Desarrollo y validación de una sola molécula ultrasensible matriz Digital análisis de enzima-ligado del inmunosorbente para interferón-α humano

Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre la naturaleza, la regulación y el impacto biológico de las respuestas inducidas por el interferón en diferentes entornos de enfermedades, incluida la autoinmunidad y la infección. La principal ventaja de esta técnica es su propia sensibilidad. Esta técnica tiene un gran potencial para el descubrimiento de biomarcadores para mejorar el manejo del paciente en muchas enfermedades, ya que puede cuantificar citoquinas con una sensibilidad sin precedentes.

Un paso importante con este enfoque fue neutralizar las actividades relacionadas con los pacientes con sistema poliindocrina autoinmune tipo uno. Para comenzar, cargue 280 millones de perlas paramagnéticas en un tubo de microfuga, tomando nota del volumen. A continuación, gire las cuentas y coloque el tubo en un separador magnético durante un minuto.

Retire y deseche la solución diluyente, aislando así las perlas. A continuación, lave las cuentas con BWB dos veces y BCB dos veces. Para cada lavado, agregue 200 microlitros y agite el tubo durante cinco segundos.

A continuación, separe las perlas de la solución utilizando el separador magnético. Después de un minuto de separación, deseche el diluyente. A continuación, agregue 190 microlitros de BCB por volumen de cuentas.

Luego agite el tubo brevemente, haga girar el tubo por pulso y coloque las cuentas lavadas en hielo. Para activar las perlas, combine un mililitro de BCB frío con 10 miligramos de EDC y vórtice hasta que la solución sea homogénea. Trabaje de forma rápida y segura cuando utilice EDC, debido a su inestabilidad inherente y a su solución equino.

A continuación, añada 10 microlitros de EDC frío y diluido por volumen de perlas a la suspensión de perlas y vórtelas brevemente. A continuación, coloque las cuentas en una coctelera a temperatura ambiente durante 30 minutos. Para conjugar anticuerpos contra las perlas, primero el vórtice y el pulso giran las perlas activadas.

A continuación, coloque las perlas en un separador magnético durante un minuto y deseche el sobrenadante BCB. A continuación, retire el tubo del imán y lave las cuentas dos veces con 200 microlitros de BCB. A continuación, el vórtice, el pulso de giro y la separación magnética de las perlas para eliminar el tampón.

A continuación, añada rápidamente 200 microlitros de anticuerpo frío intercambiado por tampón a las perlas activadas. Después de convertir las perlas en vórtice en solución, coloque la suspensión en el agitador a temperatura ambiente durante dos horas a 1.000 RPM. Comience por darle un giro de pulso a la suspensión de perlas recubierta de anticuerpos y luego use la columna magnética para eliminar el tampón.

A continuación, compruebe la concentración de la proteína en el tampón. Utilice un espectrofotómetro de bajo volumen. En este punto, los anticuerpos se acoplan a las perlas y cualquier valor por encima de cero significa que las perlas están saturadas de anticuerpos.

Ahora, lava las cuentas con 200 microlitros de BWB, como se realizó en todos los lavados anteriores. Luego, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo y verifique la concentración de proteínas. La cuantificación de las proteínas que se liberan de las perlas permite medir el acoplamiento de anticuerpos.

A continuación, vuelve a lavar las cuentas con 200 microlitros de BWB. A continuación, agregue 200 microlitros de tampón que bloquea las perlas, agite el tubo durante cinco segundos y transfiéralo al agitador a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después de 30 minutos, las cuentas se bloquearán.

Luego, lávelos una vez con 200 microlitros de BWB, seguido de lavarlos dos veces con 200 microlitros de tampón diluyente de perlas para cada lavado. A continuación, almacene las perlas recubiertas y bloqueadas en 200 microlitros de tampón diluyente de perlas a cuatro grados centígrados. Esta sección del video sugiere estrategias sobre cómo ajustar las condiciones del ensayo utilizando el software del analizador de matriz de molécula única en la configuración de preparación casera.

Comience probando diferentes combinaciones de perlas conjugadas de anticuerpos de captura y anticuerpos de detección de biotinilación en ambas combinaciones de anticuerpos. A continuación, pruebe las combinaciones de las tres concentraciones diferentes de anticuerpos de captura con dos proporciones de biotinilación diferentes para la detección y captura de anticuerpos y viceversa. A continuación, elija la combinación que ofrezca el nivel más bajo de detección y utilícela para los pasos posteriores.

En este caso, una ración de 30 a 1 de biotina por anticuerpo da el mejor límite de detección. A continuación, compare una configuración de dos pasos con una configuración de tres pasos. Las configuraciones de tres pasos tienen tres pasos de incubación diferentes.

Uno con el anticuerpo de captura, otro con el anticuerpo de detección y un tercero final para el marcaje de la enzima SBG. Las configuraciones de dos pasos combinan las incubaciones de captura y detección. Ejecute el analizador de matriz de molécula única utilizando las concentraciones y raciones de anticuerpos de captura y detector seleccionadas en las configuraciones de dos y tres pasos, preconfiguradas en el analizador, siguiendo las instrucciones del fabricante.

A continuación, elija la configuración que permita la máxima sensibilidad y guárdela para futuros pasos. En este caso, la configuración de dos pasos proporciona una sensibilidad ligeramente superior en cada punto de prueba. A continuación, optimice las concentraciones del anticuerpo detector y el SBG.

Pruebe tres concentraciones diferentes de anticuerpo detector con tres concentraciones diferentes de SBG. Elija las concentraciones que den la mayor sensibilidad y guárdelas para pasos futuros. En este caso, 0,3 microgramos por mililitro de anticuerpo y 150 pica molar SBG tienen el nivel óptimo de detección con niveles de fondo bajos con amplitud media fortuita.

Para conocer los pasos de optimización adicionales, consulte el protocolo de texto. Allí hay procedimientos para optimizar la especificidad y la reproducibilidad del ensayo y un ensayo para la competencia de proteínas. Utilizando un ensayo optimizado para detectar 13 subclases de interferón alfa, se analizaron plasma y suero en pacientes con LES, pacientes con DMJ y controles sanos.

Se detectaron niveles altos de proteína interferón alfa en ambas cohortes de enfermedades. La línea punteada indica el nivel de detección de un Eliza convencional disponible comercialmente que no detectaría la proteína interferón alfa en estos grupos de pacientes, a pesar del papel conocido de esta citocina en estas enfermedades. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo desarrollar y validar un ensayo de matriz de moléculas individuales para el análisis de su elección.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que durante la elección celular de los anticuerpos es. Desde su desarrollo, este ensayo ha permitido una mejor caracterización del papel del interferón-alfa en una diversidad de enfermedades autoinmunes e infecciones. Este ensayo también ha servido para monitorizar las respuestas a nuevas terapias e identificar los actores celulares responsables de ciertos trastornos autoinmunes.