coste de la realización de experimentos de clasificación de células. En su trabajo, una relación entre CD45 y las etapas de diferenciación de células B se estableció. Ellos observaron que las células B en la médula ósea mostrar niveles variables de expresión de CD45. Específicamente, las células que expresaron altos niveles de CD45 correspondieron a células que expresan IgM de superficie (células B inmaduras), aquellos que expresan un nivel intermedio de CD45 correspondieron a células que expresaron cytoplasmic IgM (pre-BII células), y las que expresan bajos niveles de CD45 correspondieron a células que no expresan IgM citoplásmica (pre-BI células). Este protocolo utiliza la estrategia desarrollada por Caldwell y colegas 6 para aislar los subconjuntos de precursor de células B de sangre del cordón umbilical (Figura 1) que pueden ser utilizados en ensayos de aguas abajo que requieren alta calidad de ácidos nucleicos tales como el ensayo isla CpG metilado-recuperación (MIRA ) 11 y cuantitativos ensayos de PCR en tiempo real. El método emplea una separación inicial usando perlas magnéticas para agotar todas las células no-B de sangre del cordón umbilical y requiere sólo la tinción con anticuerpos 3 (CD34, CD19 y CD45). Las células que se recuperan representan 4 estadios de diferenciación de células B: 1) CD34 +, CD19 + (tarde) pro-B y principios de pre-BI, 2) CD34 -, CD19 +, CD45 baja (finales de pre-BI); 3) CD34 -; CD19 +; CD45 med (pre-BII), y 4) CD34 -; CD19 +; CD45 alta (células B inmaduras).

<table><tbody><tr><td>DPBS (1X)</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE Healthcare Bio-Sciences AB</td><td>17-1440-03</td><td></td></tr><tr><td>LS Columna</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MACS Multi Stand</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>MidiMACS Separador</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>Kit de aislamiento de células B (B CL)</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-093-660</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>ATLANTA Biologicals</td><td>S11195</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de microcentrífuga (1,5 ml)</td><td>MIDSCI</td><td>SS1500</td><td></td></tr><tr><td>BD Pharmingen 7-AAD (7-aminoactinomicina D)</td><td>BD Biosciences</td><td>559763</td><td></td></tr><tr><td>DB Pharmingen APC Ratón Anti-Humano CD19</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td>555415</tr><tr><td>DB Pharmingen PE Ratón Anti-Humano CD34</td><td>BD Biosciences</td><td>560941</td><td></td></tr><tr><td>CD45 FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>347463</td><td></td></tr><tr><td>autoMACS Solución de enjuague</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-091-222</td><td></td></tr><tr><td>MACS BSA Solución Madre</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-091-376</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon 5 ml Poliestireno Tubo de Fondo Redondo</td><td>BD Biosciences</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon Tubo de 50 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>PuraFlow Sheath Fluid, 8X</td><td>Beckman Coulter</td><td>CY30230</td><td></td></tr><tr><td>Cuentas de alineación FlowCheck</td><td>Beckman Coulter</td><td>6605359</td><td></td></tr><tr><td>Ultra Rainbow Cuentas de alineación</td><td>Spherotech</td><td>URFP-30-2</td><td></td></tr><tr><td>ViroSafe Filtro de evacuación de aerosoles</td><td>Beckman Coulter</td><td>ML01330</td><td></td></tr><tr><td>ABC Kit de cuentas de ratón</td><td>Invitrogen</td><td>A-10344</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; filtro de células</td><td>M Fisher Scientific</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>Fisher Scientific Hemocitómetro Fisher</td><td>Scientific</td><td>267110</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>accuSpin Modelo 3R Centrífuga de sobremesa</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-100-516</td><td></td></tr><tr><td>MoFlo XDP Citómetro de flujo Beckman</td><td>Coulter</td><td>ML99030</td><td></td></tr><tr><td>Unidad de evacuación de aerosoles</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

aislamiento de los precursores de células b subconjuntos de sangre del cordón umbilical

