Detección cuantitativa multiplexada de bacterias mediante microesferas magnéticas marcadas con colorantes

Tome una placa de ensayo que contenga una mezcla de microesferas magnéticas de poliestireno teñidas internamente con fluoróforos espectralmente diferentes.

Cada conjunto de microesferas está acoplado covalentemente a distintos anticuerpos de captura específicos de bacterias patógenas.

Agregue una mezcla bacteriana patógena muerta por calor. Incubar.

Los anticuerpos de captura se unen a los antígenos bacterianos diana, formando complejos microesfera-bacteria.

Utilice un separador magnético para sedimentar complejos. Deseche las bacterias no unidas y lave con tampón.

Agregue anticuerpos de detección tampón y biotinilados, que se unen específicamente a las bacterias unidas a microesferas.

Separe magnéticamente los complejos y lave con tampón.

Vuelva a suspender los complejos en el búfer. Moléculas reporteras de pipetas que comprenden estreptavidina acoplada a fluoróforos, que se unen a los anticuerpos de detección biotinilados.

Separe y lave magnéticamente los complejos. Vuelva a suspender en el búfer.

Durante el análisis basado en flujo, el primer láser excita los fluoróforos internos de la microesfera, generando firmas espectrales únicas e identificando conjuntos de microesferas únicos.

El segundo láser excita los reporteros fluoróforos unidos a las bacterias en microesferas, cuantificando las bacterias en varios conjuntos de microesferas, lo que permite la detección bacteriana cuantitativa multiplexada.

Para la captura de muestras, comience agregando cincuenta microlitros de microesferas o perlas conjugadas para capturar anticuerpos en una placa de 96 pocillos. Luego, agregue cincuenta microlitros de la bacteria patógena seguidos de cincuenta microlitros de PBS-TBN en los pozos de fondo.

Cubra la placa con un sello de placa de aluminio e incube en un agitador de placas a ochocientas rpm durante una hora.

A continuación, coloque la placa en el separador magnético durante 1 minuto para separar las perlas. Evacue la solución restante, manteniendo la placa en el separador magnético de placas. Luego, golpee para secar sobre toallas de papel de laboratorio tres o cuatro veces. Lave bien los pocillos con PBS-TBN dos veces.

Para la detección de muestras, agregue cincuenta microlitros de tampón de ensayo seguidos de cincuenta microlitros de anticuerpo de detección biotinilado a una concentración de cuatro microgramos por mililitro en los pocillos.

Incube la placa en la oscuridad durante una hora para permitir una interacción eficiente entre las bacterias y los anticuerpos de detección. Posteriormente, separe las perlas con el separador magnético y lave las perlas con PBS-TBN, como se demostró anteriormente.

Vuelva a suspender las perlas en cincuenta microlitros de tampón de ensayo y agregue cincuenta microlitros de estreptavidina-R-ficoeritrina o SAPE, una molécula indicadora fluorescente. Cubra el plato con un sello de placa de aluminio e incube en el agitador de platos durante 30 minutos.

Una vez lavados los pocillos, vuelva a suspender las perlas en 100 microlitros de PBS-TBN y cargue la placa en el analizador basado en flujo.

Registre las lecturas utilizando el software apropiado. Los valores de intensidad de fluorescencia mediana neta para cada organismo se pueden evaluar a través de una curva estándar para determinar la carga bacteriana presente en la muestra.