Name: Desarrollo y validación de una sola molécula ultrasensible matriz Digital análisis de enzima-ligado del inmunosorbente para interferón-α humano (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Aprende a desarrollar y validar un ensayo digital ELISA de matriz de molécula única para detectar subtipos de interferón-alfa humano con sensibilidad ultrasensible. Este método permite cuantificar citoquinas en muestras de plasma y suero para el descubrimiento de biomarcadores en enfermedades autoinmunes.

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DD y YJC reconocen apoyo de la ANR (proyecto IFNX, no. CE17001002) y ImmunoQure AG para proporcionar anticuerpos monoclonales. Agradecemos a Brigitte Bader-Meunier, Nathalia Bellon, Christine Bodemer, Alex Belot, Isabelle Melki y Pierre Quartier para proporcionar las muestras clínicas. YJC reconoce el Consejo Europeo de investigación (GA 309449: Beca de YJC) y un subsidio del estado a cargo de la Agencia Nacional de investigación (Francia) bajo el programa de "Inversiones para el futuro", teniendo la referencia ANR-10-IAHU-01.

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Adjunto, describimos el desarrollo y validación de un sola molécula altamente reproducible, ultrasensible matriz digital ELISA para la cuantificación directa de la proteína IFN-α en muestras humanas (pasos resumidos en la tabla 1). Uno de los pasos más críticos en el desarrollo del ensayo es la elección del anticuerpo par16, con las características en cuanto a la cinética y del epítopo vinculante siendo clave para un análisis acertado. Es importante evitar el uso de anticuerpos monoclonales apareados que destino el mismo epitopo o que causan impedimento estérico. Anticuerpos policlonales podrían utilizarse como anticuerpos de detección para superar tales limitaciones. Si en cualquier etapa dada la sensibilidad deseada no se logra, más posibilidades de optimización se deben considerar. Esto puede incluir el uso de pares de anticuerpos alternativos, cambios en parámetros como el tipo de proteína (por ejemplo, BSA < caseína), pH (6.0-8.5), fuerza iónica, capacidad tampón (por ejemplo, concentraciones de NaCl y fosfato), granos del portador, o la presencia de tensioactivos. Una amplia gama de parámetros con optimizarse en el desarrollo de un análisis de matriz de molécula única. Sin embargo, en general, condiciones que le dan proporciones de alta señal: fondo y LODs mínima son los preferidos (ver figura 1, figura 2y figura 3).
En cuanto a la especificidad, el ensayo del IFN-α demostraron ninguna reactividad cruzada para cualquier otros IFN probado (β, γ, λ1, λ2, ω) (figura 4a) y fue capaz de detectar los 13 subtipos de IFN-α (Figura 4b). Sin embargo, el ensayo demostró una menor afinidad por el subtipo de IFN α2, (Figura 4b y complementario tabla 4). Curiosamente, diferentes sensibilidades de las diferentes clases de IFN-α2 (a, b, c) también observaron, que puede ser debido a procesos de fabricación diferentes o secuencias de aminoácidos diferentes, como los subtipos de IFN α2 se obtuvieron de diferentes comerciales proveedores. Con esta sola excepción, todas las especies de IFN-α dieron respuestas muy similares. La especificidad de la prueba quedó demostrada además por tratamiento previo de las muestras con anti-IFN-α un clon, que derogó la señal (figura 6 y cuadro complementario 6).
Una de las principales ventajas de esta tecnología es que cualquier analito de interés puede ser potencialmente objetivo16. Además, pueden analizarse diferentes especímenes biológicos, tales como suero, plasma, líquido cefalorraquídeo, Lisados celulares, cultura sobrenadantes31 y respiración hasta32. Generalmente, se realiza una dilución de 1:3 de plasma para evitar la obstrucción potencial del analizador array sola molécula. Sin embargo, el analito de interés puede estar presente en muy bajas concentraciones en la muestra biológica relevante y concentraciones más altas de la muestra podrían ser necesario (dependiendo de la sensibilidad del ensayo)33. Aunque existe la posibilidad de multiplexación manteniendo buena sensibilidad34, es un proceso más difícil y ensayos para la medición de más de 6 proteínas dentro de los experimentos mismos tienen todavía ser desarrollado35.
La capacidad de detección y cuantificación de citoquinas y otras proteínas biológicas pertinentes en tales concentraciones bajas se abre toda una nueva gama de aplicaciones33,36. Es bien sabido que numerosas proteínas ejercen sus efectos incluso en concentraciones muy bajas, que hasta ahora estaban por debajo del límite de detección de los ELISA mejor37. Mientras que otras tecnologías de inmunoensayo ofrecen ventajas sobre los convencionales ELISA19, demostramos aquí que a la sola molécula matriz digital es una plataforma robusta y reproducible para la detección ultrasensible de baja concentración de citoquinas en muestras humanas. Esta tecnología ofrece gran potencial para el descubrimiento de biomarcadores y mejor manejo de pacientes de una amplia gama de enfermedades.

