Arrays Ligando Nano-racimo en un Apoyado bicapa lipídica

El objetivo general de esta técnica es fabricar una matriz de nanogrupos de proteínas en una bicapa lipídica soportada, que sea compatible con técnicas de microscopía de superficie sensible para aplicaciones de biología celular. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biofísica celular, en particular, cómo la nanoagrupación de ligandos influye en la activación y adhesión de las células T. La principal ventaja de esta técnica es que es fácilmente reproducible en el laboratorio biofísico estándar y es compatible con técnicas avanzadas de microscopía sensible a la superficie, como TIRF y RICM.

Aunque esta técnica está diseñada para proporcionar información sobre inmunología, se puede aplicar a otros tipos de células con aplicaciones potenciales en biología celular, oncología e ingeniería de tejidos. Para comenzar este procedimiento, limpie los portaobjetos de la cubierta de vidrio y las cámaras de observación como se describe en el protocolo de texto. Luego, deposite 70 microlitros de suspensión de cordones de sílice al 2% gota a gota en una corredera de cubierta sostenida con una inclinación de 15 grados.

Voltee el vidrio 90 grados cada 15 segundos durante un minuto mientras se secan las suspensiones. Es fundamental crear una monocapa de perlas muy compacta y evitar la formación de multicapas y cúmulos de aceite. Es por eso que es necesario optimizar la concentración y el volumen de la solución de perlas, así como la hidrofilicidad del portaobjetos.

Después de que el líquido se haya evaporado, coloque el portaobjetos dentro de un dispositivo de pulverización catódica de magnatron de radiofrecuencia en una mesa giratoria situada a 105 milímetros de distancia de un objetivo de silicio de aluminio. Después de esto, use una bomba turbomolecular para disminuir la presión en la cámara de deposición a 2,6 veces 10 por los cuartos pascales negativos. Introduzca una atmósfera de argón puro con un flujo de 10 centímetros cúbicos estándar por minuto y una presión de 0,8 pascales.

A continuación, encienda el generador de energía de radiofrecuencia. Una vez estabilizado el plasma, pulveriza chisporroteando durante dos minutos mientras mantienes el obturador cerrado, para eliminar las posibles impurezas de la superficie objetivo. Abra el obturador y deje que el chisporroteo continúe durante 60 minutos para depositar una capa de aluminio de 200 nanómetros de espesor en la corredera.

Luego corte el flujo de argón. Cierre la válvula de compuerta para aislar la bomba turbomolecular de la cámara de deposición. Después de esto, ventile la cámara con nitrógeno limpio para alcanzar la presión ambiente.

Recupere la corredera recubierta de aluminio de la cámara. Sumerja el portaobjetos recuperado en agua ultrapura a temperatura ambiente y ultrasónicamente a 50 vatios y 50 hercios durante 30 segundos. A continuación, deposite 0,5 milímetros de APTES en el fondo de un desecador.

Coloque el portaobjetos de vidrio sobre una rejilla de cerámica. Coloque la rejilla en el desecador. Conecte el desecador a una bomba de membrana.

A continuación, haga funcionar la bomba a máxima potencia durante 30 minutos para generar un vacío bajo. Cierre la válvula del desecador y apague la bomba. Calentar a 50 grados centígrados durante una hora.

Después de esto, abra el desecador y recoja el portaobjetos. Coloque el portaobjetos recogido sobre un soporte de PTFE. Depositar 2 mililitros de 25 microgramos por mililitro de biotina disuelta en PBS.

Deje reposar el portaobjetos durante 30 minutos a temperatura ambiente. Luego enjuague 10 veces con PBS. Incube el portaobjetos en una solución de hidróxido de sodio y PBS a temperatura ambiente durante la noche.

Después de esto, enjuague el portaobjetos 10 veces con agua ultrapura. Después de limpiar el comedero Langmuir, coloque las bandejas de PTFE en el recinto de PTFE del comedero. Luego llénalo con agua ultrapura.

Ajuste la presión medida a cero milinewtons por metro. Usando una jeringa de metal de vidrio hermética al gas, deposite 30 microlitros de 1 miligramo por milímetro de solución de DOPC y cloroformo en la superficie del agua. Cierre la barrera de PTFE hasta alcanzar la presión deseada de 27 milinewtons por metro para comprimir la monocapa de lípidos.