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

Sangre del cordón umbilical es altamente enriquecida en células progenitoras hematopoyéticas en diferentes etapas del linaje de compromiso. Hemos desarrollado un protocolo para el aislamiento de precursor de células B en cuatro etapas diferentes de diferenciación. Debido a que los genes se expresan y modificaciones epigenéticas ocurrir en una manera específica de tejido, que es vital para discriminar entre tejidos y tipos de células con el fin de ser capaz de identificar alteraciones en el genoma y el epigenoma que puede conducir al desarrollo de la enfermedad. Este método puede ser adaptado a cualquier tipo de célula presente en la sangre del cordón umbilical en cualquier etapa de diferenciación. Este método comprende 4 etapas principales. Primero, las células mononucleares se separan por centrifugación de densidad. En segundo lugar, las células B se enriquecen usando biotina conjugado con anticuerpos que reconocen y eliminar los no células B de las células mononucleares. Terceros las células B están marcadas fluorescentemente con anticuerpos proteína de superficie celular específicos para las etapas individualesde desarrollo de células B. Finalmente, las células marcadas fluorescentemente se ordenan y poblaciones individuales se recuperan. Las células recuperadas son de cantidad y calidad suficiente para ser utilizada en posteriores ensayos de ácidos nucleicos.

Entre muestra de variación desempeña un papel en el éxito de la especie celular (Tabla 1). Las muestras con buenas tasas de éxito tienen bajos niveles de contaminación de desechos (Figura 3A) y las muestras con escaso éxito tienen altos niveles de contaminación de desechos (Figura 3B). Entre la muestra variación puede ser algo controlado si la muestra de sangre del cordón umbilical se recogió dentro de las 24 horas de embarque (O / N prioritario). Las células de flujo según de cada precursor de células B son subconjunto de cantidad y calidad suficientes para realizar aislamientos de ácido nucleico. El ADN aislado es de alta calidad y pueden ser utilizados en los análisis. En forma rutinaria utilizar este ADN en MIRA 11 para enriquecer el ADN metilado (Figura 4). <table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Cable de datos de las instalaciones de sangre </td><td> Ordenar Malo </td><td><strong&gt; Ordenar Buena </td></tr><tr><td> Sangre con anticoagulante Volumen de trabajo (ml) </td><td> 110 </td><td> 104 </td></tr><tr><td> Glóbulos blancos [10 3 / l] </td><td> 8,68 </td><td> 11,19 </td></tr><tr><td> Los linfocitos [10 3 / l] </td><td> 3,88 </td><td> 3,76 </td></tr><tr><td> Linfocitos (%) </td><td> 44,70 </td><td> 33,6 </td></tr><tr><td> Glóbulos rojos [10 6 / l] </td><td> 3,65 </td><td> 3,05 </td></tr><tr><td colspan="3"> En casa de Datos </td></tr><tr><td> Móvil Número después de Ficoll-Paque </td><td> 206 M </td><td> 309 M </td></tr><tr><td> Número de células después de la separación MACS </td><td> 22 M </td><td> 16,5 M </td></tr><tr><td> Eventos Count Total (MoFlo XDP) </td><td> 30,57 M </td><td> 19,97 M </td></tr><tr><td> Viabilidad (%) </td><td> 98,00 </td><td> 98,00 </td></tr><tr><td> Las células de puerta de linfocitos (%) </td&gt; <td> 17,00 </td><td> 50,00 </td></tr><tr><td colspan="3"> CD19 + / CD34 + </td></tr><tr><td> Número total de células </td><td> 10959 </td><td> 48316 </td></tr><tr><td> % Del Total de eventos </td><td> 0,04 </td><td> 0,24 </td></tr><tr><td> Eficiencia </td><td> 88% </td><td> 88% </td></tr><tr><td colspan="3"> CD19 + / CD34 - / CD45 bajo </td></tr><tr><td> Número total de células </td><td> 16619 </td><td> 26941 </td></tr><tr><td> % Del Total de eventos </td><td> 0,05 </td><td> 0,13 </td></tr><tr><td> Eficiencia </td><td> 89% </td><td> 87% </td></tr><tr><td colspan="3"> CD19 + / CD34 - / CD45 med </td></tr><tr><td> Número total de células </td><td> 469745 </td><td> 507540 </td></tr><tr><td> % Del Total de eventos </td><td> 1,54 </td><td> 2,54 </td></tr><tr><td> Eficiencia </td><td> 89% </td><td> 89% </td></tr><tr><td colspan="3"> CD19 + / CD34 - / CD45 alto </td></tr><tr><td> Número total de células </td><td> 1896062 </td><td> 2047142 </td></tr><tr><td> % Del Total de eventos </td><td> 6,2 </td><td> 10,25 </td></tr><tr><td> Eficiencia </td><td> 91% </td><td> 90% </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Representante estadísticas de clasificación celular. Filas 1-5 son cuentas que ofrece el centro de sangre del cordón umbilical. Las filas restantes son datos recogidos en nuestro laboratorio. El tipo pobre contenía altos niveles de residuos y un bajo porcentaje de células en la puerta de linfocitos. