Detección de proteínas priónicas anormales en el tejido cerebral mediante inmunohistoquímica

Tome una diapositiva con una sección fija del cerebro de un mamífero que exhibe agregados de proteínas priónicas mal plegadas.

Tratar la sección con ácido fórmico para reducir la infectividad de los agregados priónicos.

Tratar con un tampón ácido dentro de una cámara de presión hidratada. Un calor alto y un pH ácido rompen la fijación de proteínas reticuladas, desenmascarando los epítopos antigénicos.

Sumergir en peróxido de hidrógeno para inactivar la peroxidasa endógena, evitando manchas de fondo no deseadas.

Coloque el portaobjetos en una placa de cubierta y agregue un tampón para mantener la hidratación de los tejidos.

Introducir una solución de bloqueo, evitando la unión de anticuerpos no específicos.

Agregue un anticuerpo primario específico a los agregados de priones.

Retire las moléculas de anticuerpos no unidas. Introducir un anticuerpo secundario biotinilado que se une al anticuerpo primario.

Retire las moléculas de anticuerpos no unidas. Agregue una enzima peroxidasa biotinilada complejada con avidina que se une a la biotina en el anticuerpo secundario.

Agregue un sustrato cromogénico, que la peroxidasa oxida en un producto coloreado.

Con un microscopio, observe los agregados teñidos.

Sumerja cuidadosamente las secciones de tejido en ácido fórmico al 98% a temperatura ambiente durante 30 minutos. Enjuague las secciones con agua del grifo durante 5 minutos, luego enjuague dos veces con agua destilada. Use un recipiente de tinción de acero inoxidable en la cámara de presión lleno de 500 mililitros de agua destilada para pretratar el tampón de citrato de 10 milimolares a 98 grados Celsius durante 20 minutos.

Para fines de control de calidad, coloque una sección de cinta indicadora adhesiva de autoclave en la canasta para controlar la temperatura y la presión. Una vez que la alarma indique que el equipo ha alcanzado el tiempo y la temperatura del programa, sumerja la canasta con toboganes. A continuación, inicie el programa en la cámara de presión para establecer el punto dos y registre la presión inicial y final de este programa.

Para la inactivación de la peroxidasa endógena, sumerja la cesta de portaobjetos que contiene las secciones de muestra en un baño de peróxido de hidrógeno al 3% en metanol durante 30 minutos. Enjuague las secciones con agua corriente durante 5 minutos. Después de drenar, sumerja las secciones en solución salina tamponada con tris durante 5 minutos más. Para la inmunodetección, coloque cada portaobjetos en un soporte de placa de cubierta disponible comercialmente prehumedecido con solución salina tamponada con Tris.

Con el lado del tejido hacia el soporte y los bordes deslizantes coincidiendo con los dos puntos inferiores del soporte, asegúrese de evitar burbujas de aire. Sostenga el conjunto del soporte deslizante entre el pulgar y el índice. Mantenga un dedo en la parte superior del portaobjetos de muestra y el otro en la parte inferior del soporte. Luego coloque el ensamblaje en la galería del sistema.

Para asegurarse de que el juego esté bien ensamblado, llene el pocillo entre el portamuestras y el soporte con solución salina tamponada con tris, sin desbordarlo. A partir de este punto, asegúrese de que se deben retener aproximadamente 80 microlitros de solución salina tamponada con Tris entre el soporte y el portaobjetos. No permita que las secciones se sequen.

Disminuya la tinción de fondo antes del tratamiento con el anticuerpo primario preincubando las muestras de portaobjetos durante 30 minutos con suero normal al 20% de la misma especie que el huésped del anticuerpo secundario en solución salina tamponada con Tris. Sin lavar las secciones, aplique 200 microlitros de la solución de anticuerpos primarios directamente en cada pocillo del juego de portaobjetos e incube durante 60 minutos a temperatura ambiente.

Para lavar las secciones, llene los pocillos con solución salina tamponada con tris y espere 5 minutos. Repita el lavado dos veces. A continuación, diluya el anticuerpo secundario biotinilado a una concentración de 1 a 200 en solución salina tamponada con tris con suero de caballo al 10%.

Reparar el volumen requerido, dependiendo del número de secciones a tratar. Aplique 200 microlitros de solución de anticuerpos secundarios a cada pocillo del juego de portaobjetos. Después de 30 minutos de incubación a temperatura ambiente, repita el lavado con solución salina tamponada con Tris.

Para la incubación con peroxidasa compleja avidina-biotina, prepare el reactivo 30 minutos antes de su uso. y aplique 200 microlitros de la solución en cada pocillo del soporte de la placa deslizante. Una vez hecho esto, incube el soporte de la placa durante 30 minutos a temperatura ambiente.