Medición de la carga in vivo de bacterias que expresan luciferasa en una larva de insecto

Para medir la carga bacteriana in vivo, comience con larvas de insectos esterilizadas preinfectadas con Bacillus Calmette-Guérin o BCG lux. BCG lux es una cepa de Mycobacterium bovis BCG modificada genéticamente que expresa luciferasa, una enzima productora de bioluminiscencia.

Transfiera una larva de insecto a un tubo de matriz lisante que contenga tampón con bolas de acero. Con un homogeneizador, homogeneice la larva, liberando los componentes intracelulares, incluidas las bacterias, en el tampón.

Centrifugar el tubo para recoger el homogeneizado y transferirlo a un tubo luminómetro.

Lave el tubo de matriz con un tampón que contenga detergente para solubilizar los fragmentos celulares y liberar las bacterias residuales.

Combine las fracciones en el mismo tubo del luminómetro y agregue el sustrato de luciferasa. Los sustratos entran en las bacterias e interactúan con las enzimas luciferasas, lo que da como resultado la bioluminiscencia. Cargue el tubo en un luminómetro y mida la bioluminiscencia.

El luminómetro mide la intensidad de la luz emitida y calcula la unidad de luz relativa, o RLU, indicativa de la carga in vivo de BCG en una larva de insecto.

Extienda la suspensión homogeneizada diluida en una placa de agar que contenga piperacilina e incube para cultivar selectivamente BCG como colonias distintas. Las colonias en la placa representan la unidad formadora de colonias, o UFC. La relación RLU a UFC correlaciona la bioluminiscencia con la viabilidad bacteriana.

Cada 24 horas, seleccione al azar cinco larvas infectadas y use un bastoncillo de algodón empapado en etanol al 70% para esterilizar suavemente las superficies larvarias. Coloque las larvas individualmente en tubos de matriz de lisis de dos mililitros que contengan 800 microlitros de PBS estéril. Luego, use un homogeneizador para homogeneizar las larvas durante 60 segundos a seis metros por segundo.

Centrifugar los tubos de lisado a 3.500 veces g durante cinco segundos para eliminar el homogeneizado de las tapas, y decantar cuidadosamente el homogeneizado en cinco tubos luminométricos estériles individualmente. Reserve 100 microlitros de homogeneizado en un tubo de reacción estéril de 1,5 mililitros. Recupere cualquier homogeneizado restante lavando los tubos de matriz de lisis con un mililitro de PBST y pipetee en los tubos del luminómetro correspondientes.

Agite los tubos del luminómetro y mida la bioluminiscencia de los homogeneizados en un luminómetro. Luego, prepare diluciones seriadas de 10 veces de los 100 microlitros reservados de homogeneizado en placas de cultivo de 24 pocillos utilizando PBST. Pipetear 10 microlitros de la dilución en cada placa de agar Middlebrook 7H11 y utilizar un esparcidor de placas estéril para esparcir. Incubar a 37 grados centígrados durante dos semanas.

Después de eso, cuente las unidades formadoras de colonias.