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50402/50402fig1.jpg" /> Figure 1. Diagrama de flujo del procedimiento. Sangre del cordón umbilical se procesa y las células mononucleares se aíslan usando Ficoll-Paque Plus. Una etapa adicional de lavado se incluye para eliminar las plaquetas contaminantes. Las células B se aíslan de las células mononucleares utilizando la MACS de células B humanas kit de aislamiento (B-CLL). Este paso se utiliza biotina-conjugado con anticuerpos monoclonales (CD2, CD4, CD11b, CD36, anti-IgE y CD235a) para eliminar todas las células no-B. Los recuperadas células B son etiquetados con CD19-APC, CD34-PE y anticuerpos CD45-FITC a continuación, ordenados usando el citómetro de flujo MoFlo XDP para recuperar precursores de células B subconjuntos: CD19 + / CD34 +; CD19 + / CD34 - / CD45 baja , CD19 + / CD34 - / CD45 med, y CD19 + / CD34 - / CD45 alto. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/50402/50402fig2.jpg" /> Figura 2. Gating estrategia para identificar y clasificar poppoblaciones. Las flechas rojas indican la puerta que se aplica a la trama subsiguiente. Puertas R4, R5, R6 y R7 indican poblaciones ordenadas. A) Avanzar vs trama lado de dispersión que muestra la población de linfocitos enriquecido. Puerta R1, linfocitos. B) Altura vs ancho del gráfico de dispersión hacia adelante para identificar células individuales en comparación con dobletes. R2, puerta única célula. C) CD19-APC células positivas se dividen en poblaciones de CD34-PE negativos y positivos. R3, CD19 + / CD34 - puerta, R4, CD19 + / CD34 + puerta indicando población deseada tipo d) CD19 + / CD34 - las células se dividen en tres un tanto distintas CD45-FITC poblaciones.. R5 y R6, CD19 + / CD34 - / CD45 y CD19 baja + / CD34 - / CD45 poblaciones med, respectivamente. R7, por el número de células altas en el CD19 + / CD34 - / CD45 población, esta puerta especie abarca sólouna parte de la población. Todas las células de esta población no necesitan ser recogidos para los análisis. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/50402/50402fig3.jpg" /> Figura 3. A) Los bajos niveles de contaminación de los desechos después del enriquecimiento columna. R1, puerta de linfocitos. B) Los altos niveles de contaminación de los desechos después del enriquecimiento columna. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/50402/50402fig4.jpg" /> Figura 4. Enriquecimiento de ADN metilado de los subgrupos de células B precursoras. Un ADN) Sonicated aislado de precursores de células B de subconjuntos es de alta calidad. Para la construcción de ADN de biblioteca se somete a sonicación a una media de 200-600 pb. Carril 1: escalera de 100 pb Promega (catálogo # G2101); Carril 2: ADN total aislado de CD19 + / CD34 + células; Línea 3: El ADN total aislado de CD19 + </shasta&gt; / CD34 - / células CD45 bajos; Carril 4: 100 ng de ADN aislado a partir de CD19 + / CD34 - / CD45 células Med; Carril 5: 100 ng de ADN aislado a partir de CD19 + / CD34 - CD45 / células de alta. ADN se sometió a ultrasonidos utilizando el Bioruptor Diagenode en alta para un total de 9 min (30 seg ON; 30 seg OFF). ADN fue purificado en columna y se visualizaron en un gel de agarosa 1% con SYBR verde gel de ácido nucleico mancha. B) Después de MIRA utilizando el ActivMotif MethylCollector Ultra kit, PCR con SLC25A37 (1-6) y CAp1 (7-12) se realiza para confirmar enriquecimiento de ADN metilado. 1 y 7: DNA genómico sonicated (no MIRA), 2 y 8: MIRA-CD19 + / CD34 + DNA, 3 y 9: MIRA-CD19 + / CD34 - DNA / CD45 bajo, 4 y 10: MIRA-CD19 + / CD34 - / CD45 med ADN; 5 &amp; 11: MIRA -CD19 + / CD34 - / CD45 ADN de alto, 6 y 12: El control del agua. Mayor amplificación de SLC25A37 confirma el enriquecimiento de ADN metiladoen los subconjuntos de células B precursoras.

