Descifrar e imagen Patogénesis y Cording de Abscessus Mycobacterium En embriones de pez cebra

El objetivo general de este procedimiento es estudiar y comparar la virulencia de las cepas de Mycobacterium abscessus y describir las interacciones entre estas bacterias y el sistema inmune innato del huésped in vivo utilizando embriones de pez cebra transparente. Esto se logra preparando primero un ocular bacteriano homogéneo. A continuación, los embriones se inyectan por vía intravenosa con las suspensiones bacterianas a las 30 horas después de la fecundación.

Además, para estudiar con mayor precisión el papel de los macrófagos en el control de infecciones, se utiliza un procedimiento de inyección basado en lipo choato para generar embriones empobrecidos en macrófagos. Finalmente, los embriones infectados se preparan y se obtienen imágenes mediante fluorescencia y microscopía confocal para controlar la progresión de la infección. En última instancia, los resultados que se pueden obtener muestran las interacciones específicas entre las células fagocíticas fluorescentes y M abscessus, ya sea como basi individuales o como cordones serpentinos dentro de un embrión transparente.

La principal ventaja de utilizar peces cebra frente a otros modelos animales como los ratones es que permite investigar específicamente el proceso de infección en tiempo real y estudiar en una imagen las interacciones específicas entre los abscesos de microbacterias y los micrófagos o neutrófilos. Este paso es un problema crítico para la presión de inyección posterior en el pez cebra. Debido a la alta propensión de Mycobacterium abscessus rugoso a formar grandes agregados y producir códigos, es necesario un tratamiento específico para preparar un inocular homogéneo y cuantitativamente controlado antes de la microinyección.

Para preparar el absceso, se cosecharon cultivos en crecimiento exponencial a partir de matraces de cultivo de tejidos de 150 centímetros cuadrados en tubos de plástico estériles de 50 mililitros y se centrifugaron a 4.000 veces G y temperatura ambiente durante 15 minutos. Utilice un mililitro de Middlebrook seven H nine, complementado con el enriquecimiento de OADC, más tween 80 en lo sucesivo denominado siete H nine medium para resuspender el pellet y Eloqua. 200 microlitros de las suspensiones bacterianas en tubos de 1,5 mililitros con una aguja de calibre 26 homogeneizan cada cuádruple ALI de suspensión bacteriana 15 veces.

Luego, usando un baño de agua, sonicate, sonicate tres veces durante 10 segundos cada una con descansos de diez segundos. En el medio, agregue un mililitro de siete H nueve, medio y brevemente vórtice, luego centrifugar a 100 veces G durante tres minutos. Recoja cuidadosamente las micobacterias que contienen sobrenadantes para evitar grumos y extraiga las suspensiones homogéneas en un tubo de plástico estéril de 50 mililitros.

Centrifugar la suspensión a 4.000 veces G durante cinco minutos y utilizar 200 microlitros de siete medios H nine para resuspender el pellet y evaluar el inóculo bacteriano final. De acuerdo con el protocolo de texto, la demostración visual de este método, es crítico ya que los pasos son difíciles de aprender porque la manipulación precisa y suave de la inyección en embriones de pez cebra bajo el microscopio, así como la adquisición de la técnica de microinyección, requirió tiempo para llevar a cabo la microinyección de M abscessus aproximadamente a las 24 horas. Después de la fertilización o HPF, use pinzas para recubrir los embriones en una placa de Petri de 100 milímetros y manténgalos a 28,5 grados centígrados.

Transfiera 30 48 embriones HPF a una cámara de posicionamiento en forma de V llena de 25 mililitros de agua de pescado que contiene 270 miligramos por litro de trica con una punta de microcargador recortada. Poner los embriones correctamente en los canales para facilitar la manipulación. Utilice PBST con 0,05% entre 80 para diluir el inóculo microbacteriano a la UFC deseada que se entregará e incluya 10% de rojo de fenol para verificar la inyección adecuada con una punta de micro cargador.

Cargue una aguja de microinyección con cinco a 10 microlitros de inóculo bacteriano. Conecte la aguja de microinyección en el soporte de un micromanipulador conectado al inyector y use pinzas finas para romper la parte superior de la aguja. Para obtener un diámetro de apertura de cinco a 10 micrómetros.

Calibre el volumen de inyección ajustando la presión y el tiempo de microinyección. Luego, para obtener el volumen de inyección requerido, mida el diámetro de una gota expulsada en la yema de un embrión para microinyectarla en la vena mimada. Coloque el embrión con el lado ventral hacia la aguja y coloque la punta de la aguja cerca de la abertura urogenital.