Tipo I IFNs son una familia de citoquinas que juegan un papel central en la orquestación de la respuesta inmune antiviral. Fueron primero descubiertos por Isaacs y Lindenmann 60 años1,2 y que ahora se conoce que esta heterogénea familia de polipéptidos cuenta con 14 diferentes subclases (13 subtipos de IFN-α y IFN-1 β). Tipo I IFNs son esenciales para la separación de las infecciones virales, pero también han sido implicados en la patología de una variedad de Estados de enfermedad humana, incluyendo las enfermedades autoinmunes lupus eritematoso sistémico (les), dermatomyositis juvenil (JDM), y el tipo Me interferonopathies en el tipo constitutivo que IFN-inducido señalización resultados en patología3,4,5,6,7.
Estudiando la proteína IFN de tipo I niveles en muestras biológicas ha sido difícil desde su identificación inicial como una "injerencia en sustancia"1,2. En la actualidad, sándwich de ensayo genitals del ImmunoSorbent (ELISA) es el método más ampliamente utilizado para la detección de la proteína IFN-α. A pesar de ser específico, simple y rápido, tipo I IFN ELISA presentan limitaciones importantes, tales como limitada sensibilidad. Además, la medida de todos los subtipos de IFN-α requiere el uso de múltiples ensayos con su propia sensibilidad y capacidad de detección. Si bien hay ELISAs comerciales que detectan diferentes subtipos de IFN-α, su sensibilidad es limitada (1.95 pg/mL, 12,5 pg/mL y 12,5 pg/mL, respectivamente) que a menudo es insuficiente para detectar la proteína IFN-α en muestras biológicas. Para superar esta limitación, varios proxy biológica se han desarrollado ensayos para cuantificar tipo I IFN por medir la expresión génica inducida o actividad funcional8,9,10,11, 12 , 13 , 14. sin embargo, estos ensayos no proporcionan una medida directa de la proteína IFN-α.
En este estudio, a la sola molécula matriz digital ELISA tecnología se utilizó para desarrollar un análisis para la detección de moléculas individuales de proteínas IFN-α. ELISA digital utiliza la misma química básica como ELISA convencional, sin embargo, la reacción ocurre en arreglos de discos que comprende1646 femtoliter tamaño de la pozos de la individual 50.000 de la15,. Las moléculas de proteína solo son capturadas por perlas paramagnéticas recubiertas de anticuerpo y marcadas con un anticuerpo de detección biotinilado, seguido por Unión de una enzima conjugado, estreptavidina-β-galactosidasa (SBG). Posteriormente, los granos se suspenden con un sustrato de enzima fluorógenos, resorufin-β-D-galactopiranosida (RGP), en arreglos de discos de una sola molécula. Disminuyendo el volumen se logra la reacción de 2 mil millones de veces17, una alta concentración local de la señal fluorescente y cuentas sola molécula ser factibles, ya que cada molécula genera una señal de que ahora puede ser confiablemente medición18. En esencia las matrices sola molécula son capaces de contar solo immunocomplexes y determinar un promedio de enzimas por grano (AEB). Contando los pocillos en los que se detecta una señal permite cuantificación/digitalización de moléculas de proteína, ya que existe una correlación directa entre la concentración de la proteína y la relación entre granos de immunocomplexed y un número total de granos presentes en las cámaras de tamaño femtoliter.
Yeung et al. realizó un estudio de evaluación de plataforma cruzada extensa con nueve diferentes tecnologías y cuatro inmunoensayos de la citoquina con el objetivo de comparar análisis precisión, sensibilidad y correlación de datos entre diferentes plataformas19. Uno de los hallazgos claves del estudio fue que sola molécula matrices y sola molécula contando inmunoensayo presentaron la más alta sensibilidad para la detección de citocinas en suero humano dentro de la gama de concentración sub-pg/mL. Sola molécula matriz digital ELISA citocinas los ensayos se han utilizado para estudiar el papel de TNF-α e IL-6 en el Crohn enfermedad20, IFN-α en interferonopathy y autoinmunes pacientes 7, y los diferentes postraduccional modificación formas del C-X-C motivo chemokine 10 (CXCL10) en la hepatitis crónica y en donantes sanos recibiendo sitagliptina21,22. Otras aplicaciones incluyen la medición de la rodopsina en pacientes con retinopatía diabética23; el estudio de patologías del cerebro a través de las mediciones de suero o plasma del neurofilament luz24 y β amiloide 1-42 péptido25, en el contexto de la esclerosis múltiple y enfermedad de Alzheimer, respectivamente. Sola molécula matriz ensayos también pueden utilizarse para detección de patógenos mejoradas tales como caracterización del reservorio viral VIH26y también para la detección de ADN27 y micro RNAs28. Una gran ventaja de la tecnología de matriz de molécula única es esta gran versatilidad, como un ensayo contra cualquier analito de interés se puede desarrollar si se dispone de un par de anticuerpos específicos. Además, kits de ensayo de homebrew están disponibles comercialmente, permitiendo el desarrollo de nuevos ensayos, el protocolo que se detalla en el formulario modificado.
Aquí, una descripción detallada de los pasos de desarrollo y validación de un ensayo de arreglo sola molécula se presenta que resulta en mayor sensibilidad para la detección de la proteína IFN-α. Anticuerpos contra la molécula única matriz ensayos debe ser altamente específico, evitando reactividad cruzada con proteínas relacionadas (con especificidad de especie considerada si es relevante). Idealmente, deben elegirse de anticuerpos con una KD menor que 10-9 M; alta afinidad asegura atascamiento fuerte, con la producción de una señal mayor. La cinética de la Unión antígeno-anticuerpo son también importantes y rápida Ken y K lentoapagado favorecerá Asamblea complejo antígeno-anticuerpo. A partir de un par de anticuerpo que tiene un buen rendimiento en ELISA clásica, con un límite de detección (LOD) de 1-100 pg/mL, aumenta las posibilidades de obtener un análisis de matriz muy sensible a la sola molécula. Chang y sus colegas realizaron estudios cinéticos detallados de las interacciones biomoleculares que ocurren en cada paso, proponiendo un conjunto de ecuaciones para predecir la sensibilidad analítica18. Demostraron esa matriz sola molécula ELISA digital parece ser eficaz en una amplia gama de afinidades de anticuerpo (KD ~ 10−11 - 10−9 M), así como la generación de esa señal es más dependiente de la tasa de estos anticuerpos.
Para utilizar afinidad alta tomamos ventaja de los anticuerpos aislados de pacientes con el síndrome polyendocrinopathy autoinmune los anticuerpos tipo distrofia polyendocrinopathy-candidiasis-ectodérmica autoinmune 1 (APS1/APECED)29. Por razones que todavía no se entienden, la gran mayoría de las personas deficientes en AIRE desarrolla un conjunto básico de anticuerpos de alta avidez contra todos los subtipos de IFN-α29, y se seleccionaron dos clones de anticuerpos anti-IFN-α de las afinidades de enlace complementario para los diferentes subtipos de IFN-α, según la estimación de valores de IC50 . La combinación de estos anticuerpos de alta afinidad únicas con tecnología de matriz de molécula única permitió la cuantificación directa de IFN-α en las concentraciones de attomolar (fg/mL). Tal detección ultrasensible de la proteína IFN-α contribuye a una mejor comprensión de la naturaleza, la regulación y el impacto biológico de la respuesta de IFN-inducido en entornos diferentes de la enfermedad.