Aquí se describe un protocolo para aislar los subconjuntos de precursor de células B de sangre del cordón umbilical. Una cantidad suficiente y calidad de los ácidos nucleicos se pueden extraer de las células y utilizarse en ensayos subsiguientes utilizando ADN o ARN.

Aislamiento de los precursores de células B subconjuntos de Sangre del Cordón Umbilical

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

El objetivo general de este procedimiento es aislar subpoblaciones de células B precursoras a partir de sangre de cordón umbilical. Esto se logra primero aislado las células mononucleares de la sangre de cordón mediante centrifugación en gradiente de densidad. En el segundo paso, los antígenos de superficie celular se marcan con anticuerpos conjugados con biotina para agotar magnéticamente cualquier célula no B restante.A continuación, los linfocitos B aislados se marcan con fluorescencia mediante anticuerpos contra los antígenos de superficie celular CD 19, CD 34 y CD 45. En la etapa final, las células se separan mediante citometría de flujo para recuperar los subconjuntos de linfocitos B precursor. En última instancia, se pueden obtener células en número y calidad suficientes para su utilización en ensayos posteriores que requieran ADN y ARN de alta calidad.Una ventaja de la estrategia de clasificación celular frente a otros métodos es que nuestra estrategia requiere menos tiempo en el citómetro de flujo y solo tres anticuerpos fluorescentes, lo que reduce considerablemente el costo del experimento. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades con la variedad de métodos disponibles para preparar células de sangre de cordón umbilical para citometría de flujo y con la complejidad de la preparación del citómetro de flujo. Aunque este método puede proporcionar información sobre células B precursoras sanas, también puede aplicarse a otros tipos celulares presentes en la sangre de cordón umbilical, como linfocitos T, o a estudios de enfermedades que involucren cualquier tipo de célula hematopoyética, como la leucemia o el linfoma.La demostración visual de este método es fundamental porque es difícil describir las técnicas adecuadas necesarias para procesar la sangre y las células de la sangre del cordón umbilical de manera que se maximice la viabilidad celular y se reduzca la presencia de restos contaminantes. Para aislar las células mononucleares de la sangre del cordón umbilical, primero diluya alícuotas de ocho mililitros de sangre de cordón con 24 mililitros de DPBS. Luego, superponga lentamente cada mezcla de sangre diluida encima de 15 mililitros de ALI watts de fipa más en tubos cónicos de 50 mililitros, teniendo cuidado de mantener las capas separadas.A continuación, centrifugue la sangre durante 40 minutos a 400 × g y 20 °C mientras se separan las células mediante un gradiente de densidad. Etiquete tubos redondos de fondo de 75 mL con el ID de la muestra, la fecha y cualquier otra información pertinente según se indica en la tabla. Tras la separación, las células mononucleares permanecerán en la interfase entre el plasma y la capa opaca, mientras que los granulocitos y eritrocitos se sedimentarán. Ahora aspire las capas superiores de plasma, evitando el contacto con las capas de células mononucleares. Luego, utilice una pipeta de vidrio de 10 mL para recoger cuidadosamente las capas de células mononucleares de tres de los tubos de 50 mL y transfiéralas a un nuevo tubo de 50 mL.Llene este nuevo tubo con PBS, mezcle suavemente la suspensión celular y luego lave las células dos veces durante 10 minutos a 300 ×g y 20 grados Celsius. Después del primer lavado, re suspenda los pellets y transfiera a un solo tubo cónico de 50 mililitros. Después del segundo lavado, re suspenda suavemente el pellet celular en 200 microlitros de PBS y transfiera un microlitro de la suspensión celular a un mililitro de PBS en un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros para el recuento.Luego, lave las células en el tubo de 50 mililitros con más PBS, eliminando completamente el sobrenadante