A continuación, con una abrazadera motorizada, sumerja el portaobjetos de vidrio preparado en la carcasa de PTFE. Sujete la corredera en la abrazadera perpendicular a la interfaz aire-agua. Eleve la corredera a través de la interfaz a una velocidad de 15 milímetros por minuto mientras mantiene una presión constante de 27 milinewtons por metro.

Luego, coloque el portaobjetos de vidrio horizontalmente en la superficie del agua sobre una bandeja de PTFE. A continuación, con unas pinzas metálicas, empuje el portaobjetos hacia abajo en la bandeja de PTFE, sumergiéndolo en el agua ultrapura. Utilice las pinzas para transferir la bandeja de PTFE que contiene el portaobjetos a un cristalizador lleno de agua ultrapura.

Transfiera el portaobjetos recubierto bajo el agua a una cámara de observación. Después de esto, cierre la cámara, asegurándose de que aproximadamente 1 mililitro de agua quede atrapado en el interior. Otro paso delicado es el montaje de la cámara de muestras bajo el agua.

Y se debe evitar absolutamente el contacto con el aire de las bicapas depositadas, por lo que para garantizar esto se utiliza un gran volumen de agua y se asegura de que todo el proceso de montaje pueda ocurrir bajo el agua. Retire la cámara ensamblada del agua, verifique que la cámara sea hermética y esté libre de fugas. Agregue 500 microlitros de PBS, luego retire 500 microlitros de líquido de la cámara.

Repita este proceso 10 veces para reemplazar completamente el mililitro de agua ultrapura en la cámara con PBS. A continuación, introduzca 100 microgramos por mililitro de albúmina sérica bovina en la cámara de observación. Incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos.

Después de esto, enjuague la bicapa retirando y agregando 500 microlitros de la cámara, 10 veces. A continuación, funcionalice con ligandos, deposite células y observe el nanopatrón proteolipídico y la fluidez de SLB como se describe en el protocolo de texto. En este protocolo, se utiliza una máscara de perlas para crear una máscara de metal secundaria mediante la deposición controlada de aluminio.

Luego, se retira la máscara de cuentas, dejando una capa de aluminio con agujeros. A continuación, se deposita una silina organo-amino, llamada APTES, en la fase de vapor, seguida de la deposición de BSA-Biotina en la fase acuosa. Luego, se retira el aluminio, revelando parches de proteínas nanométricas.

Finalmente, el espacio entre puntos se rellena con una bicapa lipídica compatible. A continuación, se toman imágenes de epifluorescencia de los nanopuntos y de la bicapa lipídica soportada. Una imagen compuesta muestra una complementariedad perfecta con la bicapa lipídica depositada de forma única alrededor de los puntos de proteína, pero no sobre ellos.

En una imagen de epifluorescencia de una bicapa lipídica soportada recién depositada, los puntos de proteína aparecen como manchas oscuras en un mar brillante de lípidos. Sin embargo, después de un fotoblanqueo continuo durante 50 segundos, la imagen muestra un halo dentro de la región delimitada por el diafragma de campo, lo que indica que los lípidos son móviles. El análisis del perfil de intensidad promedio a lo largo del borde del diafragma de campo, y la disminución de esta intensidad a lo largo del tiempo durante el proceso de blanqueo, revela que la constante de difusión es de cinco micrómetros cuadrados por segundo.

Esta técnica se puede realizar en dos días si se realiza correctamente. Es importante mantener condiciones muy limpias durante la deposición de aluminio y calibrar cuidadosamente la curva de deposición. Siguiendo este procedimiento, la diapositiva con patrón se puede funcionalizar aún más.

Por ejemplo, añadiendo otra biomolécula en la bicapa. Usamos esto para imitar el antígeno de las células herbívoras, con el fin de estudiar la activación de las células T. Por lo tanto, después de su desarrollo, esta técnica debería interesar a diversas audiencias.

Por ejemplo, los ingenieros de tejidos pueden querer usarlo como andamio para cultivar tejidos artificiales, y los oncólogos pueden usar esto como una plataforma para plantear preguntas fundamentales sobre la adición de células cancerosas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo fabricar un área de nanogrupos de proteínas en una bicapa lipídica compatible, que es compatible con una técnica de microscopía avanzada. Si bien usamos esto para estudiar las células T, creemos que este sustrato tiene el potencial de convertirse en la plataforma de elección para estudiar la interacción de cualquier tipo de células con membrana proteolipídica de patrón controlado.