<table><tbody><tr><td>Anti-IFN-y alfa; anticuerpo A (clon 8H1)</td><td>ImmunoQure AG</td><td>NA</td><td>No disponible comercialmente</td></tr><tr><td>Anti-IFN-y alfa; anticuerpo B (clon 12H5)</td><td>ImmunoQure AG</td><td>NA</td><td>No disponible comercialmente</td></tr><tr><td>Anti-IFN-y alfa; anticuerpo EBI-1 clon de</td><td>eBioscience BMS216C</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-IFN-&alpha; anticuerpo BMS216BK</td><td>eBioscience</td><td>BMS216BK</td><td>No es un kit de ELISA, sino ABS a granel</td></tr><tr><td>, IFN y alfa; 2c</td><td>eBioscience</td><td>BMS305</td><td>OK</td></tr><tr><td>IFN y alfa; I (17)</td><td>PBL</td><td>11150-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN y alfa; 2a</td><td>PBL</td><td>11100-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN y alfa; 2a</td><td>PeproTech</td><td>Ya no está disponible</td><td></td></tr><tr><td>IFN y alfa; 2b</td><td>PBL</td><td>11105-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN y alfa; 1</td><td>PBL</td><td>11175-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN y alfa; 4a (M1)</td><td>PBL</td><td>11177-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN y alfa; 4b (a4)</td><td>PBL</td><td>11180-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN y alfa; B2 (a8)</td><td>PBL</td><td>11115-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN y alfa; C (a10)</td><td>PBL</td><td>11120-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN y alfa; D (a1)</td><td>PBL</td><td>11125-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN y alfa; G (a5)</td><td>PBL</td><td>11135-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN y alfa; F (a21)</td><td>PBL</td><td>11130-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN y alfa; H2 (a14)</td><td>PBL</td><td>11145-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN y alfa; J1 (a7)</td><td>PBL</td><td>11160-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN y alfa; K (a6)</td><td>PBL</td><td>11165-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN y alfa; WA (a16)</td><td>PBL</td><td>11190-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN y lambda; 1</td><td>PeproTech</td><td>300-02L</td><td></td></tr><tr><td>IFN y lambda; 2</td><td>PeproTech</td><td>300-02K</td><td></td></tr><tr><td>IFN y omega;</td><td>PeproTech</td><td>300-02J</td><td></td></tr><tr><td>IFN y beta;</td><td>PeproTech</td><td>300-02BC</td><td></td></tr><tr><td>IFN y gamma;</td><td>PeproTech</td><td>300-02</td><td></td></tr><tr><td>Anti-IFN-y alfa; ELISA</td><td>PBL</td><td>41115.1</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 96 pocillos</td><td>Corning</td><td>3904</td><td></td></tr><tr><td>ISRE-Reporter</td><td>Qiagen</td><td>CCS-008L</td><td></td></tr><tr><td>Fu-GENE HD Reactivo de transfección</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM Suero reducido Mediuem</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>Ensayo Dual Luciferase Reporter</td><td>Promega</td><td>E1910</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P40 Sustituto</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotómetro NanoDrop 1000</td><td>Thermo Scientific</td><td>Ya no está disponible</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de micocentrífuga Amicon - Filtros de 0,5 ml Tampón</td> de conjugación de <td>UFC505096</td><td></td>de perlas <td>Merck Millipore</td></tr><tr><td></td><td>Quanterix</td><td>102040</td><td>No se puede pedir por separado</td></tr><tr><td>No codificado Perlas paramagnéticas</td><td>Quanterix</td><td>101360</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de lavado de perlas</td><td>Quanterix</td><td>102040</td><td>No se puede pedir por separado</td></tr><tr><td>EDC</td><td>Fisher Scientific</td><td>11844071</td><td></td></tr><tr><td>tampón de bloqueo de perlas</td><td>Quanterix</td><td>102040</td><td>No se puede pedir por separado</td></tr><tr><td>Tampón de diluyente de perlas</td><td>Quanterix</td><td>101362</td><td></td></tr><tr><td>Detector y muestra Diluyente</td><td>Quanterix</td><td>101359</td><td></td></tr><tr><td>tampón de reacción de biotinilación</td><td>Quanterix</td><td>102040</td><td>No se puede pedir por separado</td></tr><tr><td>NHS-PEG4-Biotin</td><td>Fisher Scientific</td><td>11891195</td><td></td></tr><tr><td>diH2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga para tubos de microcentrífuga de 1,7 ml (centrífuga Heraens Fresco 21)</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002478</td><td></td></tr><tr><td>Mezclador de vórtice de laboratorio estándar (MS2 Minishaker)</td><td></td>Pipetas <td>IKA MS2</td><td></td></tr><tr><td>(10, 20, 200 y 1000 &mu; l)</td> <td>Puntas Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(10, 20, 200 y 1000 &mu; l)</td>Tubos de microcentrífuga <td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>de 1,7 ml</td><td>Separador magnético Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>que aloja tubos de microcentrífuga de 1,7 ml (Life Technologies DynaMag-2)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Mini centrífuga de sobremesa (Galaxy MinisStar)</td><td>Mezclador</td>/agitador VWR <td>521-2844</td><td></td></tr><tr><td>(Eppendorf Thermomixer Comfort)</td><td>Reactivos < Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>>Strong Single Molecule Array (Simoa)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SBG, Bead y Detector Etiquetas de códigos de barras</td><td>Quanterix</td><td>101652</td><td></td></tr><tr><td>Frascos de reactivos de 15 ml</td><td>Quanterix</td><td>102411</td><td></td></tr><tr><td>Simoa Placas de 96 pocillos</td><td>Quanterix</td><td>101457</td><td></td></tr><tr><td>Discos Simoa</td><td>Quanterix</td><td></td><td></td>100001</tr><tr><td>Consejos conductores Simoa 2.0</td><td>Quanterix</td><td>101726</td><td></td></tr><tr><td>Cubetas Simoa</td><td>Quanterix</td><td>100803</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo Simoa SBG</td><td>Quanterix</td><td>102295</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo Simoa RGP</td><td>Quanterix</td><td>101736</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de sistema Simoa 1</td><td>Quanterix</td><td>100486</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de sistema Simoa 2</td><td>Quanterix</td><td>100487</td><td></td></tr><tr><td>aceite de sellado</td><td>Quanterix</td><td>100206</td><td></td></tr><tr><td>ddH2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analizador Simoa HD-1</td><td>Quanterix</td><td>100032</td><td></td></tr><tr><td>Technologies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matriz de moléculas individuales (Simoa)</td><td>Quanterix</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Recuento de moléculas individuales Sistemas de inmunoensayo Erenna</td><td>Singluex</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