sin perturbar el precipitado. Para aislar las células B de las células mononucleares, primero resuspenda el precipitado recién lavado en 160 microlitros de tampón DGAs E-D-T-A-P-B-S, recién preparado y a cuatro grados Celsius.Luego, mezcle 40 microlitros del kit de aislamiento de células B, el cóctel de anticuerpos bio ITIN, con la suspensión celular. Después de incubar las células durante 10 minutos a cuatro grados Celsius, elimine por lavado el anticuerpo libre con un mililitro de tampón E-D-T-A-P-B-S a cuatro grados Celsius por cada 10 millones de células. A continuación, re suspenda el sedimento celular en 320 microlitros de tampón E-D-T-A-P-B-S a cuatro grados Celsius.Ahora mezcle 80 microlitros de microperlas anti-biotina con la suspensión celular tras una incubación de 15 minutos a cuatro grados Celsius. Lave nuevamente las células mientras giran. Coloque una columna LS en el campo magnético de un separador Max y deje caer tres mililitros de tampón E-D-T-A-P-B-S a cuatro grados Celsius a través de la columna.A continuación, resuspenda hasta 100 millones de células lavadas en 500 microlitros de tampón E-D-T-A-P-B-S a cuatro grados Celsius. Luego, pipetee la suspensión celular sobre la columna, recolectando las células no marcadas que pasan a través de la columna en un tubo cónico de 50 mililitros. Añada dos mililitros adicionales de tampón E-D-T-A-P-B-S a cuatro grados Celsius a las paredes del tubo cónico original, un mililitro a la vez, y luego mezcle suavemente y pipetee la suspensión celular residual sobre la columna cada vez, para asegurar la recuperación de todas las células.Finalmente, complete el tubo cónico que contiene las células no marcadas con PBS. Después de la centrifugación, retire cuidadosamente el sobrenadante sin perturbar el botón celular. Luego, resuspenda suavemente las células en 200 microlitros de tampón E-D-T-A-P-B-S.Inicie la marcación con anticuerpos. Comience transfiriendo un microlitro de la suspensión celular al tubo previamente etiquetado sin teñir. Añada 500 microlitros de tampón E-D-T-A-P-B-S al tubo y colóquelo en hielo.Apague todas las luces y luego agregue 20 microlitros de cada uno de los anticuerpos CD19, CD34 y CD45 por cada millón de células en la suspensión celular restante. Mezcle bien y coloque el tubo en la oscuridad durante 30 minutos a temperatura ambiente. A continuación, transfiera 40 microlitros de la suspensión celular marcada con anticuerpos a los siete tubos etiquetados con A a D.Lave las células con un mililitro de PBS y luego resuspenda el pellet en 100 microlitros de tampón de unión. Añada siete microlitros de 7-AAD a estas células e incúbelas a oscuras durante 10 minutos a temperatura ambiente. Mientras las células se etiquetan con 7-AAD, complete con PBS el tubo que contiene las células marcadas con el anticuerpo, lave las células marcadas con el anticuerpo y luego resuspenda el pellet en 500 microlitros de tampón EDTA-PBS. A continuación, transfiera todo el volumen de la suspensión de células marcadas con el anticuerpo al tubo etiquetado como CD19 positivo, CD34 positivo, CD45 positivo.Lave el tubo con un mililitro adicional de tampón E-D-T-A-P-B-S y transfiera la suspensión celular residual al tubo marcado positivo para CD19, positivo para CD34 y positivo para CD45. Finalmente, agregue 300 microlitros de tampón de unión al tubo siete A a D para clasificar las células utilizando el citómetro de flujo MO flow XDP. Primero configure el MO flow para la clasificación, ejecute los controles de compensación adecuados y luego cree un protocolo que incluya gráficos como se ilustra en esta figura.Asegúrese de que el sistema de evacuación de aerosoles esté funcionando en todo momento y luego utilice la muestra sin teñir para ajustar el voltaje y la ganancia de los gráficos de dispersión hacia adelante y lateral. Para identificar las poblaciones negativas de fluorescencia. Establezca el umbral en menos del o igual al 1 % para que cualquier resto que contenga ADN no contamine las muestras recuperadas.Analice aproximadamente 50.000 eventos