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Agregue medios y antisueros tratados con enzimas destructoras de receptores diluidos en serie a las monocapas de células de mamíferos, evitando la unión inespecífica del virus.
Agregue una suspensión del virus de la influenza. Los anticuerpos antisueros, específicos de las proteínas virales, se unen, neutralizan los virus y evitan la entrada celular.
La baja concentración de anticuerpos neutralizantes o los anticuerpos no neutralizantes permiten una unión ineficaz del antígeno viral, lo que permite la unión del virus a los receptores celulares.
Deseche los medios. Aplique medios que contengan celulosa, formando una capa semisólida.
El virus utiliza la maquinaria de la célula huésped para formar partículas virales y causar lisis celular.
La superposición restringe el movimiento del virus, lo que facilita la infección localizada y crea agujeros en las monocapas celulares.
Elimina la superposición. Fijar y permeabilizar las células.
Lavar con tampón. Agregue anticuerpos que se unan a antígenos virales dentro de las células permeabilizadas.
Pipeta anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante que se unen a anticuerpos primarios.
Introducir sustratos de peroxidasa y peróxido de hidrógeno, dando como resultado un producto azul.
Pocillos de imágenes para cuantificar las poblaciones de células infectadas por virus frente a las diluciones de antisuero.
Identificar las diluciones de antisueros que indican una reducción específica en una población de células infectadas para determinar los títulos de neutralización.
Para llevar a cabo la neutralización del virus, prepare la monocapa celular con dos o tres días de anticipación, luego agregue 50 microlitros de VGM a cada pocillo de la placa. Utilice las columnas 11 y 12 para el control del virus y el control celular, respectivamente. Agregue alícuotas de 50 microlitros de una dilución de 1 en 20 de enzima destructora de receptores o suero tratado con RDE a la primera fila de columnas 1 a 10.
Realice diluciones en serie dobles transfiriendo 50 microlitros de la fila A a la fila H y desechando 50 microlitros de la fila H. Luego, agregue 50 microlitros de diluyente a cada pocillo de la columna de control celular. Agregue 50 microlitros del virus a cada pocillo de la placa, excepto la columna de control celular. Incube la placa a 37 grados centígrados durante dos o tres horas. Luego, retire el inóculo y agregue la capa a cada pocillo. Incube la placa durante la noche a 37 grados centígrados sin ser molestada. Luego, arregle y tiña las placas.
Para cuantificar la neutralización, coloque una placa de pocillos en el área de escaneo de un escáner plano. Escanee la placa y ejecute el software lector de placas de pocillos para calcular los títulos virales requeridos.