desarrollo y validación de una sola molécula ultrasensible matriz digital análisis de enzima-ligado del inmunosorbente para interferón-α humano

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

El objetivo principal de este protocolo es describir el desarrollo y validación de interferón (IFN)-ensayo de ensayo genitals del ImmunoSorbent (ELISA) digital de matriz α sola molécula. Este sistema permite la cuantificación de la proteína IFN-α humana con sensibilidad sin precedentes y con ninguna reactividad cruzada para otras especies de IFN.
El primer paso clave del protocolo es la elección de la pareja de anticuerpo, seguida por la conjugación del anticuerpo de captura de bolas paramagnéticas y biotinylation del anticuerpo de detección. Tras este paso, diferentes parámetros tales como la configuración de análisis, concentración de anticuerpo detector y tampón composición pueden modificarse hasta logra una sensibilidad óptima. Por último, especificidad y reproducibilidad del método son evaluados para asegurar la confianza en los resultados. Aquí, hemos desarrollado un ensayo de arreglo sola molécula de IFN-α con un límite de detección de fg/mL 0,69 con autoanticuerpos de alta afinidad aislados de pacientes con mutaciones biallelic en la proteína del regulador autoinmune (AIRE) provocando polyendocrinopathy autoinmune síndrome tipo 1 autoinmune distrofia polyendocrinopathy-candidiasis-ectodérmica (APS1/APECED). Lo importante, estos anticuerpos permitieron la detección de los 13 subtipos de IFN-α.
Esta nueva metodología permite la detección y cuantificación de la proteína IFN-α en muestras biológicas humanas a concentraciones de attomolar por primera vez. Esta herramienta será muy útil en el seguimiento de los niveles de esta citoquina en la salud y la enfermedad, la mayoría especialmente infección, autoinmunidad y autoinflammation.