de la muestra positiva para CD19, positiva para CD34 y positiva para CD45. Establezca la estrategia de selección, tal como se acaba de demostrar, retrocediendo la población no seleccionada positiva para CD19 y positiva para CD34 hacia el gráfico de dispersión lateral versus dispersión frontal. Asegúrese de que la puerta de linfocitos incluya posibles células pro B.Utilice esta muestra también para establecer la población negativa de fluorescencia para la tinción de siete a a d. A continuación, ejecute la muestra de siete a a d para determinar la viabilidad de la muestra; solo clasifique células de una muestra con una viabilidad mayor o igual al 95 % desde el inicio, ya que las células muertas se tiñen indiscriminadamente y podrían contaminar las poblaciones clasificadas. Ahora configure las decisiones de clasificación para recolectar las poblaciones CD19 positivas, CD34 positivas CD19 positivas, CD34 negativas CD45 bajas CD19 positivas, CD34 negativas CD45 medias y CD19 positivas CD34 negativas CD45 altas.Incluya las compuertas de discriminación de linfocitos y dobletes en las decisiones de clasificación de todas las poblaciones para prevenir obstrucciones. En la punta de clasificación, filtre la muestra positiva para CD19, positiva para CD34 y positiva para CD45 a través de un filtro celular de 40 micrones inmediatamente antes de la clasificación. Luego, coloque tubos de recolección etiquetados recubiertos con FBS al 2 % en PBS en un soporte de tubos con hielo y clasifique las células directamente en el tubo de recolección adecuado inmediatamente después de finalizar la clasificación.Extraiga el ADN entre la variación de la muestra, ya que desempeña un papel en el éxito de la célula, y realice un buen ordenamiento. Existe un alto porcentaje de células en la marcha linfocitaria. Las muestras con altas tasas de éxito contienen bajos niveles de restos contaminantes, como lo demuestra el reducido número de eventos que se sitúan por debajo y a la izquierda de la población de linfocitos seleccionada.Las muestras con bajas tasas de éxito contienen altos niveles de restos contaminantes. Las muestras deficientes muestran un aumento notable de estos eventos. Las células ordenadas por flujo y el ADN subsiguiente aislado de cada subconjunto de linfocitos B precursores son de cantidad y calidad suficientes para realizar análisis posteriores.Hemos utilizado habitualmente este ADN en Myra para enriquecer ADN metilado a partir de ADN aislado de células CD19 positivas, CD34 positivas; células CD19 positivas, CD34 negativas, CD45 bajas; células CD19 positivas, CD34 negativas, CD45 medias; y células CD19 positivas, CD34 negativas, CD45 altas. Las muestras fueron sometidas a sonicación a alta intensidad durante un total de nueve minutos, purificadas mediante columna y luego visualizadas en un gel de agarosa al 1 % con tinción de ácido nucleico con cyber green en esta banda. También se realizó una electroforesis con un marcador de control de 100 pares de bases tras el procedimiento en Myra. Mediante el kit Active Motif MeDIP, seguido de PCR con los genes control metilado SLC25A37 y no metilado APC1, se realizó una amplificación para confirmar el enriquecimiento del ADN metilado.La mayor amplificación del SLC 25. A 37 confirma el enriquecimiento de ADN metilado en los subconjuntos de células B precursoras. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en 10 horas si se lleva a cabo correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar tratar las células con mucha suavidad y utilizar la cantidad optimizada de anticuerpos para minimizar la generación de restos contaminantes tras seguir este procedimiento.Se pueden realizar otros métodos como la secuenciación de nueva generación para responder preguntas adicionales, como qué genes están metilados y los subconjuntos de células B precursoras. No olvide que trabajar con células humanas vivas puede ser extremadamente peligroso, y se deben tomar precauciones como utilizar un sistema de evacuación de aerosoles en todo momento al realizar este procedimiento.

