Una técnica in vitro para estudiar la interacción de las células T con bicapas lipídicas planas soportadas

Tome un portaobjetos de flujo que contenga una bicapa lipídica soportada, o SLB.

El SLB se conjuga con ligandos específicos (molécula de adhesión intercelular 1 o ICAM-1 y anticuerpos anti-CD3) marcados con fluoróforos.

Agregue células T y anti-CD107a Fab marcado con fluoróforo, el fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo contra el marcador de degranulación.

El complejo receptor de células T-CD3 o TCR-CD3 se une al anticuerpo anti-CD3, desencadenando el TCR.

La señalización de adentro hacia afuera inducida por el desencadenamiento activa las integrinas en la superficie, que se unen al ICAM-1 inmovilizado.

La conjugación induce la reorganización del citoesqueleto: reordenamiento de microtúbulos y polimerización de actina que conduce a la propagación lateral de la célula en la superficie de SLB.

La propagación permite que más interacciones ligando-receptor formen un grupo de activación supramolecular o SMAC, creando una sinapsis inmune.

Los gránulos líticos de células T se mueven a lo largo de los microtúbulos y se fusionan con la membrana plasmática, exponiendo marcadores de degranulación en la superficie celular, que se unen a la Fab anti-CD107a.

Con un microscopio de fluorescencia, visualice la sinapsis inmune enriquecida en complejos TCR-CD3, integrinas y marcadores de degranulación.

Comience usando pinzas tipo tijera de polipropileno para sumergir cubreobjetos de vidrio en una solución ácida de piraña recién preparada durante 25 a 30 minutos. Al final del lavado, enjuague los cubreobjetos siete veces en un volumen nuevo de agua ultrapura para cada lavado y deje los cubreobjetos húmedos a un lado para dejar que el agua restante se desplace del vidrio limpio.

Cuando los cubreobjetos estén secos, alícuota dos microlitros de la mezcla final de liposomas, precisamente, en el centro de un canal de portaobjetos autoadhesivo dentro de una campana de flujo estéril, e inmediatamente pero con cuidado, alinee un cubreobjetos limpio y seco con el portaobjetos para permitir que el cubreobjetos se baje suavemente sobre el lado adhesivo del portaobjetos, y use el anillo exterior de las pinzas de polipropileno tipo tijera para aplicar una presión suave al contacto periférico del portaobjetos. cubreobjetos con el portaobjetos, asegurándose de que el cubreobjetos esté bien sujeto al portaobjetos para evitar fugas. Luego, dale la vuelta a la diapositiva y usa un marcador permanente para dibujar cuatro puntos alrededor de la bicapa en el lado externo del conjunto de la diapositiva.

Antes de la primera inyección, designe un puerto del canal como puerto de entrada y el otro como puerto de salida, manteniendo esta designación durante todo el experimento. Para evitar la formación de burbujas, inserte el extremo de la punta de la pipeta directamente en el puerto de entrada hasta que sienta que el sello de goma del canal deslizante se penetra con la punta.

Lentamente, llene el canal con 50 microlitros de tampón de ensayo tibio. Inyecte 200 microlitros de cloruro de níquel (II) en una solución bloqueadora de caseína en el puerto de entrada y retire 50 microlitros del tampón del puerto de salida. Después de una incubación de 45 minutos, retire el exceso de solución de caseína del puerto de salida.

Inyecte 100 microlitros de una solución de ICAM-1 y estreptavidina en el puerto de entrada para una incubación de 45 minutos a temperatura ambiente. Al final de la incubación, retire el exceso de solución proteica del puerto de salida y lave la bicapa dos veces con 100 microlitros de tampón de ensayo por lavado. Luego, etiquete las bicapas con 100 microlitros de anticuerpo anti-CD3 conjugado con fluoróforo durante 45 minutos a temperatura ambiente, seguido de dos lavados en 100 microlitros de tampón de ensayo por lavado, como se demuestra.

Para obtener imágenes de las interacciones entre las células T y la bicapa, coloque el portaobjetos en la platina calentada a 37 grados Celsius de un microscopio de fluorescencia de reflexión interna total, o TIRF, y ajuste la platina utilizando las marcas de tinta para centrar la bicapa en el objetivo de 100 potencias.

Para obtener imágenes de liberación de gránulos, agregue fragmentos Fab de anticuerpos anti-CD107a conjugados con fluorescencia a la suspensión de células T CD4 y vuelva a suspender las células marcadas en 50 microlitros de tampón de ensayo para inyectarlas en el puerto de entrada del canal deslizante. Luego, seleccione la cantidad adecuada de campos experimentales y grabe imágenes de cada campo una vez por minuto durante 30 minutos después de la inyección.