En Resumen, un análisis de matriz de molécula única pan-IFN-α con un límite de detección de 0.69 fg/mL, con una configuración de 2 pasos de captura cuentas recubierta de 0,3 mg/mL de anti-IFN-α un anticuerpo y anti-IFN-α B detección anticuerpo biotinilado en una proporción de biotina: anticuerpo de 30 fue desarrollado. Las concentraciones para anticuerpo de detección biotinilado y SBG fueron 0.3 μg/mL y 150 pM, respectivamente. Este ensayo altamente específico es capaz de detectar todos los 13 subtipos de IFN-α y Cruz no reacciona con otro tipo de IFN. Así, si bien no es posible identificar y cuantificar cada especie individual de IFN-α, todos ellos pueden ser detectadas y medición da un valor total de la concentración de IFN-α, que comprende las subclases diferentes 13.
Para explorar el posible valor diagnóstico de este nuevo ensayo, la proteína IFN-α en plasma y el suero de individuos sanos se midieron y compararon con muestras de pacientes con SLE y JDM. Como se ilustra en la figura 7, se detectaron altos niveles de la proteína IFN-α en ambas cohortes de enfermedad en comparación con controles sanos. La línea punteada indica el LDD de un convencional ELISA disponible comercialmente, que ilustran cómo este enfoque no detectaría la proteína IFN-α en estos grupos de pacientes a pesar de las asociaciones conocidas de esta citoquina con estos fenotipos. Además, IFN-α podría cuantificarse en 5 registros de magnitud, que ilustran el amplio rango dinámico del ensayo, con niveles detectables entre 1-10 fg/mL confirma el carácter altamente sensible de la prueba.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57421/57421fig7.jpg"> Figura 7: cuantificación de la proteína IFN-α en plasma y suero de paciente cohortes. Esta figura ha sido modificada de Rodero et al. 2017. plasma de controles sanos (n = 20) y pacientes que sufren de SLE (n = 72) y JDM (n = 43) se probaron en el ensayo de matriz pan-IFNα sola molécula. Análisis se realizan mediante la prueba ANOVA unidireccional (Kruskal-Wallis) y Dunn comparación entre grupos. Se representa la mediana. Línea punteada indica LOD de un referencia humana ELISA de anti-IFN-α (pg/mL 1.95 = 1950 fg/mL). <a href="/files/ftp_upload/57421/57421fig7large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Paso</td>
			<td>Consideraciones</td>
			<td>Referencia</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">1. elección de pareja anticuerpo</td>
			<td>Objetivo diferentes epítopes</td>
			<td rowspan="3">Tabla 2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Alta afinidad</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rápido Ken / lento Kapagado
</td>
		</tr>
<tr>
<td>2. orientación del par de anticuerpos</td>
			<td rowspan="3">Elegir las condiciones con el más bajo límite de detección</td>
			<td rowspan="3">Figura 1</td>
		</tr>
<tr>
<td>3. concentración de anticuerpo de captura</td>
		</tr>
<tr>
<td>4. proporción de anticuerpos biotina: Detector</td>
		</tr>
<tr>
<td>5. 2 vs. configuración de 3 pasos</td>
			<td>Escoger la condición con el cociente más alto de la señal: fondo</td>
			<td>Figura 2</td>
		</tr>
<tr>
<td>6. concentración de anticuerpo detector</td>
			<td rowspan="2">Elegir las condiciones con el más bajo límite de detección</td>
			<td rowspan="2">Figura 3</td>
		</tr>
<tr>
<td>7. concentración SBG</td>
		</tr>
<tr>
<td>8. especificidad</td>
			<td>Evaluar reactividad cruzada</td>
			<td rowspan="2">Figura 4</td>
		</tr>
<tr>
<td>9. sensibilidad</td>
			<td>Evaluar el reconocimiento de subtipos (si corresponde)</td>
		</tr>
<tr>
<td>10. reproducibilidad</td>
			<td>Evaluar la variabilidad del ensayo</td>
			<td>Figura 5</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: Resumen de pasos para el desarrollo y optimización de un análisis de la matriz de la sola molécula. Esta tabla resume los diferentes pasos necesarios para el desarrollo y optimización de un análisis de matriz de molécula única, de la elección inicial del par de anticuerpos hasta la evaluación de la reproducibilidad.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Antígeno de</td>
			<td>8H 1 (A)</td>
			<td>12H 5 (B)</td>
			<td>Sifalimumab</td>
			<td>Rontalizumab</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ1</td>
			<td>28.3</td>
			<td>51,3</td>
			<td>460</td>
			<td>22.63</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ2</td>
			<td>2563</td>
			<td>10.7</td>
			<td>9.02</td>
			<td>2.15</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ4</td>
			<td>5.11</td>
			<td>2.99</td>
			<td>35.35</td>
			<td>325.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ5</td>
			<td>2.01</td>
			<td>19.6</td>
			<td>93.29</td>
			<td>2.49</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ6</td>
			<td>64.7</td>
			<td>3.03</td>
			<td>4.97</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ7</td>
			<td>0,9</td>
			<td>0,63</td>
			<td>233.1</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ8</td>
			<td>302</td>
			<td>0,83</td>
			<td>691</td>