Y empuje suavemente la punta de la aguja dentro del embrión hasta que perfore la región de la vena mimada. A continuación, suministre el volumen deseado de suspensión bacteriana, normalmente de uno a tres nanolitros, que contiene alrededor de 100 UFC por nanolitro. Incubar y monitorizar los embriones según el protocolo de texto para realizar lipo Choate, depleción de macrófagos y embriones a 24 HP. Destino, los embriones, y transferirlos a una placa de inyección llena de agua de pescado con trica.

Luego oriéntalos con el lado dorsal hacia abajo. Después de vórtice la solución de clodronato encapsulada en liposomas, cargue la aguja microcapilar y calibre el volumen de inyección. Perfore la región de la vena mimada como se demostró anteriormente e inyecte de dos a tres litros de solución.

Repita la inyección tres veces. Incubar los embriones a 28,5 grados centígrados y utilizar microscopía de fluorescencia para controlar el agotamiento adecuado de los macrófagos antes de infectarlos. Como se demostró anteriormente en este video para enumerar las unidades formadoras de colonias o UFC en el punto de tiempo deseado.

Recoja cinco embriones por condición de infección y transfiera cada embrión a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Crioanestesiar los embriones mediante incubación en hielo durante 10 minutos después de eutanasiar los embriones con 300 a 500 miligramos por litro. Trica. Use agua estéril para lavar los embriones dos veces en un tubo nuevo.

A continuación, después de eliminar agua al 2%Triton X 100 en un XPBS a cada embrión, y utilizar una aguja de calibre 26 para homogeneizar el tejido para una lisis completa. Después de centrifugar la suspensión, use un X-P-B-S-T para volver a suspender el pellet. A continuación, dilución en serie en placa del homogéneo en Middlebrook seven H 10 OADC.

Suplementado con B-B-L-M-G-I-T Panta, incube las placas a 30 grados centígrados durante cuatro días antes de contar las colonias para obtener imágenes en vivo de la infección por M. abscessus, monte los embriones anestesiados con trica en aros de bajo punto de fusión al 1% en una placa de Petri con fondo de vidrio de 35 milímetros para un microscopio invertido o un portaobjetos de depresión de una sola cavidad para microscopía confocal vertical. Oriente el embrión a la posición deseada y cubra el aros solidificado con agua de pescado que contenga trica para obtener imágenes fijas de la infección por M. abscessus. Después de sacrificar los embriones, transfiéralos a tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros y fije los embriones en aldehído Paraform al 4% en un X-P-B-S-T durante dos horas.

A temperatura ambiente, elimine el aldehído paraformado lavando los embriones dos veces con un X-P-B-S-T durante 10 minutos para preservar la integridad de los tejidos y la fluorescencia sucesivamente. Incubar los embriones en concentraciones crecientes de solución de glicerol durante 10 minutos por condición. Coloque el embrión incrustado en glicerol al 50% en una cámara de observación.

Por último, utilice un microscopio de fluorescencia con un objetivo de 10 x o un microscopio confocal de fluorescencia con objetivos de 40 x o 63 x para la adquisición secuencial de fluorescencia y la transmisión de imágenes del embrión. Para investigar y comparar la virulencia de las variantes rugosas y lisas de M abscessus, se inyectaron bacterias fluorescentes por vía intravenosa en 30 embriones competentes en HPFC. A diferencia de la variante lisa, la rugosa induce una infección más robusta y letal con el desarrollo de abscesos dentro del sistema nervioso central.

Las diferencias en la virulencia se cuantificaron enumerando las UFC o determinando los recuentos de píxeles fluorescentes que están correlacionados. Como se ve en esta figura, la cinética de la formación del cordón se puede monitorear e identificar mediante microscopía de video de manera no invasiva, lo que demuestra la propensión de la variante rugosa a replicarse extracelularmente, como se muestra aquí. La infección de embriones empobrecidos por macrófagos con el absceso M rugoso conduce a un aumento masivo de las cargas bacterianas y de la producción del cordón umbilical y a una rápida muerte larvaria.

Esto indica claramente que los macrófagos son necesarios para controlar la infección por M abscessus para observar en tiempo real las interacciones entre los macrófagos y el M abscessus. Se puede utilizar la línea transgénica de cereza EG one M que produce macrófagos fluorescentes rojos. Las infecciones inducen un marcado reclutamiento de macrófagos con fagocitosis eficiente de bacterias individuales, mientras que los cordones micobacterianos representan una estrategia desarrollada por los abscesos para evitar ser fagocitados después de su desarrollo.

Esta técnica allanó el camino para explorar el importante papel de la codificación como un nuevo mecanismo de evasión inmunitaria. Gracias a la infección del pez cebra, ahora es posible observar y describir la contribución in vivo de los códigos en la patogénesis de los abscesos de micobacterias.