isolation-of-precursor-b-cell-subsets-from-umbilical-cord-blood

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Aquí se describe la primera práctica de fabricación (GMP)-cumple método de producción de virus específicos de los linfocitos T citotóxicos (CTL) de la sangre del cordón umbilical, una fuente de células T predominantemente ingenuo.

La expansión de los linfocitos T citotóxicos sangre del cordón umbilical que Citomegalovirus Target, Virus de Epstein-Barr, adenovirus y

El video explica una forma de purificar las células B mediante la orientación inmunomagnética y la separación de la suspensión de células mononucleares de sangre periférica. El método consiste en etiquetar tipos de células no deseadas con anticuerpos o ligandos específicos (unidos a partículas magnéticas) dirigidos a proteínas específicas de la superficie celular, para ser agotadas de la suspensión celular heterogénea por separación magnética.

Selección inmunomagnética negativa: un método para purificar células B a partir de células mononucleares de sangre periférica

En este video, demostramos el aislamiento de células B de sangre periférica humana utilizando anticuerpos biotinilados específicos para células no B y microperlas magnéticas conjugadas con estreptavidina.

Aislamiento y purificación de células B de sangre periférica humana

Este video muestra una técnica para generar ratones del sistema inmunológico humano (HIS). Las células madre hematopoyéticas (HSC) CD34+ se aíslan de las células de la capa leucitaria de la sangre del cordón umbilical humano mediante perlas magnéticas recubiertas de anticuerpos. Las HSC CD34+ se expanden en un medio de crecimiento enriquecido con citocinas y criopreservado. Finalmente, las HSC descongeladas se inyectan en una cría de ratón inmunodeficiente para establecer el modelo de ratón HIS.

Aislamiento de células madre hematopoyéticas de la sangre del cordón umbilical para generar ratones del sistema inmunitario humano

Aquí, proporcionamos un protocolo optimizado para el aislamiento y clonación de la escasa entidad de células T periféricas Vδ1+CD4+ que es, como demostramos recientemente, un progenitor de células T αβ extratímicas. Esta técnica permite aislar, clonar y expandir eficientemente estas células en cultivo ex vivo.

Aislamiento y<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultura de Vδ1<sup&gt; +</sup&gt; CD4<sup&gt; +</sup&gt; Las células γδ T, una célula αβT Progenitor Extrathymic

La sangre periférica humana se utiliza habitualmente para la evaluación de la respuesta inmunitaria humoral. En este trabajo, se describen los métodos para aislar las células B humanas de la sangre periférica, diferenciar las células B humanas en células B secretoras de anticuerpos (Ab) en cultivo y enumerar el total de IgM- e IgG-ASC mediante un ensayo ELISpot.

El aislamiento, diferenciación y cuantificación de Human secretoras de anticuerpos células B de sangre: ELISpot como una lectura funcional de la inmunidad humoral

El objetivo de este protocolo es aislar las células progenitoras endoteliales de cordón umbilical. Algunas de las aplicaciones incluyen el uso de estas células como un biomarcador para identificar pacientes con riesgo cardiovascular, tratamiento de enfermedades isquémicas, y construye creando ingeniería de tejido vascular y del corazón la válvula.

Aislamiento de células endoteliales progenitoras de la sangre de cordón Umbilical humano

Una población altamente pura de megacariocitos puede obtenerse de cable derivadas de sangre CD34+ las células. Un método para CD34+ aislamiento y del megakaryocyte diferenciación se describe aquí.

Diferenciación de megacariocitos y plaquetas formación de humanos CD34 derivadas de sangre de la cuerda+ de las células

Aquí, presentamos un protocolo para la caracterización inmunophenotípica y la diferenciación inducida por citoquinas de la sangre de cordón umbilical derivada CD34+ células madre hematopoyéticas y células progenitoras a los cuatro linajes mieloides. Las aplicaciones de este protocolo incluyen investigaciones sobre el efecto de mutaciones de la enfermedad mieloide o moléculas pequeñas en la diferenciación mieloide de las células CD34+.

Diferenciación panmieloide de la sangre de cordón humano derivada CD34+ Células hematopoyéticas del tallo y progenitor

Presentamos un protocolo sencillo para el aislamiento de células mononucleares de sangre periférica a partir de sangre total obtenida de pacientes diagnosticados con Síndrome de Sézary, seguido de selección de linfocitos T CD4+, su estimulación con forbol12-miristato13-acetato e ionóforo A23187, y preparación de ARN para el perfil transcriptómico.

Aislamiento de células mononucleares de sangre periférica humana y células T CD4 + de pacientes con síndrome de Sézary para perfiles transcriptómicos

Este protocolo detalla un método compatible con la automatización de alto rendimiento para aislar células mononucleares de sangre periférica humana para biobancos y otros fines.

Aislamiento de células mononucleares de sangre periférica humana de Buffy Coats a través de la separación inmunomagnética de perlas de alto rendimiento

Aprende a aislar subconjuntos de precursores de células B de sangre de cordón umbilical mediante centrifugación en gradiente de densidad, depleción magnética y citometría de flujo. Este método eficiente proporciona células de alta calidad para análisis de ácidos nucleicos.

Aislamiento de los precursores de células B subconjuntos de Sangre del Cordón Umbilical

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