			<td>10.86</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ10</td>
			<td>2.54</td>
			<td>0.71</td>
			<td>43.2</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ14</td>
			<td>3224</td>
			<td>2.1</td>
			<td>14.52</td>
			<td>0,9</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ16</td>
			<td>1,83</td>
			<td>32.99</td>
			<td>59.18</td>
			<td>28.65</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ17</td>
			<td>2.21</td>
			<td>0.77</td>
			<td>890.9</td>
			<td>23.86</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ21</td>
			<td>2.78</td>
			<td>12.87</td>
			<td>1769</td>
			<td>5.8</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 2: selección de anticuerpos alfa Pan. IC50 (ng/mL) determinada mediante el elemento de respuesta interferón-estimulantes (ISRE)-ensayo de neutralización de luciferasa. Tabla muestra valores de IC50 de mAbs utilizados en análisis de matriz de molécula única para todos los subtipos de IFN-α. 10.000 células de HEK 293 MSR fueron sembradas en placas de 96 pocillos de área mitad blanco y reverso-transfected con 50 ng premezclado ISRE-Firefly luciferase reporter y construcciones de luciferasa Renilla transfección reactivos según las instrucciones del fabricante. La construcción de expresión de luciferasa sirve como control interno de la normalización. Las células fueron incubadas durante la noche en reducido suero suplementado con aminoácidos no esenciales de 0,1 mM, piruvato de sodio 1 mM, 0,5% de suero fetal bovino a 37 ° C, 5% CO2 en un ambiente humidificado. Después de la incubación durante la noche, las células fueron estimuladas por 24 h con medio que contiene mezclas de recombinante humano IFN-α con o sin mAbs anti-IFN-α o control IgG que había se incuba durante 1 h a 37 ° C. Después de 24 h de estimulación, dual luciferase reporter ensayos fueron realizados según las instrucciones del fabricante. «-» No determinado. Sifalimumab es un humano, inmunoglobulina G1 κ anticuerpo monoclonal que se une y neutraliza la mayoría de los subtipos de IFN-α; Rontalizumab es un anticuerpo monoclonal humanizado contra IFN-α. Adaptado de Meyer et al. 2016 y Rodero et al. 2017.
Complementario tabla 1: selección de la orientación del anticuerpo, captura la concentración de anticuerpos en los granos y el cociente de Biotinilación. Las dos posibles configuraciones diferentes fueron probadas, con el anti-IFN-α como anticuerpo de captura y B anti-IFN-α como detección anticuerpo (A) y vice versa (B). IFNα - 2C se utilizó como antígeno. Las concentraciones de anticuerpo de captura diferentes así como ratios de biotina: anticuerpo (B:A) también fueron probadas para ambas configuraciones. Saturación (Sat). Naranja: Valores AEB que se utilizaron para el cálculo de LOD; Estas concentraciones eran consideradas en blanco como los AEB valores permanecidos constantes. LOD se calculó como la media en blanco + 3de. <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_1.xlsx">haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Adicional cuadro 2: prueba de configuración de 3 pasos de 2 vs. Las configuraciones de paso 2 y 3 - se evaluaron con IFNα - 2c como antígeno. AEB valores así como señal/fondo raciones (SG) se muestran para ambas condiciones. <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_2.xlsx">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Adicional cuadro 3: optimización de concentración Detector y SBG. Tres diferentes concentraciones de anticuerpo detector de biotinilado (0.1, 0.3 y 0.6 μg/mL) junto con tres diferentes concentraciones de SBG (50, 150 y 250 pM) fueron evaluados. AEB valores se muestran para las nueve condiciones de prueba. Naranja: Valores AEB que se utilizaron para el cálculo de LOD; Estas concentraciones eran consideradas en blanco como los AEB valores permanecidos constantes. LOD se calculó como la media en blanco + 3de. <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_3.xlsx">haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Adicional cuadro 4: especificidad y sensibilidad de la prueba de conjunto optimizada de IFNα sola molécula. Enzima promedio por valores de granos aparecen cuando IFN-β, IFN-λ1, λ2 IFN, IFN-ω y IFN-γ proteínas recombinantes fueron probaron (A), junto con los 16 subtipos de IFN-α (B). «-» No determinado. <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_4.xlsx">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Adicional cuadro 5: reproducibilidad del optimizado IFNα sola molécula matriz análisis. Se muestran los valores promedio de la AEB para todos tres carreras independientes a una concentración de 10.000 fg/mL. «-» No determinado. Saturación (Sat). <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_5.xlsx">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Complementario tabla 6: Análisis de proteína competencia. Enzima promedio por cuentas de valores se muestran para todas las condiciones probadas. Las mediciones se realizaron por duplicado. <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_6.xlsx">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

Aquí presentamos un protocolo para describir el desarrollo y validación de un sola molécula matriz digital ensayo ELISA, que permite la detección ultrasensible de todos los subtipos de IFN-α en muestras humanas.

Desarrollo y validación de una sola molécula ultrasensible matriz Digital análisis de enzima-ligado del inmunosorbente para interferón-α humano

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre la naturaleza, la regulación y el impacto biológico de las respuestas inducidas por el interferón en diferentes entornos de enfermedades, incluida la autoinmunidad y la infección. La principal ventaja de esta técnica es su propia sensibilidad. Esta técnica tiene un gran potencial para el descubrimiento de biomarcadores para mejorar el manejo del paciente en muchas enfermedades, ya que puede cuantificar citoquinas con una sensibilidad sin precedentes.Un paso importante con este enfoque fue neutralizar las actividades relacionadas con los pacientes con sistema poliindocrina autoinmune tipo uno. Para comenzar, cargue 280 millones de perlas paramagnéticas en un tubo de microfuga, tomando nota del volumen. A continuación, gire las cuentas y coloque el tubo en un separador magnético durante un minuto.Retire y deseche la solución diluyente, aislando así las perlas. A continuación, lave las cuentas con BWB dos veces y BCB dos veces. Para cada lavado, agregue 200 microlitros y agite el tubo durante cinco segundos.A continuación, separe las perlas de la solución utilizando el separador magnético. Después de un minuto de separación, deseche el diluyente. A continuación, agregue 190 microlitros de BCB por volumen de cuentas.Luego agite el tubo brevemente, haga girar el tubo por pulso y coloque las cuentas lavadas en hielo. Para activar las perlas, combine un mililitro de BCB frío con 10 miligramos de EDC y vórtice hasta que la solución sea homogénea. Trabaje de forma rápida y segura cuando utilice EDC, debido a su inestabilidad inherente y a su solución equino.A continuación, añada 10 microlitros de EDC frío y diluido por volumen de perlas a la suspensión de perlas y vórtelas brevemente. A continuación, coloque las cuentas en una coctelera a temperatura ambiente durante 30 minutos. Para conjugar anticuerpos contra las perlas, primero el vórtice y el pulso giran las perlas activadas.A continuación, coloque las perlas en un separador magnético durante un minuto y deseche el sobrenadante BCB. A continuación, retire el tubo del imán y lave las cuentas dos veces con 200 microlitros de BCB. A continuación, el vórtice, el pulso de giro y la separación magnética de las perlas para eliminar el tampón.A continuación, añada rápidamente 200 microlitros de anticuerpo frío intercambiado por tampón a las perlas activadas. Después de convertir las perlas en vórtice en solución, coloque la suspensión en el agitador a temperatura ambiente durante dos horas a 1.000 RPM. Comience por darle un giro de pulso a la suspensión de perlas recubierta de anticuerpos y luego use la columna magnética para eliminar el tampón.A continuación, compruebe la concentración de la proteína en el tampón. Utilice un espectrofotómetro de bajo volumen. En este punto, los anticuerpos se acoplan a las perlas y cualquier valor por encima de cero significa que las perlas están saturadas de anticuerpos.Ahora, lava las cuentas con 200 microlitros de BWB, como se realizó en todos los lavados anteriores. Luego, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo y verifique la concentración de proteínas. La cuantificación de las proteínas que se liberan de las perlas permite medir el acoplamiento de anticuerpos.A continuación, vuelve a lavar las cuentas con 200 microlitros de BWB. A continuación, agregue 200 microlitros de tampón que bloquea las perlas, agite el tubo durante cinco segundos y transfiéralo al agitador a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después de 30 minutos, las cuentas se bloquearán.Luego, lávelos una vez con 200 microlitros de BWB, seguido de lavarlos dos veces con 200 microlitros de tampón diluyente de perlas para cada lavado. A continuación, almacene las perlas recubiertas y bloqueadas en 200 microlitros de tampón diluyente de perlas a cuatro grados centígrados. Esta sección del video sugiere estrategias sobre cómo ajustar las condiciones del ensayo utilizando el software del analizador de matriz de molécula única en la configuración de preparación casera.Comience probando diferentes combinaciones de perlas conjugadas de anticuerpos de captura y anticuerpos de detección de biotinilación en ambas combinaciones de anticuerpos. A continuación, pruebe las combinaciones de las tres concentraciones diferentes de anticuerpos de captura con dos proporciones de biotinilación diferentes para la detección y captura de anticuerpos y viceversa. A continuación, elija la combinación que ofrezca el nivel más bajo de detección y utilícela para los pasos posteriores.En este caso, una ración de 30 a 1 de biotina por anticuerpo da el mejor límite de detección. A continuación, compare una configuración de dos pasos con una configuración de tres pasos. Las configuraciones de tres pasos tienen tres pasos de incubación diferentes.Uno con el anticuerpo de captura, otro con el anticuerpo de detección y un tercero final para el marcaje de la enzima SBG. Las configuraciones de dos pasos combinan las incubaciones de captura y detección. Ejecute el analizador de matriz de molécula única utilizando las concentraciones y raciones de anticuerpos de captura y detector seleccionadas en las configuraciones de dos y tres pasos, preconfiguradas en el analizador, siguiendo las instrucciones del fabricante.A continuación, elija la configuración que permita la máxima sensibilidad y guárdela para futuros pasos. En este caso, la configuración de dos pasos proporciona una sensibilidad ligeramente superior en cada punto de prueba. A continuación, optimice las concentraciones del anticuerpo detector y el SBG.Pruebe tres concentraciones diferentes de anticuerpo detector con tres concentraciones diferentes de SBG. Elija las concentraciones que den la mayor sensibilidad y guárdelas para pasos futuros. En este caso, 0,3 microgramos por mililitro de anticuerpo y 150 pica molar SBG tienen el nivel óptimo de detección con niveles de fondo bajos con amplitud media fortuita.Para conocer los pasos de optimización adicionales, consulte el protocolo de texto. Allí hay procedimientos para optimizar la especificidad y la reproducibilidad del ensayo y un ensayo para la competencia de proteínas. Utilizando un ensayo optimizado para detectar 13 subclases de interferón alfa, se analizaron plasma y suero en pacientes con LES, pacientes con DMJ y controles sanos.Se detectaron niveles altos de proteína interferón alfa en ambas cohortes de enfermedades. La línea punteada indica el nivel de detección de un Eliza convencional disponible comercialmente que no detectaría la proteína interferón alfa en estos grupos de pacientes, a pesar del papel conocido de esta citocina en estas enfermedades. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo desarrollar y validar un ensayo de matriz de moléculas individuales para el análisis de su elección.Al intentar este procedimiento, es importante recordar que durante la elección celular de los anticuerpos es. Desde su desarrollo, este ensayo ha permitido una mejor caracterización del papel del interferón-alfa en una diversidad de enfermedades autoinmunes e infecciones. Este ensayo también ha servido para monitorizar las respuestas a nuevas terapias e identificar los actores celulares responsables de ciertos trastornos autoinmunes.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

ampliPHOX tecnología de detección colorimétrica se presenta como una alternativa económica a la detección por fluorescencia de microarrays. Sobre la base de fotopolimerización, ampliPHOX produce manchas de polímero sólido visible a simple vista en tan sólo unos minutos. Resultados son imágenes e interpretado de forma automática con un paquete de software simple pero poderosa.

ampliPHOX colorimétrico de detección de un microarray de ADN para la influenza

Cuantitativo, de alto rendimiento, en tiempo real, y sin etiquetas de detección biomolecular (ADN, proteínas, etc) sobre...

Biomoleculares de detección utilizando el sensor de reflectancia de imágenes interferométricas (IRIS)

Este método describe el uso de infrarrojos sistema colorante formación de imágenes basada para la detección de H1N1 en bronquioalveolar lavado (BAL) de líquidos de los ratones infectados en una alta sensibilidad. Esta metodología se puede realizar en un 96 - o 384-así placa, requiere &lt;10 l de volumen material de prueba y tiene el potencial para el cribado simultáneo de múltiples patógenos.

De alto rendimiento Método de detección de virus de la influenza

Caracterizar los epítopos de células T de patógenos que causan infecciones localizadas, como el virus del papiloma humano, es un desafío debido al número limitado de células T en circulación. Se describe un método mediante el cual se aislaron y caracterizaron células T raras a partir de un número muy pequeño de células.

El uso de interferón-γ enzimo-inmunoensayo para la Caracterización de Nuevos epítopos de células T del virus del papiloma humano

Gracias a la tecnología Luminex Corporation microesfera xMAP, hemos desarrollado el inmunoanálisis fluorométrico multiplexada (MFIA) para la vigilancia serológica de las diversas especies de animales de laboratorio. El MFIA es un microarray de suspensión donde se covalentemente con el antígeno, tejido de control o inmunoglobulinas vinculado a microesferas de poliestireno con código de color. El método de prueba MFIA, así como diversos temas de solución de problemas se aborda.

Multiplexado inmunoensayo fluorométrico Metodología de prueba y solución de problemas

Este video muestra un método de imagen para visualizar in situ la secreción de interferón-gamma (IFN-γ) en el bazo del ratón. Después de la infección bacteriana y la inducción de la acumulación de IFN-γ dentro de las células T y las células asesinas naturales, el bazo se extrae del ratón. Al obtener secciones de tejido, se realiza una inmunotinción para visualizar el IFN-γ dentro de las células.

Ensayo para la identificación de la secreción de interferón gamma en órganos linfoides murinos

Este video muestra el ensayo de fosfatasa alcalina embrionaria secretada utilizando células reporteras de interferón-α/β HEK-Blue para cuantificar los interferones de tipo I (IFN) liberados después de la estimulación de las células dendríticas plasmocitoides por las células T CD4+ infectadas por el VIH-1.

Cuantificación de interferones bioactivos de tipo I mediante un ensayo reportero de fosfatasa alcalina embrionaria secretada

Este protocolo describe un ensayo qRT-PCR de alto rendimiento para el análisis de firmas de expresión de IFN de tipo I y III. El ensayo discrimina las diferencias de pares de bases individuales entre las transcripciones altamente similares de estos genes. A través del ensamblaje de lotes y el pipeteo robótico, los ensayos son consistentes y reproducibles.

De Alto Rendimiento Cuantitativa en tiempo real RT-PCR ensayo para determinar los perfiles de expresión de los tipos I y III de interferón subtipos

Utilizando una estrategia de microarrays de glicanos impresos, se miniaturizó un ensayo convencional de placa de 96 pocillos para analizar la avidez de hemaglutinina del virus de la influenza A y la especificidad de los receptores que contienen ácido siálico.

Un ensayo de microarrays miniaturizada glicanos para la evaluación de avidez y especificidad del virus de la gripe A Hemaglutininas

Corriente de multiplexado de diagnóstico para detectar los Zika, chikungunya y dengue virus requieren preparación compleja y costosa instrumentación y son difíciles de usar en entornos de bajos recursos. Se muestra un diagnóstico que utiliza amplificación isotérmica con sondas desplazable filamento blanco específico para detectar y diferenciar estos virus con alta sensibilidad y especificidad.

La amplificación isotérmica multiplexada basado en plataforma de diagnóstico para detectar Zika, Chikungunya y Dengue 1

Este informe describe un protocolo automatizado para ensayos de inmunofluorescencia múltiple (mIF) en un tintor de portaobjetos automatizado. Demuestra la alta reproducibilidad de la proteómica espacial en autotinciones tisulares estándar de alto rendimiento y generadores de imágenes de fluorescencia de portaobjetos completos, lo que es ideal para ensayos mIF personalizados en un gran número de portaobjetos de tejido en investigación traslacional.

Ensayos de inmunofluorescencia multiplex automatizados de alto rendimiento para la investigación traslacional

Aprende a desarrollar y validar un ensayo digital ELISA de matriz de molécula única para detectar subtipos de interferón-alfa humano con sensibilidad ultrasensible. Este método permite cuantificar citoquinas en muestras de plasma y suero para el descubrimiento de biomarcadores en enfermedades autoinmunes.

Desarrollo y validación de una sola molécula ultrasensible matriz Digital análisis de enzima-ligado del inmunosorbente para interferón-α humano (Video) | JoVE Journal

Desarrollo y validación de una sola molécula ultrasensible matriz Digital análisis de enzima-ligado del inmunosorbente para interferón-α humano

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